利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纤维素

摘要

在此，我们介绍一种用于受损血管重建应用的细菌纤维素（BNC）磁性化制备方案。该BNC由 G. xylinus 菌株。另一方面，BNC 的磁化是通过 原位 Fe沉淀²⁺ 和 Fe³⁺ BNC 网格内部的亚铁离子。

摘要

本研究中，由细菌产生的细菌纳米纤维素（BNC） Gluconacetobacter xylinus 合成并浸渍 原位 使用氧化铁纳米颗粒（IONP）（Fe₃O₄）以制备磁性细菌纳米纤维素（MBNC）。MBNC的合成是一个精确且经过专门设计的多步过程。简而言之，细菌纳米纤维素（BNC）膜由保存的 G. xylinus 根据我们对菌株大小和形态的实验要求进行筛选。六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）溶液₃·6H₂O) 和四水合氯化亚铁（FeCl₂·4H₂O）以2:1的摩尔比配制，并用脱氧高纯水稀释。随后将BNC薄片引入含有反应物的容器中。该混合物在硅油浴中于80 °C下搅拌加热，然后逐滴加入14%的氢氧化铵，使亚铁离子在BNC网络结构中沉淀。此步骤可实现 原位 四氧化三铁纳米颗粒（Fe₃O₄在细菌纳米纤维素（BNC）网络内部引入离子纳米颗粒（IONP），以赋予BNC薄膜磁性。采用毒理学检测方法评估BNC-IONP薄膜的生物相容性。使用聚乙二醇（PEG）包覆IONP，以提高其生物相容性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，IONP主要位于BNC基质的纤维交织间隙中，但部分也分布于BNC带状结构上。在磁性细菌纳米纤维素（MBNC）上进行的磁力显微镜测量检测到具有高强度和弱强度磁场的磁畴存在，证实了MBNC薄膜的磁性特征。本研究获得的杨氏模量值与先前报道的多种血管数值具有较好的一致性。

引言

细菌纳米纤维素（BNC）由Acetobacter xylinum菌株合成，该菌株也称为Gluconacetobacter xylinus，在静止培养期间于气液界面以薄膜或菌膜的形式沉积。这些BNC菌膜的形状与培养容器的形状一致，其厚度取决于培养天数。A. xylinus利用培养基中的葡萄糖，通过聚合及随后的结晶过程合成纤维素微纤丝。葡萄糖残基的聚合发生在细菌细胞的胞外膜上，葡聚糖链从细胞包膜上分布的单个孔道中被挤出。纤维素微纤丝的结晶发生在胞外空间，通过范德华力形成葡聚糖链片层，再通过氢键作用堆叠成片层结构¹。

将磁性纳米颗粒整合到BNC基质中后，可通过外加磁场轻松操控，从而增加引导和限制含有磁性纳米颗粒的平滑肌细胞（SMCs）在动脉壁损伤部位定向聚集所需的力。该策略可防止SMCs进入其他组织，并抵抗血流施加的力，使细胞稳定停留在目标位置。已有研究表明，SMCs在血管的弹性功能中发挥重要作用，这些细胞主要位于中膜（tunica media），并形成丰富的细胞层²。

MBNC的合成方法是将BNC膜浸入并搅拌于氯化铁六水合物和氯化亚铁四水合物的溶液中，温度保持在80 °C。随后加入氢氧化铵，使铁氧化物纳米颗粒在BNC网络结构内部生成。加入氢氧化铵后，溶液颜色由橙色变为黑色。IONP沿BNC纤维束聚集分布，呈非均匀分布状态。

方案

1. 细菌纳米纤维素（BNC）的制备

注意：除非另有说明，所有步骤均需在无菌条件下进行。

1. 准备培养基。
   1. 将25 g酵母提取物、15 g蛋白胨、125.0 g甘露醇与500 ml高纯度水混合，配制500 ml液体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min，于4 °C保存。
   2. 将15 g琼脂加入5.0 g酵母提取物、3.0 g蛋白胨、25.0 g甘露醇和100 ml高纯度水中，配制100 ml半固体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min。灭菌后，将5 ml培养基混合物倒入90 mm × 16 mm的塑料培养皿中。置于4 °C使溶液凝胶化，并在此温度下储存备用。
2. 复水 G. xylinus 按照制造商说明，通过加入1 ml液体培养基并用移液器反复吹打，使冻干安瓿管中保存的菌株复苏。
3. 使用接种环将少量细菌悬液以小液滴形式接种于含有半固体培养基的培养皿中。通过从培养皿边缘向中心以“之”字形移动接种环，确保接种物覆盖整个培养皿表面。
4. 将培养皿置于26 °C培养箱中孵育72小时，无需CO₂孵育期结束后，可见微小的白色菌落。若菌落未立即使用，可用封口膜密封培养皿盖后倒置存放于4 °C。菌落可按此方式保存长达6个月。
5. 将步骤（1.1.1）中制备的液体培养基每孔2 ml转移至....

结果

G. xylinus 的培养周期总共为 9 天，但菌膜开始形成的时间较早，约 2 天后即已明显可见。细菌纤维素（BNC）的宏观形貌如图 1所示，其形状与培养皿中培养的菌落形态相似。图 2 描述了 BNC-IONP 菌膜的制备过程，概括了上述实验方案中的主要步骤以及各主要组分的组装方式。

SEM图像用于解析BNC纤维的微观结构、形貌及空间分布图3）以及离子纳米颗粒在功能化细菌纳米纤维素中的分布（图4）。BNC由细长的带状结构（直径约50 nm）构成，这些带状结构相互连接形成贯穿整个网络的开放孔隙，且无特定排列模式。IONP优先分布于纤维交错形成的孔隙之间，聚集成尺寸为100 nm或更大的簇状结构，同时也有单个IONP结合在带状结构上。与BNC相比，MBNC的纤维结构较为疏松，这可能是由于IONP促使BN.......

讨论

通过改变静态培养过程中的培养时间以及培养容器的尺寸，可轻松调控细菌纤维素（BNC）膜的厚度和大小。通过调节静态培养中的氧气比例，可以改变BNC的微观特性（如孔隙率）。较高的氧气浓度可产生机械强度更高的BNC¹¹。A. Bodin 及其同事通过在 G. xylinus 发酵过程中将氧气比例从大气氧浓度调整至100%氧气，制备出了爆破压力高达880 mm Hg的BNC管状结构¹²。类似地，也可通过在发酵过程中引入致孔剂（如石蜡微球）来调控BNC的孔隙率。此时，所形成的孔隙率及孔间连通性将取决于致孔剂的粒径大小¹³。

BNC 的多孔网络结构使其能够与纳米颗粒进行功能化结合， 例如，用于药物递送载体。在本研究中，我们通过合成并生长IONP，对BNC进行了功能化修饰 原位 将纳米颗粒引入BNC膜中，以在基于BNC的支架中实施磁性方案，实现细胞的快速募集与黏附。纳米力学测试表明，BNC的纳米尺度响应与血管相似¹⁴ 具有极低的杨氏模量，E_BNC<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
琼脂	西格玛奥德里奇	A1296-500G
D-甘露醇 Bioxtra	西格玛奥德里奇	M9546-250G
酵母提取物	BD 生物科学	212750
细菌用蛋白胨	西格玛奥德里奇	P0556
氢氧化钠，50% 水溶液	西格玛奥德里奇	158127-100G
六水合三氯化铁	西格玛奥德里奇	236489-100G
氢氧化铵	Macron 精细化学品	6665-46
聚乙二醇，平均分子量 400	西格玛奥德里奇	202398-250G
四水合二氯化铁	西格玛奥德里奇	44939-250G
一次性培养皿	西格玛奥德里奇	BR452000
一次性接种环	费舍尔科技	22-363-604
无水硫酸钙	W.A. Hammond Drierite	13001
高真空润滑脂	西格玛奥德里奇	Z273554-1EA
带 90° 钝端的实验室移液针	西格玛奥德里奇	CAD7937-12EA
pH 试纸	西格玛奥德里奇	P4786-100EA
圆底三颈角式蒸馏烧瓶	西格玛奥德里奇	CLS4965250
油浴用硅油	西格玛奥德里奇	85409-250ML
干燥管	Chemglass	CG-1295-01
隔膜塞，套筒型	Chemglass	CG-3022-98
磁力搅拌子	Chemglass	CG-2001-05
冷凝器	Chemglass	CG-1218-01
温度控制器	BriskHeat	SDC120JC-A
搅拌加热板	费舍尔科技	11-100-49SH
彗星试验试剂盒	Trevigen	4250-050-K
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