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方法文章

利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纤维素

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DOI：

10.3791/52951

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2016年5月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于受损血管重建应用的细菌纤维素（BNC）磁性化制备方案。该BNC由 G. xylinus 菌株。另一方面，BNC 的磁化是通过 原位 Fe沉淀2+ 和 Fe3+ BNC 网格内部的亚铁离子。

摘要

本研究中，由细菌产生的细菌纳米纤维素（BNC） Gluconacetobacter xylinus 合成并浸渍 原位 使用氧化铁纳米颗粒（IONP）（Fe3O4）以制备磁性细菌纳米纤维素（MBNC）。MBNC的合成是一个精确且经过专门设计的多步过程。简而言之，细菌纳米纤维素（BNC）膜由保存的 G. xylinus 根据我们对菌株大小和形态的实验要求进行筛选。六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）溶液3·6H2O) 和四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）以2:1的摩尔比配制，并用脱氧高纯水稀释。随后将BNC薄片引入含有反应物的容器中。该混合物在硅油浴中于80 °C下搅拌加热，然后逐滴加入14%的氢氧化铵，使亚铁离子在BNC网络结构中沉淀。此步骤可实现 原位 四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4在细菌纳米纤维素（BNC）网络内部引入离子纳米颗粒（IONP），以赋予BNC薄膜磁性。采用毒理学检测方法评估BNC-IONP薄膜的生物相容性。使用聚乙二醇（PEG）包覆IONP，以提高其生物相容性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，IONP主要位于BNC基质的纤维交织间隙中，但部分也分布于BNC带状结构上。在磁性细菌纳米纤维素（MBNC）上进行的磁力显微镜测量检测到具有高强度和弱强度磁场的磁畴存在，证实了MBNC薄膜的磁性特征。本研究获得的杨氏模量值与先前报道的多种血管数值具有较好的一致性。

引言

细菌纳米纤维素（BNC）由Acetobacter xylinum菌株合成，该菌株也称为Gluconacetobacter xylinus，在静止培养期间于气液界面以薄膜或菌膜的形式沉积。这些BNC菌膜的形状与培养容器的形状一致，其厚度取决于培养天数。A. xylinus利用培养基中的葡萄糖，通过聚合及随后的结晶过程合成纤维素微纤丝。葡萄糖残基的聚合发生在细菌细胞的胞外膜上，葡聚糖链从细胞包膜上分布的单个孔道中被挤出。纤维素微纤丝的结晶发生在胞外空间，通过范德华力形成葡聚糖链片层，再通过氢键作用堆叠成片层结构1。

将磁性纳米颗粒整合到BNC基质中后，可通过外加磁场轻松操控，从而增加引导和限制含有磁性纳米颗粒的平滑肌细胞（SMCs）在动脉壁损伤部位定向聚集所需的力。该策略可防止SMCs进入其他组织，并抵抗血流施加的力，使细胞稳定停留在目标位置。已有研究表明，SMCs在血管的弹性功能中发挥重要作用，这些细胞主要位于中膜（tunica media），并形成丰富的细胞层2。

MBNC的合成方法是将BNC膜浸入并搅拌于氯化铁六水合物和氯化亚铁四水合物的溶液中，温度保持在80 °C。随后加入氢氧化铵，使铁氧化物纳米颗粒在BNC网络结构内部生成。加入氢氧化铵后，溶液颜色由橙色变为黑色。IONP沿BNC纤维束聚集分布，呈非均匀分布状态。

本方案聚焦于一种细菌纳米纤维素-磁性纳米颗粒薄膜的设计，我们将其命名为磁性细菌纳米纤维素（MBNC），旨在作为缺失、受损或受伤的小直径血管的替代材料。H. S. Barud 及其同事近期发表了一项类似研究，通过将细菌纳米纤维素（BNC）薄膜与聚乙二醇（PEG）中的稳定水相分散液及超顺磁性氧化铁纳米颗粒混合，制备出一种基于BNC的柔性磁性纸张。3在此，我们介绍细菌纤维素的制备及其浸渍方法 原位 使用磁性纳米颗粒。采用基于单链DNA断裂检测的细胞毒性实验来评估BNC和MBNC薄膜的生物相容性。

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方案

1. 细菌纳米纤维素（BNC）的制备

注意：除非另有说明，所有步骤均需在无菌条件下进行。

  1. 准备培养基。
    1. 将25 g酵母提取物、15 g蛋白胨、125.0 g甘露醇与500 ml高纯度水混合，配制500 ml液体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min，于4 °C保存。
    2. 将15 g琼脂加入5.0 g酵母提取物、3.0 g蛋白胨、25.0 g甘露醇和100 ml高纯度水中，配制100 ml半固体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min。灭菌后，将5 ml培养基混合物倒入90 mm × 16 mm的塑料培养皿中。置于4 °C使溶液凝胶化，并在此温度下储存备用。
  2. 复水 G. xylinus 按照制造商说明，通过加入1 ml液体培养基并用移液器反复吹打，使冻干安瓿管中保存的菌株复苏。
  3. 使用接种环将少量细菌悬液以小液滴形式接种于含有半固体培养基的培养皿中。通过从培养皿边缘向中心以“之”字形移动接种环，确保接种物覆盖整个培养皿表面。
  4. 将培养皿置于26 °C培养箱中孵育72小时，无需CO2孵育期结束后，可见微小的白色菌落。若菌落未立即使用，可用封口膜密封培养皿盖后倒置存放于4 °C。菌落可按此方式保存长达6个月。
  5. 将步骤（1.1.1）中制备的液体培养基每孔2 ml转移至24孔细胞培养板的各孔中。用接种针从步骤（1.3）中已接种的培养皿中挑取两个菌落，放入细胞培养板的第一孔中。对剩余的23个孔重复相同操作。
  6. 在30 °C下孵育细胞培养板7天。这将产生总共24个细菌纤维素（BNC）膜片，直径为16 mm，厚度约为2-3 mm，如图所示 图1.
    注意：在培养期间的任何时间点都不得扰动细菌培养物，例如晃动培养板。在培养期间， G. xylinus 向空气-液体界面挤出葡萄糖吡喃糖分子，形成聚合的结晶网状结构，在静态培养条件下其形状和大小与培养瓶一致。这种聚合物基质被称为细菌纳米纤维素（BNC），在培养结束时清晰可见。
  7. 从培养基中收集BNC菌膜，并将其置于200 ml含1% NaOH溶液中，在50 °C下灭菌1小时，以彻底去除所有残留物 G. xylinus可选地，使用磁力搅拌子和搅拌板以300 rpm转速搅拌该溶液。弃去氢氧化钠溶液，加入200 ml新配制的1% NaOH溶液。重复此步骤一次或直至溶液中的BNC菌膜呈现半透明状。
  8. 用清水冲洗BNC薄膜三次，并将其置于高纯水中室温保存。确保BNC薄膜完全浸没在水中，任何时候均不得使其干燥。
  9. 在121 °C下高压灭菌BNC膜20分钟。
    注意：一个 体内 大鼠皮下研究由Märtson及其同事开展，结果显示细菌纤维素（BNC）在植入60周后未出现降解迹象。事实上，BNC可被微生物和真菌酶自然降解，而此类酶在哺乳动物体内并不存在。另一方面，BNC的生物降解性可能源于削弱微原纤网络的机械、化学和生物过程 体内4.

2. 聚合物包覆氧化铁纳米颗粒的合成及其在细菌纤维素膜中的沉积

  1. 向1,000 ml高纯水中通入氮气鼓泡，以去除水中溶解的氧气并用氮气取代。
  2. 使用三口圆底烧瓶制备氯化铁六水合物（FeCl₃·6H₂O）与醋酸钠（NaOAc）摩尔比为2:1的溶液。3·6H2O) 和四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O) 用脱氧的高纯水稀释。例如，使用 5.4 g FeCl3·6H2O 和 1.98 g FeCl2·4H2O，溶于10 ml脱氧高纯水中。如果该溶液过于黏稠而难以搅拌，可使用0.54 g FeCl3·6H2O 和 0.198 g FeCl2·4H2O₂ 在 20 ml 脱氧高纯水中。
    注意：减少 FeCl 的暴露时间2·4H2尽可能快速称量该化合物，以防止其从 O 氧化为空气。一旦将其加入三颈圆底烧瓶，立即用隔膜塞密封三颈圆底烧瓶，直至其与氮气供应系统及冷凝管连接。
  3. 利用反应容器的两个瓶口，将氮气源连接至插有针头的隔膜塞，并将隔膜塞固定在容器的两个瓶口上，以实现氮气的持续通入和排出。
  4. 将此前在步骤1.5中制备好的1片BNC薄膜（直径15.6 mm，厚度2–3 mm）放入装有反应物的容器中，确保样品完全浸没于液体中。
  5. 将容器的剩余管口连接至冷凝管。此外，在冷凝管顶端安装一个装有无水硫酸钙的干燥管。向冷凝管中通入冷却水。
  6. 用真空润滑脂密封所有玻璃接头。
  7. 将溶液置于硅油浴中，使用搅拌加热板加热至 80 °C，并在此温度下保持至步骤 2.10。加入一小段磁力搅拌子，以 350 rpm 的速度搅拌反应物 5 分钟。确保 BNC 被亚铁溶液充分浸渍，且反应物完全溶解。持续搅拌混合物直至实验结束。
    注意：使用温度计检测硅油的温度，应稳定在 80 °C。
  8. 将搅拌速度提高至700 rpm，并在5分钟时间内逐滴加入5 ml氢氧化铵（NH₄OH）。4使用已插入隔膜塞中的移液针，向10 ml的亚铁溶液中加入氢氧化铵（OH, 14%）。加入氢氧化铵后，溶液颜色由黄色/橙色变为黑色。
  9. 继续在 80 °C 下搅拌溶液 5 分钟。避免高速搅拌，以保持样品的完整性。高速搅拌， 即，高于1,000 rpm 可能会破坏样品。
  10. 将搅拌加热板的温控底座调至使溶液温度降至 30 °C，并继续搅拌 5 分钟。随后关闭加热板。此时，IONP 已被整合至 BNC 网格中。
  11. 将混合物冷却至室温，使用强永磁体分离磁性纳米颗粒（MNP）和细菌纳米纤维素（BNC）。例如，1 特斯拉）。为此，将混合物转移至容器烧瓶中，然后在保持磁铁靠近容器的同时，固定磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC），随后倾倒上清液。
    注意：操作强磁铁时需谨慎，因使用不当可能造成伤害。在步骤（2.12）–（2.14）和（2.16）中，应使用此前在步骤（2.1）中制备的脱氧高纯水，以防止颗粒氧化。
  12. 将磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纤维素（BNC）重悬于100 ml水中。轻轻振荡溶液，以去除未牢固结合到BNC中的所有MNPs。使用磁铁固定MNPs和BNC，再次倾去上清液。
  13. 用去离子水反复洗涤磁性纳米颗粒（MNPs）和细菌纳米纤维素（BNC）数次，直至上清液达到中性pH（pH~7），通过比色试纸测定确认。
  14. 使用镊子将磁性功能化的细菌纳米纤维素（MBNC）从磁性纳米颗粒（MNPs）中分离，并用清水反复冲洗 MBNC，直至冲洗液澄清。
  15. 通过将 MBNC 置于紫外光（110-280 nm）下过夜暴露，对 MBNC 进行灭菌。
  16. 将500 ml去氧高纯水在120 °C下高压灭菌20分钟，并将MBNC储存于20 ml该水中。
  17. 无菌条件下，将样品浸入1% PEG中，室温（37 °C）下搅拌2小时。该步骤可提高沉积在BNC中的氧化铁纳米颗粒（特别是暴露于表面的纳米颗粒）的生物相容性和稳定性。5-7PEG 涂层将分布在 MBNC 三维网络上。
    注意：裸露的IONP由于具有高化学活性，在空气中容易被氧化8尽管聚乙二醇（PEG）被认为是一种非生物可降解材料，但其化学稳定性取决于所处的生物学环境，例如水分含量、pH值、温度、酶的存在、活性氧物种、活性氮物种等因素。9.

3. BNC和MBNC菌膜的表征

  1. 力学性能
    1. 使用 Berkovich 压头进行常规的加载-卸载纳米压痕测试。Berkovich 金刚石压头的半径为 20 nm。
    2. 使用熔融石英和钨在室温（RT）下校准接触面积与压痕深度之间的函数关系。测试过程中，用胶水将样品固定在压痕仪上，压头沿样品厚度方向接近样品表面。
    3. 在样品表面随机选择压痕位置，保持相邻两个压痕之间的间距为 200–300 mm。
    4. 以分级加载方式对样品施加载荷，并记录压头相应的位移。通过分析载荷-深度曲线确定杨氏模量。
    5. 在去离子水（DI 水）环境中对样品进行纳米压痕测试，加载速率设定为 0.0001 mN/sec 至 0.005 mN/sec，峰值载荷范围为 0.01 mN 至 0.60 mN。
    6. 使用液体池装置，使样品保持在液体环境中。这种专用于流体环境下纳米力学表征的独特设置，可有效模拟细菌纳米纤维素（BNC）和磁性细菌纳米纤维素（MBNC）膜在实际生物力学环境中的功能。
  2. 扫描电镜结构表征
    1. 通过扫描电子显微镜（SEM）对纳米纤维素纤维结构进行表征。
    2. 将样品在 -80 °C 下冷冻干燥 24 小时，随后固定于 SEM 样品台，溅射镀 Au-Pd 膜 10 秒，然后进行 SEM 分析。
    3. 在 5 kV 加速电压下，以 22,000X 和 60,000X 的放大倍数采集图像。
  3. 磁畴分析
    1. 将 MBNC 薄膜在室温（RT）下完全干燥后，暴露于 1 特斯拉（Tesla）的永磁体中 5 分钟。
    2. 立即按照制造商的操作规程，使用生物原子力显微镜（bio-AFM）进行磁力测量。
    3. 每次测量时，先获取样品表面形貌图像，再在第二次扫描中采集磁畴信息。两项测量均在 bio-AFM 的非接触模式下完成。
    4. 采用 Quantum Design 公司的物理性能测量系统（PPMS）中的振动样品磁强计（VSM）在室温 （300 K）下对纳米颗粒进行磁学表征，施加磁场范围为 -10,000 至 10,000 Oe。
  4. 细胞相容性
    1. 将人主动脉平滑肌细胞（HASMC）以 1.0×103 个细胞/cm2 的密度接种于 6 孔组织培养板中，并在测试样品（BNC 和 MBNC 薄膜，直径均为 15.6 mm）存在下培养 24 小时。
    2. 分别以未经处理的细胞和过氧化氢处理的细胞作为阴性对照和阳性对照。
    3. 按照制造商的操作规程及 A. Azqueta & A.R. Collins10 建议的指南进行彗星试验（Comet assay）。
    4. 在该试验中，使用核酸染料 SYBR Gold 按照制造商说明书对电泳后的样品中的 DNA 进行嵌入和荧光标记。
      注：在 BNC 和 MBNC 样品存在下未发生 DNA 损伤的细胞将显示为荧光圆形绿色核区，而发生 DNA 损伤的细胞则呈现长尾“彗星”状结构——阳性样品表现为“彗星头部”（即核区）后接含有断裂 DNA 片段的“尾部”（尾部 DNA 百分比）。

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结果

G. xylinus 的培养周期总共为 9 天，但菌膜开始形成的时间较早，约 2 天后即已明显可见。细菌纤维素（BNC）的宏观形貌如图 1所示，其形状与培养皿中培养的菌落形态相似。图 2 描述了 BNC-IONP 菌膜的制备过程，概括了上述实验方案中的主要步骤以及各主要组分的组装方式。

SEM图像用于解析BNC纤维的微观结构、形貌及空间分布图3）以及离子纳米颗粒在功能化细菌纳米纤维素中的分布（图4）。BNC由细长的带状结构（直径约50 nm）构成，这些带状结构相互连接形成贯穿整个网络的开放孔隙，且无特定排列模式。IONP优先分布于纤维交错形成的孔隙之间，聚集成尺寸为100 nm或更大的簇状结构，同时也有单个IONP结合在带状结构上。与BNC相比，MBNC的纤维结构较为疏松，这可能是由于IONP促使BN...

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讨论

通过改变静态培养过程中的培养时间以及培养容器的尺寸，可轻松调控细菌纤维素（BNC）膜的厚度和大小。通过调节静态培养中的氧气比例，可以改变BNC的微观特性（如孔隙率）。较高的氧气浓度可产生机械强度更高的BNC11。A. Bodin 及其同事通过在 G. xylinus 发酵过程中将氧气比例从大气氧浓度调整至100%氧气，制备出了爆破压力高达880 mm Hg的BNC管状结构12。类似地，也可通过在发酵过程中引入致孔剂（如石蜡微球）来调控BNC的孔隙率。此时，所形成的孔隙率及孔间连通性将取决于致孔剂的粒径大小13。

BNC 的多孔网络结构使其能够与纳米颗粒进行功能化结合， 例如，用于药物递送载体。在本研究中，我们通过合成并生长IONP，对BNC进行了功能化修饰 原位 将纳米颗粒引入BNC膜中，以在基于BNC的支架中实施磁性方案，实现细胞的快速募集与黏附。纳米力学测试表明，BNC的纳米尺度响应与血管相似14 具有极低的杨氏模量，EBNC<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国防部资助，合同编号为 W81XWH-11-2-0067

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Glucoacetobacter xylinusATCC700178
琼脂西格玛奥德里奇A1296-500G 
D-甘露醇 Bioxtra西格玛奥德里奇M9546-250G 
酵母提取物BD 生物科学212750
细菌用蛋白胨西格玛奥德里奇P0556
氢氧化钠，50% 水溶液西格玛奥德里奇158127-100G
六水合三氯化铁西格玛奥德里奇236489-100G 
氢氧化铵 Macron 精细化学品6665-46
聚乙二醇，平均分子量 400西格玛奥德里奇202398-250G 
四水合二氯化铁西格玛奥德里奇44939-250G
一次性培养皿西格玛奥德里奇BR452000
一次性接种环费舍尔科技22-363-604 
无水硫酸钙W.A. Hammond Drierite 13001
高真空润滑脂西格玛奥德里奇Z273554-1EA
带 90° 钝端的实验室移液针西格玛奥德里奇CAD7937-12EA
pH 试纸  西格玛奥德里奇P4786-100EA
圆底三颈角式蒸馏烧瓶西格玛奥德里奇CLS4965250
油浴用硅油西格玛奥德里奇85409-250ML 
干燥管ChemglassCG-1295-01
隔膜塞，套筒型ChemglassCG-3022-98
磁力搅拌子ChemglassCG-2001-05
冷凝器ChemglassCG-1218-01
温度控制器BriskHeatSDC120JC-A
搅拌加热板费舍尔科技11-100-49SH 
彗星试验试剂盒Trevigen4250-050-K
SYBR Gold 核酸凝胶染料生命科技S-11494
生物原子力显微镜（bio-AFM）JPK 仪器NanoWizard 4a BioScience AFM
纳米压痕仪Micro Materials 有限公司多模块力学测试仪 
扫描电子显微镜（SEM）日立高新科技美国公司日立 S-4800

参考文献

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