本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。
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本文内容
摘要
摘要
在复杂的生物样品中对目标蛋白质进行绝对定量，对于广泛的研究和临床应用至关重要。本方案提供了使用选择反应监测（SRM）质谱法（MS）开发和应用定量检测方法的逐步操作指南。首先，基于多种标准筛选出可能适用于定量的特征性目标肽段，包括识别具有蛋白特异性的肽段、避开翻译后修饰位点，以及分析目标肽段相对于目标蛋白的唯一性。接下来，合成粗制的外源性肽段标准品，用于开发SRM检测方法，并利用所建立的检测方法对生物样品进行定性分析。最后，制备经过纯化、准确定量并带有重同位素标记的内标肽段，用于开展同位素稀释系列SRM检测。本文展示了对所有质谱数据的分析过程。该方案已成功用于准确定量小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264.7细胞中趋化因子信号通路相关蛋白的绝对丰度，并详细描述了对Gi2（一种异源三聚体G蛋白α亚基）的定量过程。
引言
使用质谱法（MS）的蛋白质组学实验可采用非靶向（鸟枪法）或靶向方法进行设计。发现型蛋白质组学通常依赖自下而上的鸟枪法质谱技术，可通过传统的数据依赖性采集模式，或采用近期开发的数据非依赖性技术之一来实现例如，硕士E，SWATH）1,2Shotgun 蛋白质组学是用于高通量肽段鉴定和相对定量的有力工具，但通常不适用于绝对定量或针对少量特定（约数十个）蛋白质的分析。在靶向蛋白质组学中，最常用的质谱方法是选择反应监测（SRM），因其具有高灵敏度、快速检测能力和宽动态范围3-5SRM 的替代方法包括平行反应监测，后者利用高分辨率的全扫描 MS 技术6.
SRM 通常使用与纳米电喷雾电离（nano-ESI）离子源联用的纳米流速反相高效液相色谱（nano-RP-LC）仪器，并连接三重四极杆质谱仪（QqQ-MS）进行。在典型实验中，样品蛋白质经蛋白酶消化后，产生的肽段通过色谱分离、解吸并离子化。生成的前体离子由第一重四极杆（Q1）按质荷比（m/z）筛选，并在第二重四极杆（q2）中通过与碰撞气体碰撞而发生碎裂。所产生的碎片离子在第三重四极杆（Q3）中再次按 m/z 筛选，并由打拿极进行定量。每一对前体离子与碎片离子称为一个“跃迁”（transition），每个跃迁在特定时间段（驻留时间；通常为 2–50 毫秒）内被监测。在 LC-SRM 过程中，QqQ-MS 在预设的跃迁列表中循环（工作周....
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方案
注意：此方法此前已有描述56。
1. 肽段靶标的选择
- 列出目标蛋白，并包含少量看家蛋白用于不同生物样本间的归一化，同时加入一种内参蛋白标准品例如，萤火虫荧光素酶）。将目标蛋白消化为胰蛋白酶肽段 计算机模拟 使用诸如 Protein Digestion Simulator 之类的软件工具29,30.
- 要求肽段完全由胰蛋白酶切割产生，且不含遗漏的胰蛋白酶切割位点。避免含有相邻胰蛋白酶切割位点的肽段，以防止胰蛋白酶消化不完全31.
- 要求每条肽段的长度为5-20个氨基酸残基。可考虑更长的肽段，但需注意其合成成本通常更高。
- 避免使用对应于天然遗传变异的肽段（例如，一个单核苷酸多态性）。同时确认胰蛋白酶切割位点未受影响（步骤 1.2）。
- 避免选择对应翻译后修饰（PTM）位点的肽段。同样，若肽段在液相色谱-质谱（LC-MS）样品制备过程中易于发生化学修饰，也应避免使用。具体而言，应避免易发生半胱氨酸和甲硫氨酸氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺以及氨基末端谷氨酰胺形成焦谷氨酸的肽段。确认胰蛋白酶切割位点未受影响（步骤1.2）。
- 此外，应避免选择来源于蛋白质氨基端和羧基端的肽段，因为蛋白质末端容易发生翻译后修饰（如氨基端甲硫氨酸的丢失和乙酰化，以及羧基端....
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结果
建立信号转导通路的预测性计算模型是系统生物学的基本目标之一53不幸的是，即使对于那些已被广泛研究且具有重要临床意义的信号通路，目前仍普遍无法定量预测其在受到扰动后的通路行为。例如，这对MAPK/ERK通路也是如此54）。最近，一项研究采用靶向蛋白质组学、转录组学以及计算建模与模拟方法，对小鼠巨噬细胞趋化信号通路进行了研究56研究的重点是鞘氨醇-1-磷酸介导的RAW 264.7细胞（一种小鼠单核/巨噬细胞系）的趋化作用。为了便于通路建模，开发并实施了液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）检测方法，以测定RAW 264.7细胞内趋化作用通路蛋白的绝对丰度。所得的丰度值被用作通路模型的参数。
整体实验方案（图1）始于一组目标蛋白列表，其中包括异源三聚体G蛋白α亚基Gi2。整个实验流程的成功高度依赖于选择具有蛋白典型性和定量典型性的肽段靶标，例如YDEAASYIQSK。制备并分析了外源肽段标准品的混合物，采用鸟枪法液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QqQ.......
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讨论
绝对蛋白质定量对于多种生物医学应用至关重要，例如生物标志物验证和信号转导通路建模。近年来，基于液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）的靶向蛋白质组学在多个技术环节取得了显著进步，包括肽段标准品制备、高效液相色谱（HPLC）、三重四极杆质谱（QqQ-MS）以及LC-SRM数据分析方法。因此，该技术已成为免疫测定法的一种强大替代方案。免疫测定法虽然具有极高的灵敏度和通量，但建立一个稳健的免疫测定方法极具挑战性，因其可能受到交叉反应或干扰的影响，与细胞/组织裂解/匀浆方法不兼容，或难以实现多重检测5,8。例如，评估交叉反应最全面的方法是使用基因敲除样本进行免疫测定，而这类样本的制备往往具有挑战性。
本方案描述了靶向肽段的选择、液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）检测方法的建立、定性和定量LC-SRM分析，以及LC-SRM数据分析。该方法曾用于测定RAW 264.7细胞中36种趋化性信号通路蛋白的绝对丰度56，但其适用范围远不止于此。尽管该方案最初设计用于细胞沉淀中的蛋白质定量，但也可调整用于其他生物样本（例如，体液）和其他S.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所内部研究计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（ACN），液相色谱-质谱级 | Fisher | A955-1 | |
| BCA（双辛可宁酸）蛋白检测试剂盒 | Fisher | 23235 | |
| 珠击破碎用珠子，二氧化锆-硅石，0.1 mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| 亮抑酶肽盐酸盐 | Sigma | B8385-10MG | |
| 细胞培养用DMEM（含葡萄糖，不含L-谷氨酰胺） | Lonza | 12-614F | |
| 细胞培养用EDTA，500 mM，pH 8 | Gibco | 15575 | |
| 细胞培养用胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| 细胞培养用L-谷氨酰胺 | Sigma | G8540-25G | |
| 细胞培养用磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| 细胞培养用台盼蓝活力染色液，0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 一次性计数板 | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D5545-5G | |
| 甲酸，液相色谱-质谱级，安瓿装 | Fisher | A117-10X1AMP | |
| 血细胞计数板，改进型Neubauer，深度0.1 mm | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES，1 M，pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| 盐酸，37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| 碘乙酰胺 | Sigma | I1149-5G | |
| 激光拉制微移液管仪 | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| 液相色谱涂层石英毛细管，内径50 µm | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| 液相色谱小瓶，自动进样器用，12 mm x 32 mm 聚丙烯 | SUN SRI | 200-268 | |
| 液相色谱小瓶螺口盖，自动进样器用，预切口PTFE/硅胶 | SUN SRI | 500-061 | |
| 荧光素酶，来源于Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH试纸 colorpHast（pH 0.0–6.0） | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak 固相萃取柱，C18，1 ml，100 mg | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak 固相萃取装置，20位 | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak 固相萃取用平头橡胶吸头 | Fisher | 03-448-25 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac 真空浓缩仪 | Fisher | SPD111V | |
| 三氟乙酸（TFA），液相色谱-质谱级 | Fisher | A116-50 | |
| 胰蛋白酶，测序级，修饰型 | Promega | V5113 | |
| Micronic管用去盖器 | USA Scientific | 1765-4000 | |
| 2 ml 微量离心管，带O型圈螺口盖，无菌 | Sarstedt | 72.694.006 | |
| 尿素 | Sigma | U0631-500g | |
| 水，液相色谱-质谱级 | Fisher | W6-1 |
参考文献
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-....
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