细胞质与液泡的定量分析 沙门氏菌 通过差异性通透处理在原代巨噬细胞中进行

摘要

我们采用差异性皂苷透化法，对骨髓来源巨噬细胞中的胞质和液泡内Salmonella typhimurium进行定量分析。

摘要

细胞内细菌病原体可在细胞质中或特化的含病原体囊泡（PCVs）中复制。为了进入细胞质，某些细菌如 福氏志贺菌 和 Francisella novicida 需要诱导吞噬体破裂。相比之下， 鼠伤寒沙门氏菌 在一种称为液泡样区室的结构中进行复制 沙门氏菌含液泡（SCV）。然而，某些突变体 沙门氏菌 无法维持SCV的完整性，从而被释放到细胞质中。通过差异性通透化法（也称为吞噬体保护试验），可以在单个细菌水平上测量细胞质内与液泡内细菌的比例。该方法利用了去污剂皂苷（digitonin）选择性结合胆固醇的特性。由于质膜中的胆固醇含量高于其他细胞内膜结构，因此可使用皂苷选择性地通透质膜，而保持细胞内膜结构完整。简言之，在用表达荧光标记蛋白的病原体感染后例如 mCherry 等），通过短时间孵育含皂苷（digitonin）的缓冲液使宿主细胞的细胞膜通透化。随后洗涤细胞，并与针对目标细菌的一抗（偶联所选荧光染料）孵育例如 抗-沙门氏菌-FITC）并再次洗涤。如果使用未标记的细菌，可增加一个额外步骤，即对所有细胞膜进行通透处理，并用相应的抗体对所有细菌进行染色。染色完成后，可通过流式细胞术（FACS）或显微镜计数单阳性或双阳性事件，定量分析位于液泡内和细胞质中的细菌比例。本文提供了该技术与细菌联用的实验细节 鼠伤寒沙门氏菌该检测方法的优势在于，与其他检测方法相比，它能够在单个细菌水平上进行定量，若结合显微镜分析，还可提供特定细胞内胞质和液泡中细菌的精确数量。

引言

胞内细菌病原体在宿主细胞胞质中直接复制，或在特化的囊泡样区室内进行复制¹。在感染的初始阶段，大多数病原体通过专职细胞（如巨噬细胞）的吞噬作用，或通过主动促进自身进入非吞噬性细胞而被内化。在吞噬细胞中，吞噬体通常与溶酶体融合形成降解性区室，其中被吞噬的颗粒物被降解。像Francisella novicida或Shigella flexneri等特化的胞质细菌可通过诱导吞噬体破裂，从而逃逸出吞噬体并进入胞质^2,3。这一过程需要毒力相关机制的参与，例如Francisella致病岛（FPI）或Shigella flexneri的III型分泌系统（T3SS），后者可注入促进囊泡破裂的效应蛋白^2-4。宿主细胞胞质中含有多种保守的模式识别受体，通常可识别病原体的存在并激活先天免疫信号通路⁵。此外，异源自噬（xenophagy）作为一种抗微生物的自噬形式，可降解进入胞质的细菌。胞内细菌通常通过不同策略很好地适应并抑制或规避这些宿主反应。例如，Francisella通过修饰其脂多糖（LPS）以避免宿主识别，而Shigella则利用分泌的效应蛋白阻止自噬相关蛋白的招募^6,7。

另一种逃逸溶酶体降解的策略由模式性液泡内病原体Salmonella enterica血清....

方案

1. 表达mCherry的皂苷素检测 沙门氏菌 （基于FACS的分析）

1. 准备细菌
   注意：Salmonella 野生型 SL1344（链霉素抗性）携带表达 mCherry 的质粒（pFPV 质粒，在 rpsM 启动子驱动下表达 mCherry），本实验使用该菌株。组成型表达 mCherry 不影响细菌的吞噬和增殖（数据未显示） ¹⁶。
   1. 感染前一天，将菌株接种于 3 ml LB 培养基中，培养基中添加链霉素（90 µg/ml）和氨苄青霉素（100 µg/ml，用于携带表达 mCherry 的质粒），在 37 °C 条件下振荡培养过夜。
2. 铺板用于感染。
   1. 将野生型 BMDM 细胞以每孔 1.25 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 ml 原代巨噬细胞培养基（DMEM 培养基补充 10% 胎牛血清（FCS，热灭活，56 °C，30 分钟）、1% HEPES、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-谷氨酰胺以及 10% L929 上清液（由表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的 L929 细胞产生的条件培养基））。根据 表 1 设置不同孔对应的不同实验条件。在用作对照的孔中加入盖玻片（表 1）。
   2. 将细胞置于....

结果

图1 和 图2 展示了方案1和方案2中所述的皂苷素（digitonin）检测的示意图，说明了该方案中的关键步骤及获得的结果。图3 显示了典型的流式细胞术（FACS）结果。使用阳性和阴性对照来设定 mCherry+/FITC- 细菌（位于液泡内的Salmonella）和 mCherry+/FITC+ 细菌（位于胞质中的Salmonella）的门控。基于这些门控，可在实验样本中确定胞质内和液泡内细菌的百分比。在此示例中，我们比较了野生型和ΔsifA突变型Salmonella。图3 显示了在骨髓来源的小鼠巨噬细胞中，使用表达mCherry⁺ 的Salmonella typhimurium野生型和ΔsifA突变株获得的代表性数据。图4 显示了经皂苷素或皂素（saponin）处理的通透化对照组中通常获得的钙联蛋白（Calnexin）（A）和蛋白二硫键异构酶（PDI）（B

讨论

差异性通透化是一种简便且可靠的方法，用于分析和定量细菌病原体在液泡区室与细胞质之间的亚细胞分布。该检测方法已成功应用于Francisella novicida^2,4和Shigella flexneri¹²等细菌。然而，由于许多胞内病原体会改变或修饰宿主的内膜结构，因此皂苷素（digitonin）通透化的可靠性需根据具体病原体或细胞系进行个别验证。针对所使用的病原体或细胞系，可能需要对该检测方法进行优化调整。该方法不仅限于感染生物学研究，还可应用于其他细胞生物学领域，例如细胞死亡信号通路的研究^17,18。

该实验的关键在于质膜和细胞内膜具有不同的脂质组成，特别是细胞内膜中的胆固醇含量较低。皂苷（digitonin）能够与胆固醇形成复合物，从而实现差异性通透化，其效率和选择性取决于皂苷处理的时间和去垢剂的浓度。为了对此进行对照 ，必须通过标记具有明确细胞内定位的蛋白（如钙联蛋白（calnexin）的胞质尾部或内质网腔内蛋白PDI）来检测已通透化的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
皂苷元	Sigma	D5628	50 μg/ml
多聚甲醛	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
乙酸钾	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
抗沙门氏菌 CSA-1-FITC 抗体	KPL	01-91-99-MG	1/500
抗沙门氏菌 CSA-1 抗体	KPL	02-91-99-MG	1/500
抗钙联蛋白抗体	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
抗蛋白二硫键异构酶抗体	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
皂苷	Sigma	47036
Vectashield 封片剂	Vectorlabs	H-1200
抗兔 IgG-488 抗体	Molecular Probes	A-11070	1/500
甘氨酸	Sigma	G8898
庆大霉素	Life Technologies	15710-49	100 μg/ml 和 10 μg/ml
吐温 X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
非必需氨基酸	Amimed	5-13K00-H
LSM700 共聚焦显微镜	Zeiss		成像使用 63X 物镜
FACS Fortessa	BD technologies		mCherry 检测波长 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		FITC 检测波长 530 nm