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方法文章

细胞质与液泡的定量分析 沙门氏菌 通过差异性通透处理在原代巨噬细胞中进行

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DOI：

10.3791/52960

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2015年7月28日

 , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

本文内容

摘要

我们采用差异性皂苷透化法，对骨髓来源巨噬细胞中的胞质和液泡内Salmonella typhimurium进行定量分析。

摘要

细胞内细菌病原体可在细胞质中或特化的含病原体囊泡（PCVs）中复制。为了进入细胞质，某些细菌如 福氏志贺菌 和 Francisella novicida 需要诱导吞噬体破裂。相比之下， 鼠伤寒沙门氏菌 在一种称为液泡样区室的结构中进行复制 沙门氏菌含液泡（SCV）。然而，某些突变体 沙门氏菌 无法维持SCV的完整性，从而被释放到细胞质中。通过差异性通透化法（也称为吞噬体保护试验），可以在单个细菌水平上测量细胞质内与液泡内细菌的比例。该方法利用了去污剂皂苷（digitonin）选择性结合胆固醇的特性。由于质膜中的胆固醇含量高于其他细胞内膜结构，因此可使用皂苷选择性地通透质膜，而保持细胞内膜结构完整。简言之，在用表达荧光标记蛋白的病原体感染后例如 mCherry 等），通过短时间孵育含皂苷（digitonin）的缓冲液使宿主细胞的细胞膜通透化。随后洗涤细胞，并与针对目标细菌的一抗（偶联所选荧光染料）孵育例如 抗-沙门氏菌-FITC）并再次洗涤。如果使用未标记的细菌，可增加一个额外步骤，即对所有细胞膜进行通透处理，并用相应的抗体对所有细菌进行染色。染色完成后，可通过流式细胞术（FACS）或显微镜计数单阳性或双阳性事件，定量分析位于液泡内和细胞质中的细菌比例。本文提供了该技术与细菌联用的实验细节 鼠伤寒沙门氏菌该检测方法的优势在于，与其他检测方法相比，它能够在单个细菌水平上进行定量，若结合显微镜分析，还可提供特定细胞内胞质和液泡中细菌的精确数量。

引言

胞内细菌病原体在宿主细胞胞质中直接复制，或在特化的囊泡样区室内进行复制1。在感染的初始阶段，大多数病原体通过专职细胞（如巨噬细胞）的吞噬作用，或通过主动促进自身进入非吞噬性细胞而被内化。在吞噬细胞中，吞噬体通常与溶酶体融合形成降解性区室，其中被吞噬的颗粒物被降解。像Francisella novicida或Shigella flexneri等特化的胞质细菌可通过诱导吞噬体破裂，从而逃逸出吞噬体并进入胞质2,3。这一过程需要毒力相关机制的参与，例如Francisella致病岛（FPI）或Shigella flexneri的III型分泌系统（T3SS），后者可注入促进囊泡破裂的效应蛋白2-4。宿主细胞胞质中含有多种保守的模式识别受体，通常可识别病原体的存在并激活先天免疫信号通路5。此外，异源自噬（xenophagy）作为一种抗微生物的自噬形式，可降解进入胞质的细菌。胞内细菌通常通过不同策略很好地适应并抑制或规避这些宿主反应。例如，Francisella通过修饰其脂多糖（LPS）以避免宿主识别，而Shigella则利用分泌的效应蛋白阻止自噬相关蛋白的招募6,7。

另一种逃逸溶酶体降解的策略由模式性液泡内病原体Salmonella enterica血清型Typhimurium采用，后文简称为Salmonella typhimurium。Salmonella利用III型分泌系统（T3SS）注入效应蛋白，将初始吞噬体重塑为其胞内生态位，即Salmonella寄居的液泡（SCV）8,9。为了维持该液泡，需要持续调控宿主通路，将脂质及其他营养物质招募至液泡。事实上，Salmonella的sifA突变株无法维持液泡的稳定性，感染数小时内即进入宿主细胞的胞质，从而激活先天免疫通路并招募自噬相关蛋白8。Salmonella从液泡中的逃逸情况因所研究的细胞类型而异，已有多个研究报告表明，在上皮细胞中，即使是野生型（WT）Salmonella也可逃逸SCV，并在胞质中大量复制10。最近的研究显示，宿主对液泡内病原体的先天免疫识别也依赖于其识别并破坏含病原体液泡（PCVs）的能力11-14。

由于宿主或细菌的基因型均可能影响胞内细菌在液泡和胞质区室之间的分布，因此有必要对液泡内与胞质内的细菌数量进行定量。在大多数实验条件下，宿主细胞会被多个细菌感染，从而可能在不同的亚细胞区室中容纳多个细菌，因此需要一种能够在单个细菌水平上实现定量的技术。差异性通透化（也称为液泡保护实验）可提供这种分辨率2,4,10,12。该方法基于使用去污剂皂苷（digitonin）选择性地通透宿主细胞的质膜，而保留液泡膜的完整性，从而允许使用抗体特异性地标记暴露于胞质的细菌。本文提供了两种利用差异性通透化方法对胞质和液泡内的伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）进行定量的实验方案。该方法的原理如图1所示：从骨髓中分离获得的巨噬细胞（BMDMs）被表达mCherry的静止期Salmonella感染。必须使用处于静止期的Salmonella，因为此阶段的细菌会下调SPI-1 T3SS的表达，若其仍具活性，则会被NLRC4炎性小体识别，从而引发BMDMs的快速细胞死亡（焦亡）15。感染后，细胞经洗涤，并用50 μg/ml 的皂苷处理1分钟。随后立即再次洗涤细胞，并与FITC标记的抗Salmonella抗体孵育，以标记已进入胞质的细菌。再经过一次洗涤步骤后，裂解细胞，并通过流式细胞术（FACS）测定mCherry+（液泡内）和FITC+ / mCherry+（胞质内）细菌的比例。我们还报告了该方法的一种改进版本，适用于无法获得表达荧光蛋白菌株的情况（图2）。在FITC标记之后增加了额外步骤：细胞被固定并完全通透化，随后使用抗Salmonella抗体及其相应的二抗对所有细菌进行染色，最后通过显微镜观察而非流式细胞术进行检测。

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方案

1. 表达mCherry的皂苷素检测 沙门氏菌 （基于FACS的分析）

  1. 准备细菌
    注意：Salmonella 野生型 SL1344（链霉素抗性）携带表达 mCherry 的质粒（pFPV 质粒，在 rpsM 启动子驱动下表达 mCherry），本实验使用该菌株。组成型表达 mCherry 不影响细菌的吞噬和增殖（数据未显示） 16。
    1. 感染前一天，将菌株接种于 3 ml LB 培养基中，培养基中添加链霉素（90 µg/ml）和氨苄青霉素（100 µg/ml，用于携带表达 mCherry 的质粒），在 37 °C 条件下振荡培养过夜。
  2. 铺板用于感染。
    1. 将野生型 BMDM 细胞以每孔 1.25 × 105 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 ml 原代巨噬细胞培养基（DMEM 培养基补充 10% 胎牛血清（FCS，热灭活，56 °C，30 分钟）、1% HEPES、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-谷氨酰胺以及 10% L929 上清液（由表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的 L929 细胞产生的条件培养基））。根据 表 1 设置不同孔对应的不同实验条件。在用作对照的孔中加入盖玻片（表 1）。
    2. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中过夜培养。
通透处理染色
玻璃盖玻片沙门氏菌皂苷皂素抗沙门氏菌抗体抗钙联蛋白抗体抗蛋白二硫键异构酶抗体
A1（样本）-/+*+++
A2（样本）-/+*+++
A3（样本）-/+*+++
A4（无通透处理对照）-/+*++
A5（完全通透处理对照）-/+*+++
B1（钙联蛋白染色）++
B2（钙联蛋白染色）+++
B3（钙联蛋白染色）+++
C1（PDI染色）++
C2（PDI染色）+++
C3（PDI染色）+++

表1：用于后续感染沙门氏菌、通透化及染色的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在24孔板中的接种方案。 *根据执行方案1或方案2而定。

  1. 准备细菌用于感染
    1. 第二天，测定浓度 沙门氏菌 通过将培养物用PBS按1:10稀释并测定OD值，检测过夜培养物600 以仅含 PBS 的对照组为参照。这可确保 OD600 在分光光度计的线性范围内进行测量。
    2. 计算浓度 沙门氏菌 每毫升。OD600 为 1 时对应 1 × 109 细菌
    3. 将细菌用巨噬细胞培养基稀释至所需浓度 沙门氏菌 1.25 × 10 的浓度6 细胞/毫升
  2. 细胞感染 沙门氏菌.
    1. 从BMDM中移除培养基。向未感染的对照孔（B1-B3、C1-C3）加入1 ml巨噬细胞培养基。加入1 ml 沙门氏菌 将悬浮液加入至 A1 - A5 孔中，使感染复数（m.o.i.）达到每细胞 10 个细菌。
    2. 将培养板在37 °C、300 × g条件下离心15 min，以同步化感染过程。随后将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.
  3. 杀灭细胞外病原体 沙门氏菌 使用庆大霉素。
    1. 感染后1小时，从培养箱中取出培养板，加入0.1 ml含有0.1 mg/ml巨噬细胞培养基 加入庆大霉素以杀灭胞外细菌。将庆大霉素加入所有孔中，包括未感染的对照孔，以确保所有细胞接受相同的处理。将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。2.
  4. 洗涤细胞。
    1. 2 小时时 感染后，从培养箱中取出培养板，用1 ml普通DMEM（预热至37 °C）洗涤所有孔2次，并更换为含10 µg/ml的巨噬细胞培养基（预热至37 °C） 使用庆大霉素抑制任何残留胞外细菌的生长。将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.
  5. 配制含有去垢剂和抗体的新鲜缓冲液。
    1. 在到达预定分析时间点之前，配制新鲜的皂苷素（digitonin）储备液，浓度为1 mg/ml。 在KHM缓冲液（110 mM醋酸钾，20 mM HEPES，2 mM MgCl₂）中2，pH 7.3）。将储备液过滤后，用KHM缓冲液稀释至工作浓度50 µg/ml 0.1% 皂苷的KHM缓冲液，并准备抗-沙门氏菌 FITC 标记的抗体（CSA-1-FITC）按 1/500 稀释，抗 calnexin 抗体按 1/100 稀释，或抗 PDI 抗体按 1/100 稀释，溶于含 3% BSA 的 KHM 缓冲液中。
  6. 细胞通透化
    1. 从培养箱中取出培养板，洗涤3次 加入0.5 ml KHM缓冲液（预热至37 °C）。移除KHM缓冲液后，向孔A4和B1/C1中加入0.25 ml普通KHM缓冲液，向孔A1 - A3和B2/C2中加入含digitonin的KHM缓冲液，或向孔A5和B3/C3中加入含saponin的KHM缓冲液（根据 表1）。在室温下准确孵育1分钟，立即用0.5 ml KHM缓冲液（预热至37 °C）洗涤所有孔3次。
  7. 一抗染色
    1. 移除 KHM 缓冲液，加入一抗溶液（山羊抗 沙门氏菌-FITC，每孔250 µl，0.1 µg/ml）加入至相应的孔中（图1, 表1）。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育15分钟2.
    2. 用1 mL PBS洗涤细胞1次。
  8. 感染细胞（孔 A1 - A5）：流式细胞术分析
    1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次，加入含 0.1% Triton 的 0.5 mL 冰上预冷的 PBS。转移至带有细胞滤网帽的 5 mL FACS 管中，以分散细胞团块。样品置于冰上保存。
    2. 使用FACS样本进行分析。利用完全通透的对照样本，首先根据前向散射和侧向散射（FSC/SSC）设定总细菌的门控，然后根据mCherry信号（610 nm ± 20 nm滤光片）进行设定。
    3. 接下来，利用完全透化和未透化的对照样本，分析总细菌群体中的FITC信号，以设定细胞质内细菌（FITC+, mCherry+）和液泡内细菌（FITC−, mCherry+）的门控图3).
    4. 设置门控后，使用 FlowJo 软件按照制造商方案分析样本，并确定细胞质与液泡内细菌的百分比。
  9. 未感染通透性对照（B1 - B3、C1 - C3孔）：显微镜观察
    1. 固定
      1. 移除 PBS，加入 250 µl 含 4% PFA 的 PBS。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
      2. 用 1 ml PBS 洗涤 2 次，每次加入 250 µl 含 0.1 M 甘氨酸的 PBS，孵育 10 分钟以淬灭固定剂。再用 1 ml PBS 洗涤 2 次。
    2. 二抗染色
      1. 在 PBS 中加入 0.1% 皂苷和 3% BSA，配制含适当荧光染料标记二抗的染色液，室温孵育 1 小时，充分透化细胞。
      2. 用1 ml PBS洗涤盖玻片3次，然后将盖玻片用含DAPI（1.5 μg/ml）的封片剂封片，用于分析。
    3. 显微镜分析
      1. 使用共聚焦荧光显微镜在40倍或63倍放大倍数下分析带有对照的盖玻片。如果透化成功，未透化细胞应无染色信号，经皂苷或洋地黄皂苷处理的透化细胞均应显示Calnexin染色，而仅在皂苷透化细胞中观察到PDI染色图4).

2. 未标记沙门氏菌的皂苷素检测（基于显微镜的分析）

  1. 准备用于过夜培养的细菌。
    1. 接种未标记的 沙门氏菌 野生型SL1344（链霉素抗性）在感染前1天，于含链霉素（90 µg/ml）的3 ml LB培养基中，37 °C摇床过夜培养。
    2. 感染实验的细胞接种。
      1. 将原代骨髓来源的巨噬细胞接种于24孔板中，孔内预先放置无菌玻璃盖玻片，接种密度为1.25 × 10⁵个细胞/孔5 细胞/孔，加入1 ml巨噬细胞培养基（DMEM，添加10%胎牛血清（FCS，去补体，56 °C，30分钟）、1% HEPES、1% L-非必需氨基酸（NEAA）、1% L-谷氨酰胺和10% L929上清液）。根据以下方案接种孔板 表1 以考虑个体差异。
      2. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中将细胞孵育过夜2.
    3. 准备用于感染的细菌。
      1. 第二天，测定浓度 沙门氏菌 在过夜培养物中，用 PBS 按 1:10 稀释培养物并测定 OD600 以仅含 PBS 的对照组为基准。这可确保 OD600 在分光光度计的线性范围内进行测量。
      2. 测定浓度 沙门氏菌 每毫升。OD600 对应于 1 × 109 细菌
      3. 将细菌用巨噬细胞培养基稀释至所需浓度 沙门氏菌 1.25 × 10 的浓度6 细胞/毫升
    4. 细胞感染 沙门氏菌.
      1. 吸出所有孔中的培养基。向未感染的对照孔（B1 - B3, C1 - C3）加入1 ml普通巨噬细胞培养基。向其余孔加入1 ml 沙门氏菌 将悬浮液加入至A1-A5孔中，使感染复数（m.o.i.）达到每个细胞10个细菌。
      2. 将培养板在37 °C、300 × g条件下离心15分钟，以同步化感染过程。随后将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。2.
    5. 杀灭细胞外病原体 沙门氏菌 使用庆大霉素。
      1. 感染后1小时，从培养箱中取出培养板，向所有孔中加入0.1 ml含1 mg/ml庆大霉素的巨噬细胞培养基，以杀灭胞外细菌。将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养。2.
    6. 洗涤细胞。 
      1. 2 小时时 感染后，从培养箱中取出培养板，每孔用含10 µg/ml的1 ml新鲜巨噬细胞培养基洗涤3次 使用庆大霉素抑制任何残留胞外细菌的生长。将培养板转移至37°C、5% CO₂的培养箱中培养2.
    7. 配制含有去垢剂和抗体的新鲜缓冲液。 
      1. 在到达预定分析时间点之前，用KHM缓冲液（110 mM醋酸钾，20 mM HEPES，2 mM MgCl₂）新鲜配制1 mg/ml的皂苷素（digitonin）储备液。2，pH 7.3）。将储备液过滤后，用KHM缓冲液稀释至工作浓度50 µg/ml 皂苷
      2. 此外，配制含有0.1%皂苷的KHM缓冲液溶液，以及抗-沙门氏菌-FITC（CSA-1，0.1 µg/ml）、抗calnexin抗体（1/100稀释）或抗PDI抗体（1/100稀释），溶于含3% BSA的KHM缓冲液中（抗体浓度详见材料表）。
    8. 细胞通透化
      1. 从培养箱中取出培养板，用0.5 ml预热至37 °C的KHM缓冲液洗涤各孔3次。吸去KHM缓冲液后，向A4孔及B1/C1孔加入0.25 ml普通KHM缓冲液，向A1–A3孔及B2/C2孔加入含digitonin的KHM缓冲液，向A5孔及B3/C3孔加入含saponin的KHM缓冲液（根据 表1在室温下准确孵育1分钟，立即用0.5 ml预热至37 °C的KHM缓冲液洗涤所有孔3次。
    9. 一抗染色
      1. 去除 KHM 缓冲液，加入一抗溶液（山羊抗 沙门氏菌 CSA1-FITC，每孔 250 µl，0.1 µg/ml）加入至相应的孔中（图2, 表1）。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育15分钟2用1 ml PBS洗涤3次。
    10. 固定
      1. 移除 PBS，加入 250 µl 含 4% PFA 的 PBS。37 °C 孵育 10 分钟。
      2. 用 1 ml PBS 洗涤 2 次，每次加入 250 µl 含 0.1 M 甘氨酸的 PBS，孵育 10 分钟以淬灭固定剂。再用 1 ml PBS 洗涤 2 次。
    11. 总计 沙门氏菌 感染样本的染色。
      1. 用含0.1%皂苷/3% BSA的PBS洗涤盖玻片3次，在含0.1%皂苷/3% BSA的PBS中，室温下用抗CSA1抗体（山羊抗CSA1，0.1 µg/ml；小鼠抗LPS也可用，0.1 µg/ml）孵育样本1小时。
      2. 用含 0.1% 皂苷/3% BSA 的 PBS 洗涤 3 次。在避光条件下，室温下用含 0.1% 皂苷/3% BSA 的 PBS 稀释的荧光标记抗山羊二抗孵育样本 30 分钟。
      3. 用1 ml PBS洗涤盖玻片3次，然后将盖玻片用含DAPI（1.5 μg/ml）的封片剂封片，用于分析。  
    12. 显微镜分析
      1. 使用共聚焦显微镜通过计数胞质中的 沙门氏菌 （抗-沙门氏菌-FITC 阳性）和总 沙门氏菌 （双阳性）图5）。通透性对照应显示：未通透细胞无染色信号，Digitonin 通透细胞显示 Calnexin 染色，Saponin 通透细胞显示 PDI 染色（图4A4 和 A5 孔将作为内部对照 沙门氏菌 染色。

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结果

图1 和 图2 展示了方案1和方案2中所述的皂苷素（digitonin）检测的示意图，说明了该方案中的关键步骤及获得的结果。图3 显示了典型的流式细胞术（FACS）结果。使用阳性和阴性对照来设定 mCherry+/FITC- 细菌（位于液泡内的Salmonella）和 mCherry+/FITC+ 细菌（位于胞质中的Salmonella）的门控。基于这些门控，可在实验样本中确定胞质内和液泡内细菌的百分比。在此示例中，我们比较了野生型和ΔsifA突变型Salmonella。图3 显示了在骨髓来源的小鼠巨噬细胞中，使用表达mCherry+ 的Salmonella typhimurium野生型和ΔsifA突变株获得的代表性数据。图4 显示了经皂苷素或皂素（saponin）处理的通透化对照组中通常获得的钙联蛋白（Calnexin）（A）和蛋白二硫键异构酶（PDI）（B

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讨论

差异性通透化是一种简便且可靠的方法，用于分析和定量细菌病原体在液泡区室与细胞质之间的亚细胞分布。该检测方法已成功应用于Francisella novicida2,4和Shigella flexneri12等细菌。然而，由于许多胞内病原体会改变或修饰宿主的内膜结构，因此皂苷素（digitonin）通透化的可靠性需根据具体病原体或细胞系进行个别验证。针对所使用的病原体或细胞系，可能需要对该检测方法进行优化调整。该方法不仅限于感染生物学研究，还可应用于其他细胞生物学领域，例如细胞死亡信号通路的研究17,18。

该实验的关键在于质膜和细胞内膜具有不同的脂质组成，特别是细胞内膜中的胆固醇含量较低。皂苷（digitonin）能够与胆固醇形成复合物，从而实现差异性通透化，其效率和选择性取决于皂苷处理的时间和去垢剂的浓度。为了对此进行对照 ，必须通过标记具有明确细胞内定位的蛋白（如钙联蛋白（calnexin）的胞质尾部或内质网腔内蛋白PDI）来检测已通透化的细胞。

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢 Mathias S. Dick、Roland F. Dreier 和 Sebastian Rühl 的讨论。本工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）教授职位项目 PP00P3_139120/1 和巴塞尔大学项目资助 ID2153162 对 P.B. 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
皂苷元SigmaD562850 μg/ml
多聚甲醛mpbio219998380
HEPESLife Technologies15630
乙酸钾Sigma791733
MgCl2SigmaM8266
牛血清白蛋白SigmaA2153
抗沙门氏菌 CSA-1-FITC 抗体KPL01-91-99-MG1/500
抗沙门氏菌 CSA-1 抗体KPL02-91-99-MG1/500
抗钙联蛋白抗体Enzo LifesciencesSPA-860D1/100
抗蛋白二硫键异构酶抗体Enzo LifesciencesSPA-8901/100
皂苷Sigma47036
Vectashield 封片剂VectorlabsH-1200
抗兔 IgG-488 抗体Molecular ProbesA-110701/500
甘氨酸SigmaG8898
庆大霉素Life Technologies15710-49100 μg/ml 和 10 μg/ml
吐温 X-100PromegaH5141
PBSGibco20012-019
DMEMSigmaD6429
非必需氨基酸Amimed5-13K00-H
LSM700 共聚焦显微镜Zeiss成像使用 63X 物镜
FACS FortessaBD technologiesmCherry 检测波长 610 nm
FACS FortessaBD technologiesFITC 检测波长 530 nm

参考文献

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细胞质与液泡的定量分析 沙门氏菌 通过差异性通透处理在原代巨噬细胞中进行
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