本文的目的是介绍一些简单的方法，这些方法将极大地方便对患有肺癌或其他病理状况的小鼠肺组织进行制备和分析。我们提供了三种实验方案，用于简便且可靠地进行肺部灌注、固定以及肺容积测量。
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摘要
摘要
在不损伤或杀死小鼠的情况下，将活体试剂、细胞或化学物质直接注入肺部，是肺癌研究中的一项重要技术。尽管已有多种文献报道的方法可用于小鼠气管插管以进行肺功能测定，但这些方法在对大量小鼠群体进行快速气管灌注时均存在潜在问题。本文介绍了一种简单且快速的方法，使研究人员能够高效地完成此类灌注操作。该方法无需任何特殊工具或照明设备，且只需极少的练习即可掌握。操作过程包括麻醉小鼠，在颈部做一小切口以暴露气管，然后直接插入静脉导管。小切口可使用组织粘合剂迅速闭合，随后让小鼠恢复。熟练的学生或技术人员平均可在2分钟/只小鼠的速度下完成操作。在肺癌模型建立后，通常需要对肺组织进行定量组织学分析。传统上，病理学家通常不注重在固定过程中标准化肺膨胀状态，分析往往依赖于可能具有较大主观性的评分系统。虽然这种方法有时足以粗略估计肺肿瘤的大小，但任何对肺结构或细胞的准确体视学定量分析，均要求具备可重复的固定程序以及后续的肺体积测量。本文中，我们描述了在加压条件下固定肺组织并精确测定固定后肺体积的简单可靠的操作步骤。唯一需要的设备是一台在1 mg–300 g范围内具有精确称重能力的实验室天平。因此，本文所介绍的方法可显著提升在小鼠中建立、治疗和分析肺癌的能力。
引言
由于多种原因，肺癌在小鼠中尚未得到广泛研究。其中一个原因是肺部难以接近 体内，且对固定肺组织进行定量分析的情况并不常见。本文所述方法旨在弥补这一不足，目的在于介绍一些简便的方法，这些方法将极大有助于肺癌或其他肺部病理小鼠模型的肺组织制备与分析。尽管这些方法本身并非完全新颖，但此前尚未以本文所描述的这种简化且独立成章的方式整合呈现。
已有若干论文描述了小鼠肺部插管的方法，主要用于在纵向研究中对单个小鼠重复进行肺功能检测或支气管肺泡灌洗。自最初那篇论文发表以来，又有其他多篇论文报道了不同的小鼠插管技术1-9。尽管这些方法均可成功应用，但通常需要大量训练，且往往存在不可忽视的失败率。此外，若需进行肺功能测量，导管必须与气管紧密贴合，以防止漏气。然而，插管的另一项实际用途是将特定物质（如癌细胞或其他损伤因子）或治疗药物直接递送至肺部。此类操作无需紧密贴合的导管，也不需要复杂的肺功能检测设备。本文所示方法的新颖之处在于采用了一种简单的外科操作，可确保导管完全避免进入食管。这种简易方法使得插管操作能够成功实施，且所需训练或经验相对较少。使用该方法每小时可处理多达30只小鼠，失败率接近于零。
当小鼠准备处死后，可将其受损或癌变的肺组织取出，用于组织学和病理学分析。然而，为了准确量化组织学参数并与其它肺组织进行比较，必须标准化固定流程，并准确测定固定后的肺体积10。本文详细描述了实现标准化固定操作的简便步骤，以及测定固定肺体积的方法。该体积是组织学量化中的关键指标，因为若无体积测定，仅能获得相对密度数据10。一旦获知肺体积，即可对肺内细胞数量及其他结构参数进行绝对定量分析。
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方案
以下方案描述的系统适用于20–35 g的小鼠。通过更换导管尺寸，该方法可轻松适用于更大或更小的小鼠。所有动物实验方案均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。
1. 肺部灌注
- 选择一种商用的一英寸长 20 g 静脉导管用于插管。
- 手动弯曲导管尖端，使其尖端形成轻微弯曲，如图 1所示。
- 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）混合物进行麻醉，并通过缺乏反射性运动确认麻醉效果。麻醉后立即在眼睛上涂抹兽用眼膏。 麻醉后立即在眼睛上涂抹兽用眼膏，并皮下注射卡洛芬（5–10 mg/kg）以提供术后及灌注镇痛。
- 将小鼠仰卧于一个倾斜的平台之上。如图 2所示，使用带有缝合环并用胶带固定的大型办公文件夹即可达到理想效果。
- 剃除颈部腹侧的毛发，并用 70% 酒精清洁和消毒颈部区域。 佩戴新的无乳胶、无粉手套，使用经 70% 酒精消毒的手术器械。
- 使用锋利的剪刀在下门齿下方约 12 mm 处的颈部做一小切口。
- 用镊子轻轻向尾侧牵拉颈部皮肤，直至可见气管腹壁。
- 轻柔地将舌头向后牵拉，将导管插入，使弯曲的尖端朝向小鼠腹面。与步骤 1.4 相同，轻柔牵拉颈部皮肤，并将导管插入气管。
注意：经过少量练习后，可观察到导管沿气管下行。若导管进入食管，则无法观察到导管移动。操作中不在气管上做任何切口。 - 一旦在颈部观察到导管进入气管，继续推进约 5 mm，以确保导管可靠地通过声门但仍远高于隆突。
- 准备通过凝胶上样移液器吸头经导管注入最多 50 µl 液体。将吸头插入鲁尔接头，但在注射前仔细观察吸头内液体是否随小鼠呼吸同步移动，确认无误后注入灌注液。
- 使用 1 ml 注射器，立即通过导管向肺部快速注入 0.6 ml 空气，以帮助液体深入分布至肺部。随后拔出导管。
- 拔出导管。
- 按照 VetBond 产品说明书的指导，使用少量氰基丙烯酸酯粘合剂封闭手术小切口。将小鼠置于单独的笼子中，并持续观察直至其苏醒，恢复正常行为且无任何不适表现。
2. 肺组织固定
注意：在小鼠的所有实验操作完成后，可用甲醛（或其他任何所需固定剂）固定肺组织，以备进行组织学处理。
- 采用符合IACUC标准的操作处死小鼠。对于视频中所示的代表性小鼠，采用麻醉后颈椎脱位法。
- 若尚未进行气管造口术，需通过手术暴露气管腹侧，做一小切口，将18 G 短针头插入气管，并用缝线固定。
- 沿中线切开胸腔，小心切除膈肌并移除侧胸壁，以暴露肺组织。
- 将针头的鲁尔接头端连接至置于铁架台上的含甲醛溶液的储液瓶。参见图3。
- 使甲醛液面高于小鼠水平位置25 cm。参见图3。 接着打开旋塞阀，排出固定管道中的空气。将气管插管的鲁尔接头端与储液管连接，打开旋塞阀，使甲醛灌注并扩张肺部。保持压力至少20分钟。
- 打开旋塞阀，用甲醛灌注以扩张肺部。保持肺部处于加压状态至少20分钟。
- 随后，在短针头远端结扎气管。 可缓慢回拉针头，以暴露更多未插管的气管部分，有助于结扎操作。 确保结扎牢固后，移除旋塞阀。
- 小心分离并取出肺组织。
- 将肺组织置于甲醛溶液中固定过夜。 更长时间的固定亦可接受，某些染色或实验步骤可能要求特定固定时间。 此外，其他液体固定剂（如Z-fix）也可用于灌注和浸没固定。
- 在进行后续组织学处理前，按以下方法测量固定后的肺体积。
3. 固定肺容积的测量
- 使用阿基米德原理测量肺容积，如图所示 图4. 从甲醛中取出固定的肺组织，解剖并移除心脏及其他非肺组织。
- 使用先前构建的简易自制金属丝支撑装置，以保持肺组织完全浸没在水中。
注意：该装置需要与所使用的天平兼容。图中所示为一种典型装置 图5 由塑料移液管和细（20 G）金属丝制成。该系统与视频中使用的天平配合良好，但也可轻松适配大多数实验室天平。 - 放置一个烧杯 ≈200 ml 将支撑笼放入水中，置于天平上，去皮归零。见 图6移除金属笼；将肺置于水面，并用笼子在水中按压。
- 记录天平上的重量。该数值反映了所排开水的体积，因此可直接反映肺容积。注意确保肺、缝线或金属丝笼的任何部分均不接触烧杯的侧壁或底部。
- 为确保准确性，需重复此测量步骤。将肺组织从水中取出，用纸巾擦干。重新将装有笼子的烧杯归零，再次进行肺体积测量。随后取两次体积测量值的平均值。
注意：如果肺脏在福尔马林中放置超过一周左右，肺内的空气将溶解于液体中。此时肺脏会下沉，因此无需再使用任何装置来固定 图5 以保持肺完全浸没。在此情况下，可通过握住其中一根缝合线，将肺完全浸没，如图所示，即可直接测量体积。 图4.
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结果
第一项方案中描述的操作步骤本身不会产生任何普适性结果。它仅描述了一种将物质直接注入气管的非常可靠的方法。图7展示了通过本方法注入台盼蓝后肺组织的一个示例。染料在肺内广泛分布，这与先前通过气管直接给予其他染料或示踪剂时在小鼠中观察到的分布模式相似11,12。我们还利用该方法向肺部递送博来霉素或弹性蛋白酶，分别可导致广泛的肺纤维化或肺气肿。
本文所述用于量化死后肺组织结构变化的方法，提供了在25 cm H2O压力下固定的肺容积数据。此类容积测量对于将后续无偏倚的组织学细胞或组织密度测量结果转换为总体数量至关重要10。本文仅描述获取精确肺容积的方法。在9只10–12周龄的健康Balb/c小鼠中，测得固定肺容积的平均值（± SD）为0.82 ± 0.09 ml，其中左肺容积约占总容积的30%。在采用本文所述方法给予3 U胰弹性蛋白酶以建立实验性肺气肿的Balb/c小鼠中，肺固定容积增至1.15 ± 0.13 ml，左肺所占比例仍保持在30%。
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讨论
本文所述方法具有多项优势。首先，所需设备简单且成本低廉。其次，插管操作可快速完成，且误差较少。第三，能够将肺固定在恒定压力下，随后测量固定后的肺容积，从而实现对肺内结构或细胞的准确定量分析10。
气管插管的一个可能缺点是需要进行小型手术。这可能会限制该操作的重复实施，如果需要进行第二次操作时尤其如此。nd 需要进行灌注。然而，通过精细的手术操作和粘合剂的应用，我们通常能够在一周或两周后常规地进行第二次灌注。如果需要持续重复灌注，或需反复进行肺功能检测，则可能采用另一种插管方法更为理想。13,14.
在进行灌注操作时，有几个实际问题需要提及。最初打开口腔时，对舌头的操作应尽可能轻柔。如果使用镊子，其尖端应包覆橡胶管，因为舌头容易受伤，而这可能导致小鼠死亡。尽管本方法是为6周龄以上小鼠插管设计的，但也可轻易地适用于更年幼的小鼠。
我们的灌注操作最初设计为经口咽部吸入法的一种替代方法11。尽...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 实验室天平 | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | 若其他天平的量程为1-300 g，也可使用 |
| 20 g 鲁尔式静脉导管 | Insylte | 其他多个供应商也可提供，例如，Jelco Optiva | |
| 500 ml 实验室瓶 | Various | 其他多个供应商也可提供 |
参考文献
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