灌输和固定方法有用的小鼠肺癌研究

由于一些原因，肺癌还没有被广泛研究，在小鼠。其中一个原因是，获得的肺是非常困难的体内 ，并固定肺部定量分析操作并不常见。本文介绍的方法旨在改变这种状况。这里的目标是描述简单的方法，将在设置和小鼠肺分析肺癌或其它病理极大地帮助。而所有这些方法是全新的，它们没有被一起呈现如在这里所描述的简化方式的独立的方法。

已经有许多已描述的方法进行小鼠肺插管主要做重复肺功能或支气管肺泡灌洗在纵向研究单个老鼠的目的手稿。由于该原始文件，但已在该所描述的不同的方法来谅解备忘录几个其他文件Ë插管^1-9。虽然所有这些方法都可以成功地被使用，它们通常需要相当大的训练，并且通常不是没有一个非平凡的故障率。另外，在为了进行肺功能测量中，套管需要适应气管得足够紧以便没有空气泄漏。然而，另一个实际使用气管插管是直接提供特定的药物（如癌细胞或其他侮辱），或治疗药物到肺。这样的程序并不需要紧密配合插管，也没有任何复杂的肺功能设备。此处示出了该方法的新颖特征包括一个小的外科手术，其允许插管而不进入食道插管的任何可能性。这个简单的方法使插管成功相对较少的培训或经验。多达30只小鼠/小时可以使用此方法具有故障率接近零对待。

一旦吨他老鼠是准备来牺牲，受伤或癌肺然后可以进行组织学和病理分析中删除。然而，为了正确地量化任何组织学变量与其它的肺相比，有必要标准化的固定程序和适当地量化固定肺容积^10。本文详细介绍了简单的程序，使标准化的固定程序，以及一个方法来衡量固定的肺容积。该卷在组织学的量化的重要指标，因为如果没有这样的容积测定，只有相对密度可以测量^10。一旦肺容积是已知的，然而，细胞和肺中的其他结构的测量绝对测量然后可以定量。

下面的协议说明，在20-35克鼠效果很好的系统。该方法可以很容易地适应于更大或更小的小鼠通过简单地改变导管的大小。所有动物方案都经约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会。

1.肺灌注

1. 选择市售一英寸长的20个克静脉插管以用于插管。
2. 修改导管尖端手动弯曲它产生如图1在前端具有微小曲率。
3. 麻醉小鼠用氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克）的混合物中IP注射，并且由于没有反射运动的确认麻醉。麻醉后立即应用兽医软膏的眼睛。麻醉适用兽医药膏对眼睛紧随，并给予卡洛芬（5-10毫克/公斤SQ），用于手术后和滴注镇痛。
4. 将谅解备忘录SE仰卧在倾斜的平台。 如图2，一间大办公室粘合剂缝合环上的作品贴得很清楚。
5. 剃颈部和清洁的腹侧部分和消毒用70％酒精的颈部区域。用新的latex-和无粉手套，使用消毒用70％酒精手术器械。
6. 使用锋利的剪刀做一个小的手术切口在约12毫米以下的下颌切牙颈部。
7. 用镊子轻轻拉扯皮肤的脖子直到尾端气管的腹壁可见。
8. 轻轻拉回舌和与弯曲尖端的倾斜朝向鼠标的腹面插入插管。正如在1.4，拉轻轻在脖子上的皮肤，然后将导管插入气管。
   注:稍加练习，导管将可见向下移动气管。如果它在食道，就会有导管的运动没有视觉瞄准。无切口在气管制成。
9. 一旦导管被认为是在颈部气管，其推进约5mm至可靠地传递声带但仍明显高于隆突。
10. 准备灌输高达50微升的液体通过与凝胶装载枪头导管注入。放置在鲁尔毂的前端，但注入外表仔细观察在前端同步用鼠标的呼吸的流体的移动之前。然后注入滴注。
11. 用1ml注射器，立即做为0.6ml空气进入肺部相对快速充气穿过导管，以帮助分配液体深在肺部。拆下套管。
12. 拆下套管。
13. 用少量氰基丙烯酸酯类粘合剂的以关闭小外科伤口中为每个VetBond包装插页指示。将小鼠单独的笼子，并直观地监视他们，直到他们醒来，通常表现得没有任何迹象显示discomf的ORT。

2.肺固定

注意:一旦所有的实验过程中的小鼠进行，肺可以通过固定用甲醛（或任何其它期望的固定剂）被准备好进行组织学处理。

1. 牺牲鼠标的IACUC接受的过程。用于在视频显示代表鼠标，麻醉小鼠的颈脱位被使用。
2. 通过手术暴露气管腹侧，做一个小切口，并插入18G的存根针头插入气管，用线扎它进行气管造口术（如果尚未完成）。
3. 小心打开了中线切开胸腔，切开膈肌，并卸下侧面胸壁揭露肺部。
4. 针的接头末端连接到一个环形支架含甲醛水库。 参见图3。
5. 将甲醛的顶面25厘米以上的谅解备忘录的水平东南。 参见图3。下一步要确保没有在固定管没有空气通过运行流体出活塞的结束。连接气管套管到储存管的路厄氏端。打开活塞膨胀肺与甲醛。离开肺部压力下至少20分钟。
6. 打开活塞膨胀肺与甲醛。离开肺部压力下至少20分钟。
7. 接着，打结气管超出存根针的末端。它可以帮助拉回来慢慢针揭露更多uncannulated气管。当捆绑牢固，取出活塞。
8. 小心解剖出肺。
9. 将甲醛肺部过夜。较长的时间都很好，有的污渍或程序可以指定特定的时间。也任何其它液体固定剂，例如z修复可用于滴注和浸泡。
10. 在进一步的组织学处理，测量如下所述固定肺容积。

3.测量固定肺容积

1. 测量使用如图4阿基米德原理的肺容积。从甲醛卸下固定肺和解剖心脏和任何其他非肺组织。
2. 使用用于保持肺部完全在水下以前构造简单的自制线支撑装置。
   注:此装置需要进行与取平衡正在使用兼容。 图 5中所示的典型装置从塑料移液器和薄（20 G）的金属丝制成。这个系统可以很好地在视频中使用的平衡，但可以很容易地适应大多数实验室天平。
3. 放置一个烧杯≈200毫升水对水的平衡和皮与支撑笼到位。 参见图6中取出的金属笼子。将肺在水面上和下水按同笼。
4. 记录天平上的权重。这个数字反映了水置换的体积，因此是一个直接测量肺体积。要小心，以确保肺或缝合或部分铁丝笼不接触的侧面或烧杯底部。
5. 对于精度，重复这种测量。除去从水肺，并在组织干。再次重重的抽带保持架到位的烧杯中，重复肺容积测量。两个体积测量然后应平均。
   注:如果肺部留在福尔马林超过约一周，空气在肺部将溶解在液体中。当这种情况发生时，肺会下沉，所以不再需要使用任何设备作为图 5中，以保持浸没肺。在这种情况下，体积可以通过简单地进行测量通过保持肺由缝线串之一，直到它被完全淹没，如图4。

该过程描述在第一协议本身不导致任何广义的结果。这里只描述一个非常可靠的手段来灌输物质直接进入气管。 图7示出了其中锥虫蓝滴注用这里描述的方法的肺的一个例子。有染料的广泛分布，类似于已经看到的直接给出进入气管或小鼠11,12其他染料或示踪剂。我们也用这种方法来提供或者博莱霉素或弹性蛋白酶对肺，这导致广泛纤维化或肺气肿，分别。

用于量化在尸检肺部的结构变化中描述的方法提供了固定在25厘米H 2 O的压力肺卷上的数据这样的体积测量是必不可少的转化细胞或组织密度的后续公正的组织学测量到总人数10。本文仅德划刻，以获得非常精确的肺容积的装置。在10月12日9周龄健康Balb / c小鼠，我们测量的平均（±SD）为0.82±0.09毫升左肺体积为约30％的总的固定肺容积。在Balb / c小鼠给予胰弹性蛋白酶3 U（与本文中描述的方法），以产生实验肺气肿，肺固定体积增加至1.15±0.13毫升，用剩余的30％的左肺分数。

图1:静脉导管，用于灌注略微弯曲的尖端。

图2:倾斜的用于支持小鼠插管3环粘结剂该粘合剂设立持有3只小鼠。

图4:阿基米德的原理的水通过一个浸没物体位移的重量等于物体的体积。因为肺通常保留一些残余空气，一装置， 在图5中是需要保持完全淹没肺。

图5:实验室做支持保持肺部完全水下设备。塑料移液管和金属丝制成。

图6:用烧杯和配衡淹没设备准备好肺容积测量实验室天平。

图7:通过导管插管给台盼蓝肺的例子。

The procedures described here have several advantages. First the required equipment is simple and inexpensive. Second, the intubation can be quickly done with few errors. Third, the ability to fix the lungs at a constant pressure, and then measure the fixed lung volume allows proper quantification of structures or cells in the lung¹⁰.

One possible downside to the intubation is the minor surgery. This may limit the ability to repeat the procedure if a 2^nd instillation is required. However, with careful surgery and application of the adhesive we have been able to routinely do a second instillation a week or two later. If continuous repeated instillations are required or if repeated pulmonary function tests are needed, another intubation approach may be more desirable^13,14.

In doing the instillation, there are several practical issues that should be mentioned. It is important to be as gentle as possible with movement of the tongue in the initial opening of the mouth. If forceps are used, the tips should be covered with rubber tubing, since it is easy to injure the tongue, and this can lead to death of the mouse. Although the methods here were designed for intubation of mice older than 6 weeks, they could easily be adapted to younger mice.

Our instillation procedure was initially designed as an alternative to the method of oropharyngeal aspiration¹¹. While this latter method can be easily learned, the actual volume delivered to the lung remains uncertain, since some of the instillate remains in the pharynx and gets swallowed. With a direct instillation into the trachea and subsequent lung inflation as we demonstrate here, the instillate is directly delivered to the lung. It is worth noting that, although it is possible to use intubation to deliver substances directly to the trachea^11,12, such intubation can damage the upper airway or vocal chords, and in general requires a much higher level of training to ensure the 100% success rate that our procedure allows.

The fixation procedure we describe is similar to what many investigators use. There is often some variability in the inflation pressure used for the fixative, but we feel that 25 cm H₂O is a reasonable compromise that keeps the lung fully inflated without possible damage from over-inflation. It should be noted, however, that although it may seem that a lung inflated with fluid to 25 cm H₂O should be at a volume close to what the total lung capacity might be with air inflation at 35 cm H₂O, this is far from truth. In fact, the inflation with fixative generally results in a volume at 70% of the air lung capacity^15,16. And with subsequent processing with paraffin embedding, the effective lung volume viewed in histologic sections is likely below functional residual capacity (FRC). The most common fixative is formalin or z-fix, but for immunologic staining, a glutaraldehye mixture is often required. Investigators will need to choose a fixative depending on what is needing to be stained, but further discussion of the optimal fixative is beyond the scope of this methods paper.

In order to do proper quantitative analysis of histologic sections it is essential to have a measurement of lung volume¹⁰. Although it is possible to get lung volume from the complete sequence of serial sections (the Cavalieri method), in mouse lungs it is often simpler to simply measure the fixed lung volume as we have described in this document and video. The procedure we describe takes just seconds to do and should be routinely done with all lung fixations. Keep in mind, however, that the volume thus measured does not account for any shrinkage with subsequent processing and embedding, and if this is important, the Cavalieri method should be used. One final note regarding this fixed volume measurement is that the fraction of the lung volume in the left lung in the fixed lungs is significantly smaller than that which has been measured in vivo. CT imaging of the lungs in vivo of two strains of mice at functional residual capacity showed the left lung to be about 40% of the total¹⁷, whereas it is generally only 30% in the above measurements from lungs fixed at 25 cm H₂O. At the present time, we do not understand why this should be so different, but it should be kept in mind when analyzing changes in quantitative histologic analyses. With regard to studies of lung cancer, having a measurement of lung volume enables an investigator to properly normalize data on specific chemical desnsities or the density of various cell types to absolute numbers in the whole tumor or whole lung.

In summary, the intubation procedure describe here is inexpensive to fabricate and simple to use, and it should enable most investigators and laboratory technicians to quickly learn to successfully instill liquids into mouse lungs with relatively little experience. In addition, the fixation procedures and lung volume measurement for histologic analysis of lungs provide a means for proper repeatable and quantitative analysis of lung cells and lung structure.