采用经皮电神经刺激评估神经肌肉功能

摘要

我们提出了一种评估神经肌肉功能变化的实验方案。经皮电神经刺激是一种可诱发肌肉反应的非侵入性方法。通过分析这些反应的电生理学和机械特性，可对从大脑到肌肉的神经肌肉功能（包括脑-脊髓上、脊髓及外周水平）进行评估。

摘要

经皮电神经刺激是一种非侵入性方法，常用于评估从大脑到肌肉（包括脑-脊髓上、脊髓和周围水平）的神经肌肉功能。本方案描述了如何应用该方法刺激激活跖屈肌群的胫后神经。经皮电神经刺激通过向运动神经施加电刺激以诱发肌肉反应。可在静息状态下使用表面肌电图记录直接（M波）和/或间接（H反射）电生理反应。机械性反应（抽搐力矩）可通过力/力矩测功仪进行量化。M波和抽搐力矩反映神经肌肉传递及兴奋-收缩耦联功能，而H反射则提供脊髓兴奋性的指标。在最大自主收缩期间，也可记录肌电活动及机械性反应（叠加抽搐），以评估自主激活水平。经皮神经刺激可对人体神经肌肉功能进行评估，对于研究急性（疲劳）或慢性（训练/去训练）运动后神经肌肉可塑性的相关研究尤其具有重要价值。

引言

经皮电神经刺激被广泛用于评估神经肌肉功能¹。其基本原理是向外周运动神经施加电刺激，以诱发肌肉收缩。同时记录机械（扭矩测量）和电生理（肌电活动）反应。在目标关节处通过测力计记录扭矩。使用表面电极记录的肌电图（EMG）信号已被证实能够反映肌肉活动情况²。该非侵入性方法无痛感，且比肌内记录更易于实施。单极和双极电极均可使用。研究表明，单极电极构型对肌肉活动变化更为敏感³，这在小肌肉中尤为有用；而双极电极则在提高信噪比方面更为有效⁴，因此最常用于记录和量化运动单位活动。下文所述方法将重点介绍双极记录。肌电活动是神经肌肉系统功能效率与完整性的指标。采用经皮神经刺激可进一步揭示神经肌肉功能的变化，即肌肉、脊髓或超脊髓水平的改变（图1）。

图1：神经肌肉测量概述。 STIM：神经刺激。EMG：肌电图。VAL：自主激活水平。RMS：均方根。M_max：最大M波幅值。

静息状态下，复合肌肉动作电位（也称为M波）是在刺激伪迹之后观察到的短潜伏期反应，代表通过运动轴突直接激活肌肉所产生的可兴奋肌组织（图2，编号3）。随着刺激强度增加，M波振幅随之增大，直至达到其最大值的平台期。这一反应称为M_max，代表在表面肌电图电极下记录到的所有运动单位和/或肌纤维动作电位的同步叠加总和⁵。通过分析峰-峰振幅或波形面积的变化，可用于识别神经肌肉传导功能的改变⁶。与M波相关的机械反应（即峰值颤搐力矩/力）的变化，可能源于肌肉兴奋性或肌纤维内部特性的改变⁷。M_max振幅与峰值颤搐力矩振幅的比值（Pt/M比值）可作为衡量肌肉电-机械效率的指标⁸，即在给定电学运动指令下的机械输出能力。

图 2：神经刺激激活的运动与反射通路。 对混合性（运动/感觉）神经进行电刺激（STIM）可引起运动轴突和Ia传入纤维放电的去极化。Ia传入纤维向脊髓方向的去极化可激活α运动神经元，从而引发H反射反应（通路1+2+3）。根据刺激强度的不同，运动轴突的去极化会直接引起肌肉反应：M波（通路3）。在M波达到最大强度时，还会产生逆行性电流（3'），并与反射冲动（2）发生碰撞。该碰撞可部分或完全抵消H反射反应。

H反射是一种用于评估Ia-α运动神经元突触变化的电生理反应⁹。该参数可在静息状态或自主收缩期间进行评估。H反射是牵张反射的一种变体（图2，编号1-3）。H反射通过Ia传入通路单突触募集的运动单位被激活^10,11，并可能受到外周和中枢因素的影响¹²。诱发H反射的方法已被证实具有较高的个体内重复性，可用于评估静息状态下^13,14以及等长收缩期间¹⁵的脊髓兴奋性。

在自主收缩过程中，自主神经驱动的强度可通过肌电（EMG）信号的幅值进行评估，通常采用均方根（Root Mean Square, RMS）进行量化。RMS_EMG 常被用作量化自主收缩期间运动系统兴奋水平的指标（图1）。由于个体内部和个体之间的差异性¹⁶，RMS_EMG 需通过记录特定肌肉最大自主收缩时的肌电信号（RMS_EMGmax）进行归一化处理。此外，由于肌电信号的变化可能源于外周水平的改变，因此需使用外周参数（如M波）进行归一化，以单独评估肌电信号中的中枢成分。该归一化可通过将 RMS_EMG 除以M波的最大幅值或其均方根值 RMS_Mmax 来实现。推荐使用 RMS_Mmax 进行归一化（即 RMS_EMG/RMS_Mmax），因为此方法可考虑M波持续时间可能发生变化的情况¹⁷。

还可以通过计算自愿激活水平（VAL）来评估运动指令。该方法采用颤搐插补技术¹⁸，即在最大自主收缩期间叠加以 M_max 强度进行的电刺激。通过将神经刺激引起的额外转矩与在放松且处于强直状态的肌肉中施加相同神经刺激所产生的对照颤搐进行比较，从而评估激活水平¹⁹。为了评估最大 VAL，Merton 所描述的原始颤搐插补技术¹⁸涉及在自主收缩过程中插入单次刺激。近年来，成对刺激的应用日益广泛，因为与单次刺激相比，其诱发的转矩增量更大、更易检测且变异性更小²⁰。VAL 提供了中枢神经系统对工作肌肉进行最大激活能力的一个指标²¹。目前，采用颤搐插补技术评估的 VAL 是评估肌肉激活水平最有价值的方法²²。此外，利用测力计评估的峰值转矩是目前在科研和临床环境中应用最为广泛且研究最为充分的力量测试参数²³。

电刺激神经可用于多种肌群（例如 肘屈肌、腕屈肌、膝伸肌、跖屈肌）。然而，由于神经可及性的限制，该技术在某些肌群中应用较为困难。在文献中，跖屈肌群，尤其是小腿三头肌（比目鱼肌和腓肠肌），常被研究²⁴。事实上，这些肌肉参与了运动功能，因此具有特殊的研究价值。刺激部位与记录电极之间的距离使得可以识别小腿三头肌所诱发的不同波形。胫后神经在腘窝处位置较浅，且该肌肉含有大量肌梭，这使得相较于其他肌肉更易于记录反射反应²⁴。基于上述原因，本研究所介绍的反射方法主要针对小腿三头肌群（比目鱼肌和腓肠肌）。因此，本实验方案的目的是描述一种经皮神经刺激技术，用于评估小腿三头肌的神经肌肉功能。

方案

本实验方案已获得机构伦理批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。数据来自一位知晓实验流程并签署书面知情同意书的代表性受试者。

1. 仪器准备

1. 在电极安放位置剃除皮肤毛发，并用酒精清洁皮肤以去除污垢，确保获得低阻抗（<5 kΩ）。
2. 根据 SENIAM 建议³⁰，在腓肠肌内侧头肌腹最突出处、距腓骨小头至足跟连线的1/3处放置记录腓肠肌外侧头的电极、距腓骨远端尖端至内踝尖端连线的1/3处放置胫骨前肌电极；在股骨内侧髁至内踝连线的2/3处放置记录比目鱼肌的两个 AgCl 表面电极（记录直径为10 mm），电极中心间距为2 cm。
   注意：比目鱼肌的电极必须置于腓肠肌远端止点下方，以确保不会记录到腓肠肌肌头的肌电活动（避免串扰）。
3. 将参考电极置于同侧腿部的中央位置（位于刺激和记录位点之间）。
4. 调节座椅的高度和深度，使踝关节角度保持在90°（0° = 完全跖屈），以确保比目鱼肌和腓肠肌未被拉伸，且H反射不受影响^11,12。
   1. 由于腓肠肌为双关节肌，需将膝关节角度设定为90°（0° = 完全伸展）。然而，进行跖屈肌最大自主力矩测试时的最佳踝关节角度为70–80°（0° = 完全跖屈）²⁶。因此，踝关节角度的选择取决于研究参数（电生理记录或力学记录）。
      注意：无论选择何种初始角度，实验过程中必须保持恒定，以标准化神经肌肉兴奋性^11,12,27,28。
   2. 测试过程中需特别注意受试者的体位，以维持皮质-前庭系统对运动神经元池兴奋性的恒定影响²⁹。
5. 使用绑带将踝关节牢固固定于测力计上，使关节的解剖轴（外踝）与测力计的旋转轴对齐²⁵。
   1. 让受试者对连接在测力计上的脚踏板施加压力，以记录跖屈肌力矩。实验全程保持足部固定不动，以便检测微小的力矩变化。
6. 注意：在某些情况下，若足部和踝关节未充分固定，足跟可能轻微抬起离开测力板，导致力矩无法完全传递至测力板。图 3 展示了实验装置的示意图。

图3：实验装置。 用于记录肌电图（EMG）和扭矩信号的经典实验装置。

6. 使用电缆将电极连接到放大器。
7. 将力矩和肌电图（EMG）测量的采样率设置为 2–5 kHz。使用模数转换（AD）系统记录肌电信号。该信号通过数据采集系统显示在监视器上，可实时提供多个参数的数值（例如最大值、峰峰值幅度、持续时间）。肌电信号的频谱范围可在 5 Hz 至 2 kHz 之间，但主要集中在 10 Hz 至 1 kHz³¹。因此，采样频率必须足够高，以在肌电记录期间保持信号波形的完整性。使用 10 Hz 至 1 kHz 的带宽频率对肌电信号进行放大和滤波（增益 = 500–100）^8,21,32。
8. 将电刺激的阳极置于髌腱上方。
9. 使用手持式阴极球状电极在腘窝处寻找胫神经后支的最佳刺激位点，以在给定强度下获得最理想的腓肠肌 H 反射。通过阴极球状电极测试多个刺激位点，直至 H 反射达到最大值。
   1. 记录胫骨前肌的肌电活动，以确保未激活腓总神经，从而避免拮抗肌 Ia 传入神经的影响¹²。将脉冲宽度设为 1 毫秒，以实现神经纤维（尤其是传入纤维）的最佳激活¹⁰。
10. 在刺激位点处放置自粘式 AgCl 阴极，以确保刺激条件恒定（例如 压力、方向）。
    注意：所有这些参数（受试者体位、电极位置和刺激位点）在进行不同电生理测量评估时均保持不变。仅刺激强度和状态（静息 vs. 收缩）有所变化。

2. 静息状态下的测试流程

1. 指导受试者保持放松，使肌肉处于静息状态。
2. 调节刺激强度，以获得最大的腓肠肌H反射波幅（H_max；通常范围：20–50 mA）。在H_max强度下可观察到腓肠肌的M波。
   注意：对于重复测量（例如疲劳干预前和干预后），获得H_max反应的最佳刺激强度可能在实验过程中发生变化。由于保持恒定强度可能导致H_max波幅被低估，建议实验者定期重新评估H_max刺激强度³³。
3. 在此强度下至少记录3次腓肠肌H反射反应，每次刺激之间至少间隔3秒，以避免激活后抑制³⁴。
   注意：尽管由于H反射具有特殊敏感性，记录多次反应更为合适，但在某些情况下单次刺激可能已足够，例如为避免快速恢复效应时（例如在疲劳干预过程中）。
4. 增加刺激强度，以获得最大的腓肠肌M波波幅（M_max；通常范围：40–100 mA）。通常以2–4 mA为增量逐步增加刺激强度，两次刺激之间间隔8–10秒^12,35。当达到M_max且不再观察到H反射反应时，即达到所需强度。
5. 将最终刺激强度设定为M_max刺激强度的120–150%，以确保M波达到其最大值的平台期。在下文的操作说明中，该强度称为超最大强度。
6. 在整个实验过程中，保持腓肠肌M波记录时的刺激强度恒定。
7. 在此强度下记录3次腓肠肌M波及其对应的3次抽搐扭矩。

3. 自主收缩期间的测试流程

1. 作为热身，要求受试者对跖屈肌群进行10次短暂且不引起疲劳的次最大收缩，每次收缩之间休息数秒。热身结束后，至少休息1分钟，以避免任何疲劳效应¹¹。
2. 持续记录腓肠肌的肌电（EMG）活动。记录比目鱼肌和腓肠肌有助于分析在单一刺激位点下不同肌纤维类型的活动特征²⁴。
3. 指导受试者进行一次等长最大自主收缩（MVC），要求其通过收缩跖屈肌群尽可能用力地对抗测力计。在收缩过程中给予受试者视觉反馈和标准化的口头鼓励¹⁹。当观察到力矩达到平台期时，即判定为达到MVC。
4. 在MVC平台期期间，以超最大强度施加成对刺激（频率100 Hz）（叠加双脉冲），并在收缩结束后肌肉完全放松时立即施加另一次成对刺激（增强双脉冲），以评估自主激活水平。该成对刺激可通过特定设备（e.g. Digitimer D185 MultiPulse Stimulator）或与单脉冲刺激器配套的刺激程序来实施。
5. 指导受试者进行第二次跖屈肌MVC测试，每次试验之间至少休息1分钟¹¹。如果第二次试验的峰值力矩与第一次相差超过5%，则需追加试验³⁶。以受试者获得的最大力矩作为MVC力矩。

4. 数据分析

1. 静息状态下的数据分析
   1. 选择一个包含静息状态下与抽搐相关的肌电图（EMG）反应的时间窗口（H波或M波）。
   2. 测量波形的峰-峰幅值、峰-峰持续时间和/或波形面积（图4A）。如果软件未直接提供幅值，可通过最大值减去最小值得到。
      1. 对于持续时间，测量从波峰最大值开始到波谷最小值结束的时间段。对于面积，计算从波形起始到结束期间肌电信号的积分。
         注意：峰-峰幅值可反映：1）神经肌肉传递功能，2）运动单位动作电位幅值和/或3）运动单位动作电位的时间弥散³⁷。M波持续时间反映神经肌肉传导速度³⁷。
   3. 对于多次试验，计算波形的平均值。如果软件无法直接提供平均值，可使用电子表格软件（例如 电子表格程序中的公式功能）从多次试验（至少3次）中计算该值。
   4. 选择静息抽搐波形。
   5. 测量与静息抽搐相关的峰值扭矩（图4B）。
   6. 对于多次试验，计算静息抽搐的平均峰值扭矩。如果软件无法直接提供平均值，可使用电子表格软件（例如 电子表格程序中的公式功能）从多次试验（至少3次）中计算该值。
   7. 对其他所需参数（收缩时间或半舒张时间）重复步骤4.1.2所述过程。抽搐参数的分析可提示兴奋-收缩耦合效率¹⁷。特别是，收缩时间可作为收缩动力学的指标⁸，其可能因所选肌群的不同而有所差异³⁸。
   8. 使用电子表格软件（例如 Excel）计算峰值扭矩与M波总和之间的比值，以量化电-机械效率（P_t/M）。由于胫后神经刺激诱发的机械反应对应于腓肠肌整体的激活，因此必须将比目鱼肌和腓肠肌M波的幅值相加³⁹。

图 4：电生理与机械反应的说明。（A）典型 M 波的峰-峰幅度（mV）、潜伏期（ms）和面积（mV·ms）的测量。（B）一次抽搐的峰值抽搐力矩（Nm）、收缩时间（ms）和半松弛时间（msec）的测量。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 收缩期间的数据分析
   1. 选择在最大自主收缩（MVC）力矩平台期持续500毫秒的腓肠肌EMG活动时间窗，包含峰值力矩，但排除刺激伪迹至EMG静默期结束之间的时间段。静默期对应于刺激后自发性自主EMG活动的抑制。
   2. 如果软件未直接提供均方根（RMS）值，则使用以下公式⁴⁰计算RMS以量化EMG活动：RMS_EMG
      
   3. 测量或计算在静息状态下M_max波形持续期间的RMS值。
   4. 使用电子表格软件计算RMS_EMG/RMS_Mmax比值。RMS_EMG值和RMS_Mmax值必须来自同一肌肉。
   5. 从静息时的力矩基线到MVC的最大值之间测量MVC的最大峰值力矩，排除双脉冲刺激引起的叠加力矩（图5）。
   6. 测量在MVC期间由双脉冲刺激引起的叠加力矩，从刺激起始时刻的自主力矩值到诱发反应峰值之间的力矩变化（图5）。
   7. 选择增强后的双脉冲刺激。
   8. 测量与增强双脉冲相关的峰值力矩。
   9. 使用以下公式⁴⁰计算自主激活水平（VAL）：
      

图 5：机械信号上叠加双脉冲与强直后增强双脉冲的测量。 为记录叠加峰值力矩（Pts），需在等长最大自主收缩（MVC）平台期期间诱发电刺激双脉冲。为记录强直后增强峰值力矩（Pt_P），需在 MVC 结束后静息状态下诱发电刺激双脉冲。

结果

随着刺激强度的增加，H波与M波的反应幅度呈现出不同的变化趋势。在静息状态下，H反射在达到最大值后会完全从肌电图（EMG）信号中消失，而M波则逐渐增大，直至在最大刺激强度时达到平台期（M波的图形表示见图4，M波和H反射随刺激强度变化的趋势见图6）。对于腓肠肌而言，刺激开始至M波出现的潜伏期约为10毫秒（图4A），而H波的潜伏期通常在25至40毫秒之间。然而，由于刺激部位与肌肉之间的距离不同，潜伏期会因肌肉群、受试者肢体长度或整体身高的差异而有所变化。当以M-max强度进行刺激时，还可观察到最大峰值抽搐力矩（图4B）。M波、H反射及峰值抽搐力矩会因实验条件的不同而发生变化。例如，这些参数在自主收缩期间 tends to 增加，而在疲劳状态下 tends to 减少¹⁷。

讨论

经皮神经刺激能够量化神经肌肉系统的多种特性，不仅有助于理解健康人体神经运动功能的基本调控机制，还能分析由疲劳或训练引起的急性或慢性适应性变化¹⁷。这一点对于疲劳性实验方案尤为有利，因为在运动结束后必须尽快进行测量，以避免快速恢复过程对结果的影响⁴²。

尽管已有大量研究聚焦于腓肠肌复合体²⁴，但经皮神经刺激也可应用于其他下肢（例如胫骨前肌^43,44、股四头肌^45,46）和上肢肌肉（例如肱二头肌³²、桡侧腕屈肌⁴⁷、手部肌肉⁴⁸）。然而，对于某些肌肉而言，神经刺激可能存在潜在的方法学局限性。例如，在静息状态下获取肱二头肌的H反射可能较为困难⁴⁹。此外，在臂丛处刺激肌皮神经会导致主动肌和拮抗肌同时收缩³²，从而引起对自主激活水平的错误评估。记录邻近肌肉的电活动可使实验者确保仅目标肌肉被激活，或至少限制邻近肌肉的激活。为克服这些局限性，一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biodex测力计	Biodex Medical System Inc., 纽约, 美国		www.biodex.com
MP150 数据采集系统	Biopac Systems Inc., 戈莱塔, 美国
Acknowledge 4.1.0 软件	Biopac Systems Inc., 戈莱塔, 美国		www.biopac.com
DS7A 恒流高压刺激器	Digitimer, 赫特福德郡, 英国		www.digitimer.com
氯化银表面电极	Control Graphique Medical, 布里-科蒙-罗贝尔, 法国
计算机
1 根用于连接 Biodex 与 MP150 的电缆
1 根用于连接 Digitimer 与 MP150 的电缆
1 根用于连接 MP150 与计算机的电缆