一种“即插即用”方法制备含两亲性聚合物、有机染料和上转换纳米粒子的水分散性纳米组装体

摘要

有机染料分子和油酸包覆的上转换纳米颗粒不溶于水。本方案描述了一种“即插即用”方法，可将有机染料分子和上转换颗粒从其初始的疏水溶剂转移至水中。

摘要

在本实验方案中，我们首先描述了一种合成掺杂镧系元素的上转换纳米粒子（UCNPs）的方法，随后展示了如何制备两亲性聚合物 原位，并描述一种利用聚合物外壳包封已制备的上转换纳米粒子（UCNPs）及不同有机染料分子（卟啉和二芳基乙烯）以形成稳定水分散性纳米组装体的实验方案。含有UCNPs和二芳基乙烯有机染料的纳米组装体样品具有独特的光化学和光物理性质。在365 nm紫外光照射下，二芳基乙烯基团发生明显的颜色变化；当样品受到另一特定波长的可见光照射时，颜色逐渐褪去并恢复至初始无色状态。此外，当样品受到980 nm近红外光照射时，可观察到UCNPs发出可见光。通过交替使用紫外光和可见光照射，可调控样品的发光强度，且在多次循环操作中未观察到样品性能的明显衰减。该多功能封装方法可实现疏水性分子和纳米颗粒从有机溶剂向水相介质的有效转移。聚合物外壳为有机分子提供了类脂微环境，有助于维持其在水相中的光化学活性。因此，该方法非常适合制备水分散性光响应系统。利用近红外光激发上转换纳米粒子，可使用能量较低的光来触发光化学反应，避免了更具伤害性的紫外光的使用。

引言

目前，开发新型生物成像剂仍具有迫切需求。许多新型荧光探针已有详实文献记载。^1-6 然而，图像分辨率的显著提升仍是一项挑战。⁷ 一种可行的方法是直接调控荧光探针在“亮”发射态与“暗”淬灭态之间的转换。^8-12 该方法已被应用于发展诸如受激发射损耗（STED）显微镜¹³和随机光学重建显微镜（STORM）¹⁴等技术。

调控荧光的另一种方法是将光响应性发色团与荧光探针偶联。^15,16 通过在两种异构体之间切换光响应性发色团，其中仅有一种异构体可作为高效的能量转移受体，从而能够通过荧光共振能量转移（FRET）及其他机制控制探针荧光的猝灭。其结果是产生可发射荧光的状态和被猝灭的状态，这两种状态可通过将光响应性发色团暴露于不同波长的光下来实现交替转换。

光响应性二芳基乙烯发色团可在紫外光和可见光照射下，在无色的开环异构体与有色的闭环异构体之间可逆切换。^17-19 这两种异构体具有热稳定性，且闭环异构体的吸收光谱可调，使其成为可调控的荧光共振能量转移（FRET）受体的理想候选材料。^20-23 掺杂镧系元素的NaYF₄上转换纳米颗粒在生物成像中具有重要应用价值。²⁴ 这些纳米颗粒可吸收近红外光，并在可见光谱的多个区域发射光。本课题组此前已报道过将光响应性二芳基乙烯发色团与纳米颗粒结合以实现荧光调控的实例。^25-27 然而，每个实例中所描述的体系均需额外的合成修饰步骤，以将二芳基乙烯连接到纳米颗粒表面，这限制了更多样化体系的开发。

本文展示了一种利用自组装策略制备可水分散的有机染料分子和光响应上转换纳米粒子的简单“即插即用”方法。所选用的聚合物——聚（苯乙烯-alt-马来酸酐）和聚醚胺2070——可同时提供疏水和亲水环境。聚合物的疏水部分有助于将通常不溶于水的有机分子和上转换纳米粒子稳定包裹在一起，而聚合物的亲水区域则对维持其在水中的溶解性至关重要。我们首先通过热成核法演示上转换纳米粒子的合成过程；随后，通过将上转换纳米粒子、聚合物及不同有机染料分子的溶液简单共搅拌，再经过便捷的后处理步骤，证明了这些有机分子和上转换纳米粒子可被封装于聚合物壳层的疏水区域，并在水相介质中保持稳定。此外，我们还展示了如何通过外部光照调控这些组装体的荧光发射。我们预期，该“即插即用”方法在制备可水分散纳米组装体方面的应用范围将持续拓展。

方案

1. 上转换纳米粒子NaYF₄/Yb³⁺/Er³⁺的合成

1. 按照以下步骤搭建装置：
   1. 将一个 250 ml 的加热套放置在普通搅拌器上，并将加热套连接至热电偶。
   2. 将一个配有磁力搅拌子的 250 ml 圆底烧瓶稳妥夹持后置于加热套上。
   3. 将空气接头连接至圆底烧瓶的左侧颈口，并用塑料管将该空气接头连接至施兰克线（Schlenk line）。
   4. 将玻璃接头连接至圆底烧瓶的右侧颈口，并在玻璃接头上固定温度计接头。通过温度计接头将温度探针插入烧瓶内，并将其连接至热电偶。
   5. 将蒸馏头连接至圆底烧瓶的中间颈口。在蒸馏头上端塞上塞子。将蒸馏头依次连接至冷凝管、减压蒸馏接头和一个 50 ml 圆底烧瓶。通过塑料管将减压蒸馏接头连接至鼓泡器。 
2. 称取 1.17 g（3.9 mmol）乙酸钇、0.439 g 乙酸镱和 0.0727 g（0.1 mmol）乙酸铒，放入反应用圆底烧瓶中。
3. 使用量筒向烧瓶中加入 30 ml 油酸和 75 ml 十八烯。
4. 用 5 ml 甲醇冲洗反应圆底烧瓶的内壁，确保无油酸和十八烯附着在烧瓶壁上。
5. 将反应烧瓶连接至双歧管施兰克线，并打开相应阀门，使反应烧瓶与氮气管线保持连通。
6. 开启热电偶，将温度设定为 80 °C，逐步加热体系至该温度。当达到 80 °C 且所有起始原料完全溶解后，移去加热套，使反应体系冷却至 30 °C。
7. 当温度降至 30 °C 时，取下蒸馏头，将空气接头从左侧颈口转移至中间颈口，并用塞子封闭左侧颈口。通过旋转施兰克线上的阀门，将反应烧瓶从氮气管线切换至真空管线，缓慢引入真空。此时，反应体系中所有低沸点组分将被抽出。
8. 当溶液停止冒泡后，以 5 °C/min 的速率将温度升至 115 °C。
9. 当温度达到 115 °C 后，维持该温度 15 分钟，随后移去加热套，使反应冷却至 50 °C。之后，迅速将装置恢复至原始状态，即将蒸馏头重新连接至中间颈口，空气接头重新连接至左侧颈口。
10. 在冷却过程中，称取 0.74 g（12.5 mmol）NaOH 和 0.50 g（20.0 mmol）NH₄F，并通过超声处理将其溶解于 50 ml 甲醇中。
11. 超声完成后，将该溶液倒入反应圆底烧瓶中，并用 5 ml 甲醇冲洗烧瓶内壁。
12. 在 50 °C 下持续搅拌溶液 30 分钟。
13. 将温度升至 75 °C，以蒸馏除去甲醇。
14. 蒸馏过程中，必要时清空接收瓶。蒸馏结束后，尽快在氮气保护下将反应温度升至 300 °C。
15. 当温度达到 300 °C 后，维持该温度 1 小时。如有需要，可用铝箔包裹装置以帮助保温。随后移去热源，使反应自然冷却至室温。
16. 待体系冷却至室温后，将溶液均分为三份，分别加入三个离心管（50 ml 离心管，每管约含 35 ml 溶液），并用无水乙醇补足至 50 ml 刻度线。在 3,400 × g 条件下离心 15 分钟。离心后，上转换纳米颗粒（UCNPs）应以白色沉淀形式附着于离心管管壁。
17. 弃去上清液，将 UCNPs 沉淀重新分散于正己烷中（每管加入 7.5 ml 正己烷），再用乙醇补足至 50 ml 刻度线。再次在 3,400 × g 条件下离心 15 分钟。
18. 离心完成后，弃去上清液，将固体 UCNPs 重新分散于 30 ml CHCl₃ 中，以供后续使用。

2. 含有机染料分子和上转换纳米粒子的水分散性纳米组装体的组装

1. 将25 mg（0.0147 mmol）的聚（苯乙烯-alt-马来酸酐）（PSMA）溶解于3 ml CHCl₃中，置于带有磁力搅拌子的闪烁瓶内。此用量是经过多次试验优化后的结果。
2. 向闪烁瓶中加入250 µl（47 mg/ml）上转换纳米粒子的氯仿储备溶液。
3. 盖紧瓶盖，将其置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌2小时。
4. 称取160 mg（0.0773 mmol）聚醚胺2070，并将其溶于1 ml CHCl₃中。然后使用移液器一次性将该溶液加入闪烁瓶中。溶液将变为淡黄色，表明聚醚胺2070与PSMA上的酸酐基团发生了反应。
5. 继续在室温下搅拌过夜。
6. 量取适量的有机染料分子，一次性加入闪烁瓶中，搅拌所得溶液1小时。
   1. 对于样品TPP-NP（含有聚合物壳、四苯基卟啉和上转换纳米粒子的纳米组装体），直接向闪烁瓶中加入1 mg四苯基卟啉。对于样品DAE-UCNP（含有聚合物壳、二芳基乙烯分子和上转换纳米粒子的纳米组装体），每种二芳基乙烯分子的用量为2 × 10^-7 mol。将两种二芳基乙烯分子加入反应溶液中。两种二芳基乙烯分子的体积分别为：DAE-1o（1.8 mM），111 µl；DAE-2o（1.6 mM），125 µl。
7. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去CHCl₃溶剂，然后向闪烁瓶中加入3 ml 0.001 M的水相NaOH溶液（pH ≈ 11），超声处理直至形成乳白色悬浮液。
8. 将闪烁瓶重新置于旋转蒸发仪上，小心除去残留的CHCl₃，直至悬浮液转变为澄清溶液。
9. 将溶液从闪烁瓶转移至两个1.5 ml锥形离心管中，然后在20,600 × g下离心25分钟。
10. 弃去上清液，向两个离心管中总共加入3 ml去离子H₂O（每管1.5 ml），超声处理使沉淀重新分散于去离子H₂O中。
11. 再次将两个离心管在20,600 × g下离心25分钟。
12. 弃去上清液，向两个离心管中总共加入3 ml去离子H₂O（每管1.5 ml）。超声处理使沉淀重新分散于去离子H₂O中。
13. 将水相纳米粒子分散液样品通过0.2 µm针头滤器过滤，获得最终样品用于后续测试。

结果

对样品DAE-UCNP采集了吸收光谱和光致发光光谱。吸收光谱用于比较闭合态二芳基乙烯发色团与上转换纳米粒子之间的光谱重叠情况。还提供了样品（包括TPP-UCNP和DAE-UCNP）的照片，以证明有机染料分子和上转换纳米粒子成功封装于水相中的两亲性聚合物壳内。通过使用不同光源照射样品，还展示了光化学和荧光的调控效果。

化学中的“相似相溶”理论解释了为何将一份溶于氯仿的卟啉或上转换纳米粒子（UCNPs）加入水中后，即使剧烈振荡，两者仍保留在有机相中（图2，a，b，d和e）。然而，当采用“即插即用”封装方法（图1）时，可形成一种包含卟啉和UCNPs的水分散性纳米组装体（TPP-UCNP）。我们选择四苯基卟啉作为模型化合物进行研究，是因为它是一种不溶于水的有机化合物，并且在光动力治疗中具有重要的应用价值。当将含有该纳米组装体的水溶液加入氯仿中，即使剧烈振荡后，纳米组装体仍保留在水相中（图2，c和f）。使用两亲性聚合物外壳具...

讨论

根据本实验方案合成的纳米颗粒尺寸分布范围为20至25 nm，中心粒径约为22.5 nm^26,27。这些纳米颗粒可归类为具有α-NaYF₄基质晶格结构的球形颗粒。本方案中有两个关键步骤。在上转换纳米颗粒（UCNP）合成过程中，必须尽可能精确地控制加热温度和时间，以确保颗粒尺寸分布狭窄。在反应初期同时加入NaOH和NH₄F以及镧系离子，无法获得尺寸分布均匀且形貌良好的纳米颗粒。在加入NaOH和NH₄F后，需确保在足够长的时间内将温度维持在75 °C，以彻底蒸馏除去高沸点溶剂体系中的全部甲醇；蒸馏完成后，应尽快将温度升至300 °C，以控制纳米颗粒的尺寸²⁴。

在制备水分散性纳米组装体时，有时难以确定上转换纳米颗粒（UCNPs，步骤2.2）和有机分子（步骤2.6）的用量。一种建议是先使用少量的UCNPs（即 50 µl），然后逐渐增加此量直至达到阈值。根据我们的试验，10 mg 颗粒与 2 × 10^-7 mol有机分子是此类包封的最佳用量。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸钇	Sigma	326046	乙酸钇(III)水合物
乙酸镱	Sigma	544973	乙酸镱(III)水合物
乙酸铒	Sigma	325570	乙酸铒(III)水合物
油酸	Sigma	75096	分析标准品
十八碳烯	Sigma	O806	工业级
NaOH	Sigma	S5881	试剂级
NH4F	Sigma	216011	ACS试剂
聚(苯乙烯-co-马来酸酐)	Sigma	442399	平均Mn = 1700
JeffAmine 2070	Huntsman	M-2070
Varian Carry 300	Agilent
JDSU近红外激光器	JSDU	L4-9897510-100M	980 nm半导体激光器