本研究优化了一种详细的光学显微技术，用于实时观察和分析脉络丛上皮细胞纤毛的运动 离体 以及用于超微结构分析的电子显微镜方法。
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摘要
摘要
脉络丛位于脑室壁内，其主要功能被认为是产生脑脊液。覆盖在脉络丛组织表面的脉络丛上皮细胞（CPECs）具有多种独特的纤毛，但这些纤毛的大多数功能仍有待研究。为了揭示CPEC纤毛的功能，特别是与其运动性相关的作用，已建立了一种ex vivo观察系统，用于监测胚胎期、围产期和出生后时期的纤毛运动。将脉络丛从脑室中分离出来，并在配备微分干涉差光学系统的视频增强对比显微镜下进行观察。在此条件下，开发出一种简单且定量的方法，可在ex vivo状态下连续数小时分析CPEC纤毛的运动特征。接下来，通过扫描电子显微镜观察纤毛在发育过程中的形态学变化，以阐明纤毛形态成熟度与其运动性之间的关系。有趣的是，该方法能够清晰地显示纤毛数量和长度的变化，二者在出生后第2天（P2）达到峰值，而纤毛摆动频率则在P10达到最高，随后在P14突然停止。这些技术将有助于阐明纤毛在各种组织中的功能。尽管相关技术已在先前的报道中发表1，但本研究重点在于详细描述在ex vivo条件下观察CPEC纤毛运动性和形态学的具体技术方法。
引言
纤毛是大多数脊椎动物细胞表面的毛发状突起，因其与一类被称为纤毛病2–4的疾病相关而受到医学研究者的关注。尽管该细胞器广泛存在于各类细胞中，但已报道的纤毛功能多种多样，包括运动性和生物感应功能。例如，黏膜上皮表面的运动纤毛可将黏液5和上皮碎片转运至管道出口，从而通过清除上皮表面物质来预防疾病。此外，在早期发育期和胚胎阶段，纤毛可调控干细胞的增殖6，并参与决定脊椎动物身体的左右不对称性7。
脉络丛上皮细胞（CPECs）是神经上皮细胞的衍生物，覆盖在脑内脉络丛组织的表面，通过产生脑脊液（CSF）在维持颅内环境稳态中发挥重要作用。先前的研究已证明，CPECs具有多个非运动性纤毛，其纤毛上特异性富集G蛋白偶联受体，从而调控脑脊液的生成8。尽管这些纤毛曾被认为属于静止的非运动性纤毛，但研究发现部分CPEC纤毛在新生儿期会表现出短暂的运动性1。这一发现具有重要意义，因为它揭示了所谓的非运动性纤毛并非从发育初期就完全不动，而可能在特定的时间窗口内表现出短暂的运动性，这或许是对特定生理需求和功能的响应9。为了精确描述CPEC纤毛的运动特性，有必要建立一种涵盖CPEC纤毛独特动力学特征分析的ex vivo 观察系统。
关于运动性，尽管已有数份技术报告描述了气管上皮的运动纤毛5,10、运动型单细胞鞭毛11、所谓的传统运动纤毛12以及结节纤毛13的观察结果，但迄今为止，针对脉络丛等具有相对复杂波动结构的组织，尚缺乏详细的分析方法。此外，分析脉络丛上皮细胞（CPECs）的纤毛运动需要高时间分辨率，这通常依赖昂贵的高速摄像设备。为避免此类设备的依赖性，并简化对多种细胞类型纤毛运动的监测，研究人员已引入一种低成本高速摄像系统，并开发出一种简便易行的方法，用于记录运动纤毛的活动，特别是描述每根纤毛的运动速度与运动模式1。此外，本研究还使用了自主研发的图像分析软件“TI Workbench”，以促进对纤毛运动的深入分析。综上所述，该方法结合相关的扫描电子显微镜（SEM）技术，为纤毛运动研究提供了一种全新的简洁策略，可广泛应用于各类纤毛研究领域。
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方案
实验动物的方案和使用已获得山梨大学和早稻田大学机构动物护理与使用委员会的批准。动物护理工作均按照机构指南进行。
1. CPEC 准备
- 准备以下仪器和材料：体视显微镜（最好具备底部透射照明功能）、一对已火焰灭菌的钟表匠镊子（Dumont #3 或 #4）、直头手术剪刀（已火焰灭菌）、两个无菌的 10 cm 塑料培养皿（各含 20 ml 冰冷的 Leibovitz L-15 培养基）、35 mm 玻底培养皿（含 2 ml 室温 Leibovitz L-15 培养基）、一个 100 ml 烧杯（盛有 70% 乙醇）、新生小鼠幼崽。
- 将一只新生小鼠短暂浸入 70% 乙醇中，随后使用手术剪迅速断头处死。
- 立即将头部放入无菌 10 cm 培养皿中的冰冷 Leibovitz L-15 培养基内。
- 用钟表匠镊子去除颅骨表面的皮肤，切开颅骨以暴露脑组织，然后切断颅神经以完整分离脑组织。
- 将脑组织转移至另一含有冰冷 Leibovitz L-15 培养基的新培养皿中，在体视显微镜下观察，确保脑组织完全浸没在培养基中。
- 使脑组织背侧朝上放置，并调整方向，使嗅球位于三点钟位置（适用于右利手操作者），用左手镊子轻轻固定脑组织。
- 用右手持精细解剖镊（Dumont #3 或 #4），沿大脑纵裂切开胼胝体及连接大脑半球的下方实质组织。
- 轻柔地将大脑半球向两侧推开，暴露大脑横裂。
- 通过夹取半球与丘脑之间的实质组织，分离两个大脑半球。
- 轻柔地拉出附着于海马侧缘、由连合板（lamina affixa）连接的侧脑室脉络丛组织。
- 将分离出的脉络丛转移至含有新鲜 Leibovitz L-15 培养基的 35 mm 玻底培养皿中，并轻轻覆盖一个重物（见材料列表），以固定组织位置。
2. CPEC 纤毛的活体成像
- 确认使用适当的紫外（UV）和红外（IR）截止滤光片，以阻断波长短于 400 nm 和长于 700 nm 的光线，并确保中性密度（ND）滤光片（25% 和 6%）已插入倒置显微镜的光路中。
- 通过肉眼粗略调节物镜的焦距，然后调节聚光镜，使其中心和焦点符合科勒照明条件。在光路中插入合适的微分干涉差（DIC）棱镜、DIC 元件，以及检偏器和起偏器元件，以符合 DIC 光学系统的要求。
- 通过调节 DIC 棱镜的位置来调整视野对比度，使组织表面结构最清晰可辨。如果目标细胞的所有纤毛均处于运动状态，由于其运动，肉眼无法获得清晰的活动纤毛图像。
- 将光路切换至视频相机，并移除 ND 滤光片以增强光照强度。
- 使用相机的对焦模式调节视野和焦距。在对焦过程中，监视器上实时显示视频图像，此时无法获得清晰的活动纤毛图像。
- 以 200 Hz 的频率和 0.1 msec 的曝光时间进行拍摄，持续所需时间（数秒至数分钟）。图像序列采集完成后，单帧图像将显示清晰的纤毛结构。如果纤毛边缘模糊，应提高帧率或使用更短的曝光时间。
- 在处死动物后 25–60 分钟内，于 Leibovitz L-15 培养基中记录 CPEC 纤毛的运动情况。
3. 纤毛运动的分析
- 在计算机显示器上手动追踪每根纤毛的摆动模式。使用鼠标指针标记每一帧中纤毛尖端的位置，这些位置信息将被整合，以获得每根纤毛的运动轨迹。可使用相同软件分析轨迹信息，或导出至其他更通用的应用程序进行进一步分析。该分析步骤的效率在“讨论”部分中有所描述。
- 通过肉眼观察，将轨迹分类为两种运动模式：来回摆动或旋转运动。
- 使用以下公式计算纤毛摆动频率（CBF）：[CBF = (每秒帧数)/(单次摆动平均所需帧数)]14，该数值可从纤毛尖端运动图中获得（图3）。由于同一细胞上的其他纤毛可能干扰单根纤毛的运动，导致摆动不规则，因此需对多个纤毛摆动周期重复此计算。
- 为分析单个细胞内纤毛摆动轴的角分布均匀性，需为每条轨迹定义摆动角 θ（图4）。对于来回摆动的轨迹，将纤毛尖端位置拟合为一条直线，并将 θ 定义为该直线与 x 轴的夹角；对于旋转轨迹，则将位置拟合为一个椭圆，并将 θ 定义为椭圆长轴与 x 轴的夹角。拟合的具体方法在“代表性结果”部分中描述。
- 为对每条轨迹进行定量描述，计算广义长宽比 AR。简而言之，将轨迹旋转 -θ 角度，并将 AR 定义为沿 x 轴和 y 轴方向分布宽度的比值（图4B）。具体计算方法见“代表性结果”部分，该参数的解释、意义及局限性在“讨论”部分中说明。
4. 扫描电镜样品制备
注意：扫描电镜（SEM）是一种全面评估脉络丛上皮细胞（CPECs）纤毛状态的重要方法。制备SEM样品时，采用先前报道的标准流程15，并稍作修改。
- 在从脑组织中解剖组织之前，先在带有聚乙烯盖的5 ml玻璃小瓶中配制固定液。固定液由0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的2%多聚甲醛和2.5%戊二醛（半量Karnovsky溶液16）组成。
- 按照步骤1所述方法从脑组织中解剖出目标组织。
- 在新的培养皿中用Hank’s平衡盐溶液（HBSS）短暂漂洗分离的组织，然后将组织放入玻璃小瓶中的固定液中，在室温下固定1小时。使用一次性移液管并轻柔操作样本。在HBSS中漂洗后，组织会变得黏稠。
- 为将样本转移至固定液中，缓慢从移液管中挤出含有组织的少量溶液形成液滴，并加入固定液中。
- 固定完成后，弃去固定液，并用磷酸盐缓冲液冲洗组织三次。
- 将组织浸入10%蔗糖溶液中以洗去残留的醛类。为确保醛类完全去除，先将样本在溶液中浸泡10分钟，随后更换新鲜的10%蔗糖溶液重复此步骤两次。此步骤对后续充分进行后固定至关重要。
- 将组织浸入含1%四氧化锇的磷酸盐缓冲液中固定30分钟，然后置于冰上进行后固定。通过观察样本颜色判断锇化程度：当醛类完全去除后，样本呈黑色。
- 用双蒸水对后固定的组织样本进行多次充分漂洗。
- 将样本依次浸入梯度浓度的乙醇中进行脱水，通常为65%、75%、85%、95%、99%和100%，每种浓度各10分钟。通过将分子筛放入新开启的99.5%乙醇中制备无水乙醇。用无水乙醇重复脱水步骤三次。
- 将脱水后的样本放入乙酸异戊酯中（作为临界点干燥的置换试剂）10分钟。重复此步骤两次。该试剂挥发迅速，样本可能因干燥而受到表面张力破坏。因此，切勿使样本完全干燥。
- 在最后一次更换乙酸异戊酯后，移除大部分溶剂，立即用铝箔包裹敞口的玻璃小瓶，并将小瓶置于干冰上。使用针头或细镊子在覆盖瓶口的铝箔上戳数个小孔，以便在临界点干燥器中液态二氧化碳能顺利进入小瓶。下一步操作应尽快进行。
- 在此步骤中，应尽量减少乙酸异戊酯带入干燥室，但在临界点干燥前切勿让样本完全干燥。此外，避免将样本在干冰上放置过久，以防小瓶表面结霜。
- 将包裹铝箔的装有组织样本的玻璃小瓶转移至临界点干燥器中，以在去除组织内水分的同时保持其表面结构完整。有关临界点干燥器操作的详细信息可参阅制造商说明书。
- 使用牙签小心操作样本，以尽量减少机械损伤。所得干燥组织样本较为脆弱。将样本固定在金属样品台（stub）上，并使用离子溅射仪镀上金-钯合金涂层。
5. 扫描电镜观察
- 通过扫描电镜观察，并使用配备在扫描电子显微镜上的数字相机记录图像。
- 将数字图像数据传输至计算机进行分析。
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结果
工作流程概览见图1，其中包括设备的图像。
CPECs 的活体运动观察
视频 1 展示了从围产期小鼠中分离的脉络丛上皮细胞（CPECs）的动态影像，视频 2 展示了 视频 1 中图像的放大视图。需要注意的是，与视频相比，静态图像中单根纤毛尖端的细节较不清晰。图 2 展示了根据 视频 1 和 视频 2 所示数据追踪的两根纤毛的运动轨迹，这两根纤毛分别表现出摆动和旋转两种不同的运动模式。图 3 展示了对纤毛运动轨迹的简单分析，其中在旋转运动中，两个坐标轴之间的相位差明显可见。
CPEC 纤毛尖端轨迹分析
定量分析每条轨迹的详细方法如
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讨论
该方法的展望
尽管此处描述的技术并未比先前发表的方法提供更详细的纤毛分析，但该技术的意义在于系统的简便性和成本效益，可轻松应用于任何类型的纤毛运动能力筛选 离体特别是，TI Workbench 提供了一个简单且用户友好的界面，使研究人员能够更轻松地观察和分析纤毛运动。目前尚未开发出针对视频增强差分干涉对比显微（video-enhanced contrast-DIC）中无染色纤毛等低对比度物体的有效自动追踪方法。尽管该技术中的纤毛运动追踪为手动操作，但与使用通用图像分析软件包相比，纤毛运动追踪分析所需的工作量已得到最优减少。
样品解剖
准备 离体 CPEC 样本需要快速且轻柔的操作，以保持组织的活性，从而确保纤毛的运动能力 离体由于红细胞污染会模糊观察视野，因此强烈建议用磷酸盐缓冲液对分离的组织进行轻柔而细致的冲洗。为避免出血，操作时需小心谨慎，防止撕裂附着于脉络丛胶质层上的后脉络动脉，该动脉可辨认为一条明显的红褐色丝状...
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。本文旨在报告在分离的脉络丛组织中观察纤毛运动的详细方法学。相关科学创新已在先前的研究中报道1,8。
致谢
本工作得到了日本文部科学省（MEXT）私立大学研究支援项目：配套资金补助（T.I.）以及日本文部科学省（MEXT）科学研究费补助金（C类）（S.T. 和 K.N.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活细胞成像所需试剂 | |||
| 用于活细胞成像 | |||
| 乙醇 | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 培养基 | Life Technologies | 11415-064 | |
| 用于扫描电镜（SEM）样品制备 | |||
| 乙醇 | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's 平衡盐溶液 | Life Technologies | 14170112 | |
| 多聚甲醛 | Merck | 1040051000 | |
| 戊二醛 | Nacalai Tesque | 17003-05 | |
| 乙酸异戊酯 | Nacalai Tesque | 02710-95 | |
| 分子筛 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | 用于无水乙醇的制备 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液 | 配制 100 ml 时，混合 19.0 ml 的 0.1 M NaH2PO4 与 81.0 ml 的 0.1 M Na2HPO4 | ||
| 磷酸二氢钠（二水合物） | Nacalai Tesque | 31718-15 | |
| 磷酸氢二钠（无水） | Nacalai Tesque | 31801-05 | |
| 蔗糖 | Nacalai Tesque | 30406-25 | |
| 四氧化锇 | Nisshin EM | 300 | |
| 干冰 | |||
| [header] | |||
| 解剖用工具与材料 | |||
| 适用于活细胞成像与扫描电镜（SEM）样品制备 | |||
| 体视显微镜 | Olympus | SZX7 | |
| 平铺纸巾 | |||
| Φ10 cm 塑料培养皿 | |||
| 100 ml 烧杯 | |||
| 直头手术剪 | Sansyo | S-2B | |
| 钟表镊 | Dumont | No.DU-3 或 -4, INOX | |
| 用于活细胞成像 | |||
| 玻璃底培养皿 | Matsunami Glass | D110300 | |
| 用于扫描电镜（SEM）样品制备 | |||
| 铝箔 | |||
| 带聚乙烯盖的 5 ml 玻璃小瓶 | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| 移液管 | Samco Scientific | SM251-1S | 用于样品转移 |
| 牙签 | 用于样品转移 | ||
| 金-钯离子溅射仪 | Hitachi | E-1030 | |
| 临界点干燥仪 | Hitachi | HCP-2 | |
| [header] | |||
| 显微镜设备与材料 | |||
| 用于活细胞成像 | |||
| 倒置显微镜 | Olympus | IX81 | |
| 100 W 汞灯灯箱及电源 | Olympus | U-ULH 和 BH2-RFL-T3 | |
| 100 W 汞灯 | Ushio | USH103D | |
| DIC 聚光镜，数值孔径 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| 电子快门 | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 和 VMM-D1 | 可使用手动快门 |
| 带通滤光片（400–700 nm，Φ45 mm） | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| 中性密度滤光片（ND 滤光片，Φ45 mm） | Olympus | 45ND6, 45ND25 | 使用 25% 与 6% ND 滤光片组合 |
| 带 DIC 元件的物镜（水浸） | Olympus | UApo 40XW/340, 数值孔径 1.15，配 IX-DPAO40 | |
| 高速摄像机 | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz 帧率，1 毫秒曝光时间 |
| 图像采集与分析软件 | 内部开发软件 | TI Workbench | 具备高帧率采集能力 |
| 摄像机控制与分析用计算机 | Apple | Mac Pro | |
| 防振台 | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| 组织固定重物 | Warner Instruments | 切片锚定套件 | 可用 U 形压扁的 Φ0.5 mm 铂丝粘附尼龙网自制 |
| 盖玻片（组织固定的替代重物） | Matsunami | 定制 | 盖玻片可用作组织固定重物 |
| 用于扫描电镜（SEM） | |||
| 倒置显微镜 | Olympus | IX81 | |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-6510 |
参考文献
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