结合穿梭箱训练与皮层电生理记录及刺激作为研究感知与学习的工具

摘要

穿梭箱回避学习在行为神经科学中已有充分研究。本方案描述了如何将啮齿类动物的穿梭箱学习与特定脑区的皮层内微刺激（ICMS）以及同步的慢性体内记录相结合，作为一种研究学习与感知多个方面的工具。

摘要

穿梭箱回避学习是行为神经科学中一种成熟的研究方法，传统的实验装置通常为自行搭建；目前已有多家商业公司提供所需的设备。本方案详细描述了一种在啮齿类动物（此处为蒙古沙鼠；Meriones unguiculatus）中进行的双向穿梭箱回避学习范式，结合了特定脑区的皮层内电微刺激（ICMS）以及同步的慢性电生理体内记录技术。该详细方案适用于研究不同啮齿类物种学习行为与感知的多个方面。

将听觉皮层回路中特定位置的ICMS作为条件刺激，可用于检验特定传入、传出及皮层内连接的感知相关性。通过使用不同的刺激电极阵列，可诱发局部、分层依赖的ICMS或远距离ICMS位点的独特激活模式。结合行为信号检测分析，可确定哪种刺激策略最能引发可被行为检测且具有显著性的信号。此外，采用不同电极设计（如表面电极、深部电极等）进行并行多通道记录，可实现对学习过程中神经活动指标的时间动态研究。本文还将探讨如何通过改变行为实验设计来增加认知复杂性（例如，检测、辨别、反转学习）。

引言

行为神经科学的一个基本目标是建立神经元结构与功能特性、学习以及感知之间的特定联系。通过在多个位点对不同脑区的动作电位和局部场电位进行电生理记录，可以研究与感知和学习相关的神经活动。虽然电生理记录能够揭示神经活动与行为之间的相关性，但一个多世纪以来，直接的皮层内微刺激（ICMS）始终是检验被激活神经元群体与其行为及感知效应之间因果关系的最直接方法^1–3。大量研究表明，动物能够在感知任务中利用不同空间和时间特性的电刺激，具体表现取决于刺激位点，例如皮层中的视网膜拓扑⁴、听觉拓扑⁵或躯体拓扑⁶区域。电刺激在皮层中引发的活动传播主要由轴突纤维的分布及其突触连接模式决定²，而这种连接在皮层中具有明显的层依赖性⁷。因此，由ICMS引发的多突触激活范围远比电场的直接作用广泛得多^2,8,9。这也解释了为何通过皮层内微刺激引发的感知效应阈值在不同皮层层段^8,10,11和不同刺激位点⁹上表现出显著差异。最近一项研究详细表明，对上层皮层的刺激主要在颗粒上层引发更广泛的大脑皮层间回路激活，而对深层皮层的刺激则导致局灶性、反复的皮层传出柱内激活。并行的行为实验进一步揭示，后者具有显著更低的感知检测阈值⁸。因此，在穿梭箱实验中，利用位点特异性的ICMS作为条件刺激，....

方案

本研究中所进行的所有实验均符合德国实验动物保护法所规定的伦理标准，并已获得萨克森-安哈尔特州伦理委员会的批准。

1. 用于微刺激与记录的定制多通道电极阵列

1. 定制微刺激阵列
   1. 为进行颅内微刺激（ICMS），使用长度为3 cm的聚四氟乙烯绝缘不锈钢丝，按照所需的空间构型（此处为包含2个通道的侧向阵列）制备刺激电极（Ø 隔离度 = 50 µ米）。参见 图2.
   2. 将导线一端压接至公针系统（1.25 mm 间距）。
   3. 对于一个双通道阵列，电极间距约为0.5 mm或0.7 mm，将导线以垂直方向穿过两个垂直对齐的透射电镜载网（载网间距约5 mm），用于引导导线（导线间距0.1654 mm）。
   4. 在导线末端上方约4毫米处（该位置最终作为电极尖端），用一滴牙科丙烯酸胶将导线粘合在一起。
   5. 将公端插针插入插头外壳中。
   6. 将电极放入盛有电解液的培养皿中（例如， 0.9% 氯化钠）并使用相应的阻抗测量设备测量每个通道的阻抗（例如，FHC 阻抗调节模块）。目标阻抗范围为 100 至 500 kΩΩ 范围
      1. 如果阻抗过高，通过通道施加短暂的电流通电（1秒，1 mA）以降低阻抗。再次检查阻抗。
   ....

结果

本部分展示了一例蒙古沙鼠在穿梭箱中进行学习的代表性实验。实验对象被训练以区分两个植入听觉皮层、相距700 µm的刺激电极所对应的ICMS位点（图1和图2）。刺激电极阵列可根据不同空间设计进行定制（图1）。在此实验中，动物在3次训练阶段内即学会了区分这两个ICMS位点，每次呈现30次条件刺激+（CS+）和条件刺激-（CS-）（图3A-C）。这一点由连续7次训练阶段中，正确击中（hit）与虚报（false alarm）反应的条件反应（CR）率之间稳定且显著的差异所表明（图3B）。相应地，在这些训练阶段中，辨别力指标d’ >1（图3C）。对非条件刺激（US）的快速逃避潜伏期至关重要，因其反映了有效的厌恶性非条件反应。通过从200 µA开始，以50 µA为步长逐步调整足底电击强度，直至逃避潜伏期较短，即可确保该反应的有效性（见图3E）。同时，通过ECoG阵列进行的电生理记录，可用于评估由相距约700 µm的皮层内电刺激（CS+或CS-）所诱发的.......

讨论

本方案描述了一种在学习动物中利用双向厌恶足底电刺激控制的穿梭箱系统，同时进行位点特异性皮层内微刺激（ICMS）和多通道电生理记录的方法。该方案强调了实现此类技术组合的关键要点，并指出应仅通过动物的公共接地电极实现接地，而使网格地板处于浮空电压状态。在此研究中，采用听觉穿梭箱学习范式应用于蒙古沙鼠，因为这些动物听觉皮层与学习相关的可塑性重组已被广泛研究^{8,12,14,15,21,22}。然而，本方案经过少量修改后也可适用于其他啮齿类动物，例如小鼠¹⁶。在此过程中，需考虑不同物种在手术后恢复时间（2.17）、障碍物高度（2.1.1）以及个体动物对足底电刺激的敏感性（3.1.3–3.1.6）等方面的特异性差异，其中电刺激敏感性可能具有高度变异性。

该方案进一步详细阐述了如何利用定制电极设计刺激皮层组织中的不同位点，从而引发不同的神经网络激活，这些结论源自同步电生理多电极记录的分析结果。^8,23根据电极间距的不同，可以刺激不同区域，例如拓扑图中的各个区域⁹通过应用层依赖性ICMS，可以选择性地激活长距离皮.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚四氟乙烯绝缘不锈钢丝	California Fine Wire		直径 50µm，带绝缘层
针式连接器系统	Molex Holding GmbH	510470200	1.25 mm 间距 PicoBlade
TEM 网格 Quantifoil	Science Services	EQ225-N27
牙科丙烯酸树脂 Paladur	Heraeus Kulzer	64707938
手持式钻机 OmniDrill35	WPI	503599
氯胺酮 500 mg/10 ml	Ratiopharm GmbH	7538837
隆朋 2%，25 ml	Bayer Vital GmbH	5066.0
氯化钠 0.9%，10 ml	B.Braun AG	PRID00000772
润滑剂 KY-Jelly	Johnson & Johnson
穿梭箱 E10-E15	Coulbourn Instruments	H10-11M-SC
刺激发生器 MCS STG 2000	Multichannel Systems
Plexon 头戴式电缆 32V-G20	Plexon Inc.	HSC/32v-G20
Plexon 头戴式装置  32V-G20	Plexon Inc.	HST/32v-G20
PBX 前置放大器 32 通道	Plexon Inc.	32PBX box
多通道采集系统	Plexon Inc.	MAP 32/HLK2
冷冻切片机 CM3050 S	Leica Microsystems GmbH
信号处理卡 Ni-Daq	National Instruments
Lab StandardTM 立体定位仪	Stoelting Co.
音频衰减器 g.pah	g.pah Guger technologies
醋酸克里西林紫	Roth GmbH	7651.2
Roticlear	Roth GmbH	A538.1
三水合醋酸钠	Roth GmbH	6779.1
三水合六氰合铁(II)酸钾	Roth GmbH	7974.2
二水合磷酸氢二钠	Merck	1,065,801,000
ICM 阻抗调节模块	FHC	55-70-0
动物体温控制器	World Precision Instruments	ATC2000