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方法文章

结合穿梭箱训练与皮层电生理记录及刺激作为研究感知与学习的工具

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⸱

DOI：

10.3791/53002

⸱

2015年10月22日

 ,  , 
1Leibniz Institute for Neurobiology, Magdeburg, Germany, 2Otto-von-Guericke University, Magdeburg, Germany, 3Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS), Magdeburg, Germany

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

穿梭箱回避学习在行为神经科学中已有充分研究。本方案描述了如何将啮齿类动物的穿梭箱学习与特定脑区的皮层内微刺激（ICMS）以及同步的慢性体内记录相结合，作为一种研究学习与感知多个方面的工具。

摘要

穿梭箱回避学习是行为神经科学中一种成熟的研究方法，传统的实验装置通常为自行搭建；目前已有多家商业公司提供所需的设备。本方案详细描述了一种在啮齿类动物（此处为蒙古沙鼠；Meriones unguiculatus）中进行的双向穿梭箱回避学习范式，结合了特定脑区的皮层内电微刺激（ICMS）以及同步的慢性电生理体内记录技术。该详细方案适用于研究不同啮齿类物种学习行为与感知的多个方面。

将听觉皮层回路中特定位置的ICMS作为条件刺激，可用于检验特定传入、传出及皮层内连接的感知相关性。通过使用不同的刺激电极阵列，可诱发局部、分层依赖的ICMS或远距离ICMS位点的独特激活模式。结合行为信号检测分析，可确定哪种刺激策略最能引发可被行为检测且具有显著性的信号。此外，采用不同电极设计（如表面电极、深部电极等）进行并行多通道记录，可实现对学习过程中神经活动指标的时间动态研究。本文还将探讨如何通过改变行为实验设计来增加认知复杂性（例如，检测、辨别、反转学习）。

引言

行为神经科学的一个基本目标是建立神经元结构与功能特性、学习以及感知之间的特定联系。通过在多个位点对不同脑区的动作电位和局部场电位进行电生理记录，可以研究与感知和学习相关的神经活动。虽然电生理记录能够揭示神经活动与行为之间的相关性，但一个多世纪以来，直接的皮层内微刺激（ICMS）始终是检验被激活神经元群体与其行为及感知效应之间因果关系的最直接方法1–3。大量研究表明，动物能够在感知任务中利用不同空间和时间特性的电刺激，具体表现取决于刺激位点，例如皮层中的视网膜拓扑4、听觉拓扑5或躯体拓扑6区域。电刺激在皮层中引发的活动传播主要由轴突纤维的分布及其突触连接模式决定2，而这种连接在皮层中具有明显的层依赖性7。因此，由ICMS引发的多突触激活范围远比电场的直接作用广泛得多2,8,9。这也解释了为何通过皮层内微刺激引发的感知效应阈值在不同皮层层段8,10,11和不同刺激位点9上表现出显著差异。最近一项研究详细表明，对上层皮层的刺激主要在颗粒上层引发更广泛的大脑皮层间回路激活，而对深层皮层的刺激则导致局灶性、反复的皮层传出柱内激活。并行的行为实验进一步揭示，后者具有显著更低的感知检测阈值8。因此，在穿梭箱实验中，利用位点特异性的ICMS作为条件刺激，并结合电生理记录，可因果性地将特定皮层回路的激活8与学习和感知的行为测量指标关联起来。

双向穿梭箱范式是一种广泛使用的实验室装置，用于研究回避学习12。穿梭箱由两个隔间组成，中间以障碍物或门道分隔。一个代表适当信号（如光或声音）的条件刺激（CS），会伴随性地引发一种令人厌恶的非条件刺激（US），例如通过金属网格地板施加足底电击。受试者可通过在CS出现时从一个隔间穿梭至另一个隔间，从而学会避免US。穿梭箱学习包含一系列可区分的学习阶段13,14：首先，受试者通过经典条件反射学会由CS预测US，并通过操作式条件反射学会在US出现后通过穿梭行为终止US，实现逃避。在下一阶段，受试者学会在US出现 之前，仅对CS作出反应而穿梭，从而完全避免US（回避反应）。通常情况下，穿梭箱学习在不同学习阶段涉及经典条件反射、操作式条件反射以及目标导向行为14。

穿梭箱实验操作简便，通常经过几天的每日训练后即可产生稳定的行为反应15–17。除了可用于简单的回避条件反射（检测）外，穿梭箱还可通过采用“执行/不执行”范式进一步研究刺激辨别能力。在此范式中，动物被训练在条件刺激（CS+）出现时，通过条件反应（CR）（执行行为；穿梭至对侧隔间）来避免非条件刺激（US）；而在非条件刺激（CS-）出现时，则表现为不执行行为（停留在当前隔间；无条件反应）。利用高密度多电极阵列进行并行微刺激与神经活动记录，可深入研究成功学习背后的生理机制。本文将讨论穿梭箱训练、ICMS 与并行电生理记录成功结合所涉及的若干关键技术细节。

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方案

本研究中所进行的所有实验均符合德国实验动物保护法所规定的伦理标准，并已获得萨克森-安哈尔特州伦理委员会的批准。

1. 用于微刺激与记录的定制多通道电极阵列

  1. 定制微刺激阵列
    1. 为进行颅内微刺激（ICMS），使用长度为3 cm的聚四氟乙烯绝缘不锈钢丝，按照所需的空间构型（此处为包含2个通道的侧向阵列）制备刺激电极（Ø 隔离度 = 50 µ米）。参见 图2.
    2. 将导线一端压接至公针系统（1.25 mm 间距）。
    3. 对于一个双通道阵列，电极间距约为0.5 mm或0.7 mm，将导线以垂直方向穿过两个垂直对齐的透射电镜载网（载网间距约5 mm），用于引导导线（导线间距0.1654 mm）。
    4. 在导线末端上方约4毫米处（该位置最终作为电极尖端），用一滴牙科丙烯酸胶将导线粘合在一起。
    5. 将公端插针插入插头外壳中。
    6. 将电极放入盛有电解液的培养皿中（例如， 0.9% 氯化钠）并使用相应的阻抗测量设备测量每个通道的阻抗（例如，FHC 阻抗调节模块）。目标阻抗范围为 100 至 500 kΩΩ 范围
      1. 如果阻抗过高，通过通道施加短暂的电流通电（1秒，1 mA）以降低阻抗。再次检查阻抗。
  2. 定制高分辨率多通道记录电极阵列
    注意：本方案描述了用于记录皮层脑电图（ECoG）数据的表面电极阵列的制备方法。然而，设计可根据具体研究问题的需求进行调整（如深部记录等）。高分辨率多通道电极阵列由聚四氟乙烯（Teflon）绝缘的不锈钢丝制成Ø 隔离度 = 50 µm) 压接至公针系统（1.25 mm 间距）。
    1. 对于表面电极阵列，将18根导线穿过两个预先准备好的电子显微镜载物台网格组成的3×6矩阵。
    2. 将6×3排列的导线嵌入网格之间，并用牙科丙烯酸树脂固定，然后将插脚插入插头外壳中。
    3. 使用手持电钻上安装的研磨头将牙科丙烯酸树脂研磨成矩形块状。
    4. 检查所有通道的阻抗（参见1.1.6）是否在100–500 kΩ范围内Ω.
    5. 在植入前（见步骤2），研磨阵列表面以匹配皮层表面的凸度。

2. 在麻醉的蒙古沙鼠听觉皮层中植入阵列用于长期使用的手术方法

  1. 持有执行所有计划中必要实验步骤的正式批准。 穿戴适当的防护服（外套、无菌手套、外科口罩、头罩）。
  2. 使用成年雄性蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）或其他任何啮齿类动物。 佩戴防护手套和防护服，并始终使用经过灭菌且标识清晰的手术器械。
  3. 对于沙鼠，通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）的混合物，该混合物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释。通过输注维持麻醉，输注速度为0.6 ml/hr/kg，输注液为氯胺酮:赛拉嗪:氯化钠（0.9%）按9:1:10比例配制的混合液。
  4. 将动物置于加热板上，通过直肠探头反馈系统维持体温在37 °C（例如，World Precision Instruments）。
  5. 剃除覆盖枕骨、顶骨和颞骨区域的毛发。使用有效的消毒剂无菌处理切口部位（例如，交替使用碘伏或诺瓦森和70%酒精进行三次擦拭）。 使用眼膏保护眼睛，防止干燥。
  6. 使用手术刀切开覆盖枕骨、顶骨和额骨的颅骨皮肤，并通过在骨表面轻轻移动牙科钻头去除骨膜。
  7. 在对侧顶骨和额骨尽可能靠外侧的位置钻小孔，以避免妨碍后续头部固定装置的安装。然后将两个直径约1 mm的骨螺钉牢固地拧入孔中。确保顶骨螺钉与硬脑膜良好接触，因其将作为公共参考电极和接地电极，并在后续电刺激中作为回路电极。
  8. 在额骨上方中线位置粘接一根小型铝条，并在植入过程中通过头部固定器将其用作头部固定点。
  9. 使用剪刀去除一侧覆盖Musculus temporalis（颞肌）的皮肤。
  10. 切除颞肌的背侧部分，以暴露颞骨。
  11. 使用牙科钻头在颞骨上进行开颅（约3 mm × 4 mm），暴露听觉皮层。根据典型的脑血管分布特征确定听觉皮层的位置18,19。
  12. 在脑内植入刺激电极的位置，使用微型手术刀小心切开硬脑膜。沿表面轻轻移动，直至硬脑膜撕裂，以避免损伤下方的神经组织。
  13. 在显微操作器控制下插入刺激电极阵列。选择切向插入角度，以便将硬膜外阵列放置在目标区域上方。根据插入角度、位置及目标刺激位点，仔细考虑插入深度。
  14. 使用第二个显微操作器，将硬膜外表面记录阵列紧密贴合地放置在目标脑区（此处为听觉皮层）的脑表面。注意使阵列贴合皮层曲率，避免压迫硬脑膜。
  15. 使用牙科丙烯酸树脂将两个电极阵列及其插头外壳固定于颅骨上。
  16. 在暴露的皮层表面覆盖一层抗菌润滑剂（例如，KY-Jelly），并用牙科丙烯酸树脂（例如，Paladur, Heraeus Kulzer）封闭开颅部位。注意聚合过程可能产热。在神经组织与牙科丙烯酸树脂之间使用足够的润滑剂，防止两者直接接触，以免造成组织损伤。
  17. 现在让动物在进行任何进一步操作前充分恢复。不同物种的恢复时间可能不同（例如，沙鼠：≥3天，小鼠：≥7天）。密切监测动物状态，并在术后数日内根据需要给予镇痛治疗（例如，美洛昔康；1 mg/kg 术后即刻及 24小时 后各一次）。

3. 使用ICMS作为条件刺激的双向穿梭箱设计

  1. 穿梭箱训练
    1. 放置一个穿梭箱（定制或任何商用产品， 例如， E10–E15，Coulbourn Instruments）置于声学和电学屏蔽室内。箱体包含两个由障碍物分隔的区域。障碍物的高度会影响“go”反应的行为偏向，应根据特定物种选择适当的高度。例如， 小鼠约2 cm，沙鼠约3 cm。
    2. 为施加足部电击（US），请使用栅格地板，其栅条间距应适合所研究的物种12,15始终注意确保没有任何导电物质导致各个电极片之间发生短路（如粪便、毛发、电极膏）。
    3. 在动物经过充分恢复时间后（参见2.17），尽量在不使用短期麻醉的情况下将动物连接至记录和刺激电缆。尝试用毛巾覆盖动物，并用手轻轻抓握。用另一只手揭开动物头部及连接器部位，然后连接电缆。
    4. 每次训练开始前，让动物在训练箱中适应 3 分钟。
    5. 每次训练（每天1-2次）进行30至90次试验。每次试验持续时间不超过15秒，试验间间隔随机设定在25至 30 秒
    6. 为向刺激电极输送用于条件刺激的ICMS，请使用多通道刺激器（例如， MCS STG2000）。为获得行为效应且不损伤脑组织，应施加脉冲序列（例如， 300 毫秒长度、100 赫兹）的双相、电荷平衡脉冲（阴极先导），间隔 200 µS期持续时间。以700毫秒的间隔重复刺激，持续4秒（观察窗口）。
    7. 用于呈现听觉条件刺激时，使用模拟输出PCI板（例如， NI PCI-6733)。使用Matlab对这些设备进行编程，通过数字输出线路灵活控制穿梭箱系统并实现硬件触发。
    8. 通过音频放大器将模拟输出信号传送至穿梭箱扬声器。
    9. 通过网格地板选择性地传递足部电击非条件刺激（US）。为了获得最佳的电生理记录质量，使用第二台高端多通道刺激器（MCS STG2000）产生电击。
    10. 仅呈现CS+刺激以进行检测训练。在此过程中，插入无CS和US的空白试验（约占10%），穿插于测试试验之间，以校正偏倚的穿梭行为（参见3.2）。为增加任务难度，可训练动物在同一实验阶段中随机呈现的CS+与CS-刺激之间进行辨别。
    11. 在条件刺激（CS+）呈现后的关键时间窗4秒内，将隔室变化分类为条件反应（CR） 击中反应在关键时间窗口内未出现条件反应的CS+试验中（错过），立即给予6到10秒的轻度足底电刺激作为非条件刺激（US）。
      注意：CS+ 的重复刺激若与US重叠，将减少动物的学习负担，并提高学习速度和表现（“延迟”与“痕迹”条件反射，参见讨论部分）。
    12. 对于CS-试验，将关键时间窗口内的区室变化分类为 误报反应，并在此不适当条件反应（CR）发生后立即施加超声波（US）长达10秒。当动物在关键时间窗口内停留在隔室中而未产生条件反应（即无CR）时，不要在条件刺激-（CS-）后施加超声波，并将该次试验归类为 正确拒绝.
      注意：重要的是，当动物因足底电击非条件刺激（US）而发生箱室转换时，应立即关闭足底电击非条件刺激逃逸）。对条件抑制（CS-）试验使用较长的关键时间窗口， 例如， 如果使用重复的条件刺激，虽然这会设定更为严格的学习标准，因为动物需要付出更大的努力来抑制条件反应（CR）。
    13. 为有效建立条件刺激（CS）与非条件刺激（US）的关联，应将电击强度调整至中等范围，以产生厌恶感但不引起疼痛。不同物种的初始电流强度最优值存在差异。 例如， 50 µ小鼠用，200 µ适用于沙鼠）。因此，请参阅接下来的两点以获取更多技术细节：
      1. 在首次训练过程中，从较低强度（约200）开始， individually 调整刺激强度 µ对于沙鼠而言，若足部电击强度过低，则逃避潜伏期会出现波动，条件刺激（CS）与非条件刺激（US）之间的关联将无法达到最佳状态。
      2. 始终注意观察动物是否开始对条件刺激（CS）发出叫声或出现僵直反应。若出现此类情况，说明足底电击强度过高。这种条件性恐惧反应会干扰回避学习。
    14. 仔细测定逃避潜伏期。若在前20次试验后逃避潜伏期仍超过2秒，则逐步增加足底电刺激强度。每次训练后均需检查动物是否处于电刺激控制之下。 即， 其显示的逃避潜伏期明显低于2秒。
      注意：然而，应避免过快增加足底电击强度，因为高度应激动物的行为策略可能退化为单纯的逃避反应。因此，在调整非条件刺激（US）强度时，需密切观察动物的行为表现，特别是其反应潜伏期。示例参见 图3E.
    15. 如果动物表现出条件反应（CR），应立即停止条件刺激（CS）的呈现。这对于强化回避反应至关重要。
    16. 如果动物已习得一种回避策略， 即， 对所有条件刺激（CS）呈现适当的条件反应（CR），通过改变参数（如ICMS幅度、相位持续时间、重复频率等）进行心理测量分析。以分块方式实施参数化CS变化，并与非条件刺激（US）配对，但此过程将引发学习与适应。
      1. 为避免此情况，应先进行15至30次原始训练，随后在包含原始条件刺激（CS）的常规训练试次之间，随机插入不伴随非条件刺激（US）的CS变体作为测试试次。测试试次的比例最高不超过25%。
    17. 训练结束后，将动物从训练箱中取出，并在训练下一只动物前彻底清洁整个箱子。应尽量避免在同一箱子中同时训练不同物种的动物，因为它们的自然气味可能会干扰训练效果。
  2. 训练数据的分析
    1. 记录适应阶段中所有隔室的变化。
    2. 记录训练期间所有隔室变化，并将其分为正确反应和误报、逃避反应（漏报及误报后的返回穿梭）以及自发的试验间穿梭（ITS）。
    3. 按以下方法计算CS+和CS-的条件反应率：击中率 = 击中次数 / CS+试验次数；误报率 = 误报次数 / CS-试验次数。
    4. 按会话获取条件反应（CR）率。然而，为了以更高的时间分辨率评估学习动态，需根据相同数量的条件刺激+（CS+）和条件刺激-（CS-）试验组成的较短区块计算条件反应率。例如， n = 10）。
    5. 将条件抑制率（CR 率）按实验会话或试验区块绘制成图，以评估训练进展和学习动态。
    6. 为量化动物行为敏感性并排除实验条件对动物反应的偏差影响，应基于信号检测理论计算d’值8,9,17.
    7. 对于d’分析，使用相应击中率和虚报率（辨别学习）或击中率和ITS（检测学习）的Z分数，这些Z分数由标准正态分布函数的逆函数得出，然后将这些Z分数相减。设定d’ = 1.0作为刺激检测的阈值标准，该值对应信号强度比噪声水平高一个标准差。参见 图3 例如。
    8. 此外，通过测量条件刺激（CS）开始至行为反应（完全进入另一隔室）之间的时间间隔，确定对不同条件刺激的条件性反应（CR）和逃避反应潜伏期。
    9. 通过录像记录穿梭箱行为，获得更详细的行为分析。通过将穿梭箱或刺激系统发出的触发脉冲记录在视频的音频轨道上，实现视频系统与记录系统之间的时间同步。视频分析可用于评估动物在条件反应（CR）发生前的注意力和定向反应。

4. 在体 内 学习动物中的电生理学技术

  1. 训练期间的电生理记录
    1. 在训练期间，使用多个电极相对于公共参考/接地电极进行单极记录电生理信号（例如，使用所述的ECoG阵列）。
    2. 将所有电极的信号通过直接插入或经短适配器接入头部连接器，送入前置放大器。
    3. 通过由金属网包裹的细而柔韧的电缆束将前置放大器连接至主放大器，以防止动物啃咬造成损坏。
      注意：可通过弹簧缓解电缆束的机械应力，进一步允许动物在箱内自由移动和旋转。理想情况下使用可旋转且带电机的旋转连接器。然而，对于听觉实验，应将旋转连接器置于隔音室外部，或使用泡沫材料对其隔音，以降低其电机产生的高频听觉噪声。
    4. 在屏蔽箱内使用前置放大器以提高信噪比，并对信号在所需频率范围内进行带通滤波。
    5. 以高于1 kHz的采样频率（用于局部场电位记录）和至少40 kHz的采样频率（用于动作电位记录）对数据进行采样，并存储至计算机以供离线分析。为两种记录类型设置合适的滤波参数（例如，局部场电位：2–300 Hz；动作电位：300–4,000 Hz）。
    6. 在训练开始前仔细检查记录质量（无噪声或运动伪迹）。对信号应用在线FFT滤波器以确定50 Hz噪声的幅值。如有必要，重新检查头部连接器、适配器、前置放大器、电缆束和放大器之间的所有连接。
    7. 为减少由电刺激引起的记录数据中的伪迹，可采用插值方法重建每个脉冲起始前1 ms至起始后约5 ms内所有受影响的数据点。具体操作为：在未受影响的数据点之间插入零值，然后应用对称的有限冲激响应（FIR）滤波器，以最小化插值点与其理想值之间的均方误差（可使用Matlab的interp.m函数）。该处理应在进一步分析之前，对原始信号的每一通道独立进行9。
  2. 并行穿梭箱训练、ICMS及记录的技术细节
    1. 通常应确保动物在箱体环境中感到舒适。允许动物自由活动并到达箱体的各个角落。在首次训练前一天给予足够的适应时间（20分钟），并在每次训练前也给予适当适应时间（3分钟），有助于提高实验效果。
    2. 任何手术处理后，应给予动物充足的恢复时间，必要时给予药物治疗（见上述2.17），且仅在动物未表现出任何典型痛苦或疼痛迹象（如闭眼、嗜睡表型、毛发蓬乱20）时才开始训练。
    3. 确保栅格地板具有良好的电气接地。必须避免记录系统、穿梭箱与动物之间的接地环路。动物应仅通过其公共接地电极接地，而栅格地板应保持浮空电压状态。
    4. 通过电机驱动旋转连接器的独立线路，将多通道刺激器（MCS STG2000）连接至植入式刺激电极阵列的头部连接器。
    5. 使用记录系统的公共接地电极，同时作为ICMS的接地或回路电极。

5. 电极位置的组织学分析

  1. 完成完整的训练集后，通过组织学分析控制刺激电极阵列的稳定位置。
  2. 通过腹腔注射混合的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）稀释于0.9%无菌氯化钠溶液中，对动物进行麻醉。然后通过所有刺激通道施加单极阴极电流（30 µA，持续60秒），以在植入位置的组织中产生铁沉积8。
  3. 此操作完成后，采用适当且经批准的安乐死方法处死动物（例如腹腔注射过量戊巴比妥钠；100 mg/kg）。
  4. 立即取出动物脑组织，并将其置于液氮冷却至-70 °C的2-甲基丁烷中冷冻。
  5. 随后在冷冻切片机上将感兴趣区域切成50 µm厚的水平切片。
  6. 组织学：尼氏染色与“普鲁士蓝”染色
    1. 为识别皮层各层，对每隔一个的切片进行尼氏染色。首先将切片浸入0.05 M三水合醋酸钠缓冲液（pH 4.0  -4.2）中5分钟。
    2. 将切片浸入5%醋酸克雷斯紫溶液中5至10分钟。用蒸馏水冲洗切片。
    3. 将切片依次分别在0.05 M三水合醋酸钠缓冲液（pH 4.0 - 4.2）、50%、70%和90%乙醇溶液中各浸泡2分钟。
    4. 将切片在异丙醇:96%乙醇（2:1）混合液中浸泡两次，每次5分钟。
    5. 最后将切片在Roticlear中浸泡三次，每次5分钟。
    6. 通过“普鲁士蓝”染色处理其他间隔的切片，以确定刺激通道的位置，使实验后由长时间单相电流诱发的铁沉积清晰可见。
    7. 通过将2 g K4[Fe(CN)6]溶于200 ml 1% HCl中，新鲜配制1%三水合六氰合铁酸钾(II) K4[Fe(CN)6]溶液。
    8. 加入800 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
    9. 将脑切片先用蒸馏水浸泡10分钟，再在六氰合铁酸盐溶液中浸泡10分钟。
    10. 将切片在0.1 M磷酸盐缓冲液中浸泡两次，每次10分钟，最后在蒸馏水中浸泡5分钟。

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结果

本部分展示了一例蒙古沙鼠在穿梭箱中进行学习的代表性实验。实验对象被训练以区分两个植入听觉皮层、相距700 µm的刺激电极所对应的ICMS位点（图1和图2）。刺激电极阵列可根据不同空间设计进行定制（图1）。在此实验中，动物在3次训练阶段内即学会了区分这两个ICMS位点，每次呈现30次条件刺激+（CS+）和条件刺激-（CS-）（图3A-C）。这一点由连续7次训练阶段中，正确击中（hit）与虚报（false alarm）反应的条件反应（CR）率之间稳定且显著的差异所表明（图3B）。相应地，在这些训练阶段中，辨别力指标d’ >1（图3C）。对非条件刺激（US）的快速逃避潜伏期至关重要，因其反映了有效的厌恶性非条件反应。通过从200 µA开始，以50 µA为步长逐步调整足底电击强度，直至逃避潜伏期较短，即可确保该反应的有效性（见图3E）。同时，通过ECoG阵列进行的电生理记录，可用于评估由相距约700 µm的皮层内电刺激（CS+或CS-）所诱发的...

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讨论

本方案描述了一种在学习动物中利用双向厌恶足底电刺激控制的穿梭箱系统，同时进行位点特异性皮层内微刺激（ICMS）和多通道电生理记录的方法。该方案强调了实现此类技术组合的关键要点，并指出应仅通过动物的公共接地电极实现接地，而使网格地板处于浮空电压状态。在此研究中，采用听觉穿梭箱学习范式应用于蒙古沙鼠，因为这些动物听觉皮层与学习相关的可塑性重组已被广泛研究8,12,14,15,21,22。然而，本方案经过少量修改后也可适用于其他啮齿类动物，例如小鼠16。在此过程中，需考虑不同物种在手术后恢复时间（2.17）、障碍物高度（2.1.1）以及个体动物对足底电刺激的敏感性（3.1.3–3.1.6）等方面的特异性差异，其中电刺激敏感性可能具有高度变异性。

该方案进一步详细阐述了如何利用定制电极设计刺激皮层组织中的不同位点，从而引发不同的神经网络激活，这些结论源自同步电生理多电极记录的分析结果。8,23根据电极间距的不同，可以刺激不同区域，例如拓扑图中的各个区域9通过应用层依赖性ICMS，可以选择性地激活长距离皮...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了德国研究基金会（Deustche Forschungsgemeinschaft DFG）和莱布尼茨神经生物学研究所的资助。感谢 Maria-Marina Zempeltzi 和 Kathrin Ohl 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚四氟乙烯绝缘不锈钢丝California Fine Wire直径 50µm，带绝缘层
针式连接器系统 Molex Holding GmbH5104702001.25 mm 间距 PicoBlade
TEM 网格 QuantifoilScience ServicesEQ225-N27
牙科丙烯酸树脂 PaladurHeraeus Kulzer64707938
手持式钻机 OmniDrill35WPI 503599
氯胺酮 500 mg/10 mlRatiopharm GmbH7538837
隆朋 2%，25 mlBayer Vital GmbH5066.0
氯化钠 0.9%，10 mlB.Braun AG PRID00000772
润滑剂 KY-JellyJohnson & Johnson
穿梭箱 E10-E15Coulbourn InstrumentsH10-11M-SC
刺激发生器 MCS STG 2000Multichannel Systems
Plexon 头戴式电缆 32V-G20Plexon Inc.HSC/32v-G20
Plexon 头戴式装置  32V-G20Plexon Inc.HST/32v-G20
PBX 前置放大器 32 通道Plexon Inc.32PBX box
多通道采集系统Plexon Inc.MAP 32/HLK2
冷冻切片机 CM3050 SLeica Microsystems GmbH
信号处理卡 Ni-DaqNational Instruments
Lab StandardTM 立体定位仪Stoelting Co. 
音频衰减器 g.pahg.pah Guger technologies
醋酸克里西林紫Roth GmbH7651.2
Roticlear Roth GmbHA538.1
三水合醋酸钠Roth GmbH6779.1
三水合六氰合铁(II)酸钾Roth GmbH7974.2
二水合磷酸氢二钠Merck1,065,801,000
ICM 阻抗调节模块FHC55-70-0
动物体温控制器World Precision InstrumentsATC2000

参考文献

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