使用操作性条件反射量化小鼠的社会动机

摘要

本文介绍了一种利用操作性条件反射对社会性奖赏进行定量测量小鼠社会动机的新方案。该方案适用于自闭症及其他社会行为障碍小鼠模型中社会动机的测量。

摘要

在本实验方案中，通过两种操作性条件反射范式来测量小鼠的社会动机。实验使用双室穿梭箱，其中一个腔室配备两个操作杠杆（左侧和右侧）以及一个食物 receptacle，并通过覆盖有金属丝网格的自动闸门与第二个腔室隔开。在不同测试日轮换使用不同的刺激小鼠作为金属丝网格后的社会刺激源，仅在闸门打开后才可见。测试小鼠被训练通过按压杠杆来打开闸门，从而与刺激同伴接触15秒。为获得社会性奖励，所需按压杠杆的次数按照固定比率3逐步增加。当测试小鼠连续5分钟不再按压杠杆时，测试会话结束。最后一次获得强化的比率（即断点）可作为社会动机的定量指标。在第二种范式中，测试小鼠被训练区分左侧和右侧杠杆按压，以分别获得食物奖励或社会性奖励。每完成3次对应杠杆的按压即可获得一次奖励。通过比较获得的食物奖励和社会性奖励的数量，可评估小鼠对不同类型奖励的偏好程度。此外，可在不同小鼠品系之间比较各类奖励的比率，并在单次测试会话中监测该比率的变化，以评估对某一特定奖励类型的饱足程度。这两种操作性条件反射范式均非常适用于在自闭症及其他社会行为障碍的小鼠模型中对社会动机进行量化分析。

引言

近年来，随着遗传因素和环境因素与包括自闭症谱系障碍在内的社会行为障碍之间的关联被逐步揭示，研究人员已开发出多种小鼠模型，用于探索这些因素在社会行为中的作用。这促使人们需要建立新的技术来表征小鼠的社会行为，包括对社会动机的定量测量¹。

已有多种成熟的研究范式可用于证明小鼠的社会动机，但这些方法在量化动机行为强度方面均存在严重局限性。例如，一些最早的行为评估方法包括对两只从未相遇的啮齿类动物之间的社会互动进行简单观察。通常会测量接近、跟随、嗅探和理毛等多种行为，这些行为可能作为社会动机的指标。这类研究最初在大鼠中开展^2-5，随后被改进并应用于小鼠^6,7。习惯化/去习惯化的社会识别范式也是一种评估社会动机的方法⁸，在此范式中，测试动物首先被反复暴露于同一只刺激动物（习惯化阶段），随后被暴露于一只新的动物（去习惯化阶段）。顾名思义，正常动物在反复接触同一刺激动物后会表现出行为反应的减弱（即习惯化），而在接触新动物时则会表现出反应恢复至基线水平（即去习惯化）。这种习惯化反应可能反映了测试小鼠与刺激小鼠互动动机的下降。此外，社会选择范式也被用于评估社会动机，该范式允许测试小鼠在空腔室与另一腔室内限制活动的刺激小鼠之间进行选择。实验通常从将测试小鼠置于中立的中央腔室开始。该任务的一些版本中，刺激小鼠被固定在其中一个腔室内⁹。一种改进方法则采用金属丝笼覆盖刺激小鼠，从而避免对刺激动物进行束缚¹⁰。近年来，还发展出一种社会条件性位置偏爱任务，其中小鼠被训练将视觉上不同的腔室与是否存在社交伙伴相关联，条件训练完成后允许其自由探索空置的腔室¹¹。若小鼠在先前发生社交配对的腔室中停留时间更长，则被视为社会动机的体现。

上述所有范式均可提供与小鼠社会表型相关的宝贵数据。然而，尽管可以通过上述范式观察小鼠是否表现出寻求社会互动的“意愿”，但这种“意愿”的强度， 即，社会动机，难以测量。传统上，通过创建一种情境来测量啮齿类动物动机行为的强度，在这种情境中，它们必须付出努力才能获得动机源。这通常涉及在操作性范式中训练啮齿类动物，以食物作为激励因素。然而，该方法此前已被用于研究大鼠的社会动机，但仅限于雄性大鼠接触性伴侣，或雌性大鼠接触其幼崽的情况（详见Matthews综述） 等, 2005) ^12,13.

在开发下文所述的社会动机范式之前，仅有一项其他研究利用操作性范式在小鼠中探讨了性动机之外的社会动机¹²。在这一系列实验中，远交系Swiss Webster小鼠被训练按压杠杆以获得与同性别同种个体接触的机会。其中一项实验表明，与群养小鼠相比，单笼饲养小鼠开始按压杠杆以获取目标小鼠接触机会的潜伏期显著缩短，提示这些社会隔离小鼠寻求社交接触的动机增强。在同一项研究的另一项实验中，比较了注射生理盐水与催产素拮抗剂（阿托西班）的小鼠。有趣的是，药物处理小鼠开始按压杠杆以获取目标小鼠接触机会的潜伏期显著延长，提示这些小鼠对社交奖赏的动机降低。

尽管这些实验试图通过操作性条件反射来量化小鼠的社会动机，但其设计存在显著局限性，而下文所述方法对此进行了大幅改进。例如，上述第一个实验（即实际研究中的实验2）存在一个明显的根本性缺陷：研究人员仅交替使用了2只目标小鼠进行不同测试日的实验。先前研究表明，在群体饲养的小鼠中，社会识别能力可持续至少7天，反复接触相同目标会导致社会探究行为减少¹⁴。然而，在单独饲养的大鼠和小鼠中，社会识别能力在1至2小时内即会消失，因此只要对同一目标的重复暴露与初次暴露间隔至少2小时，社会探究时长便可维持在基线水平^15-17。Matthews et al. 实验中报告的单独饲养小鼠在获取社会接触时反应潜伏期缩短，可能正是由于在不同测试日之间未能形成对目标小鼠的社会识别所致¹²。下文所述方法通过在每次测试日均使用新的目标小鼠，有效控制了这一潜在混杂因素。此外，在上述Matthews et al. 研究的两个实验中，各组之间在杠杆按压总次数上均未报告差异。如果研究人员采用本研究方案中所述的渐进式递增强化比率，或许能够检测到组间在总按压次数上的差异。同时，对目标小鼠的接触是由实验者手动控制的，即通过抬起覆盖目标小鼠的盒子来实现。而使用自动控制的滑门装置来控制对目标小鼠的接触，可完全避免因实验者在场而引入的人为干扰。事实上，为了实现社会动机操作性范式的全面自动化，研究设备已按照下文详述的方式进行了定制化改造。

方案

本研究经阿祖萨太平洋大学机构动物护理与使用委员会批准。所有涉及动物的实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。

1. 社会动机与效价比较测试范式的装置改造

1. 为了在操作性任务中测试小鼠的社会行为，需对中央通道模块化穿梭箱进行改造。这些穿梭箱的尺寸为 44 cm × 17.3 cm，由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）和不锈钢制成。
2. 通过在门框正面安装金属丝网，改装可编程闸门。该金属丝网应允许小鼠进行有限的社会接触，但阻止其从一个腔室穿越至另一个腔室。
3. 使用可编程闸门将每个穿梭箱分隔为两个腔室：每个腔室尺寸约为 22 cm × 17.3 cm。将其中一个腔室指定为测试腔室，另一个为目标腔室。
4. 在测试腔室中，将小鼠操作杠杆安装在与闸门相对的墙壁上。在两个操作杠杆之间安装液体食丸分配器作为食物接收装置。
5. 根据实验范式，将小鼠操作杠杆编程为用于打开闸门或提供液体食物奖励。
6. 将一个手持按钮连接至设备，并将其编程为可手动控制闸门开启（用于对测试小鼠进行手动训练）。
7. 为每个穿梭箱配备八通道红外（I/R）控制器，用于监测各腔室金属网格地板上的活动情况。在测试腔室上方安装一个 USB 数字视频摄像头，并将其连接至计算机。将整个装置置于密胺隔音箱内。
8. 使用实验室编写的自定义程序运行操作性行为实验程序。

2. 社会动机范式中小鼠的塑造

1. 将一只测试小鼠放入测试室，将一只年龄和性别相匹配的刺激小鼠放入目标室。
2. 使用逐步逼近法或连续逼近强化法，训练测试小鼠按压杠杆以打开闸门。在此训练过程中，通过按下手持按钮（该按钮已编程用于控制闸门）手动给予强化。
   注意：强化包括打开闸门持续15秒，从而使测试小鼠可通过金属网栅接触刺激小鼠。
3. 使用安装在测试室上方的摄像头观察测试室中的小鼠行为。
4. 每天进行一次为期30分钟的训练，持续训练每只小鼠，直至其在连续5次测试中的至少3次中表现出不少于10次操作反应（即按压杠杆）。通过随机分配的方式轮换不同小鼠使用穿梭箱。
5. 若小鼠经过30次每日训练后仍未达到上述标准，则将其从实验中剔除，并归类为非学习者。
   注意：每日训练次数可根据研究人员的判断超过30次。
6. 在训练过程中交替使用不同的刺激小鼠，确保每隔一天更换一只新的刺激小鼠。
7. 每次训练结束后，使用70%乙醇清洁穿梭箱。此外，每天测试结束后，应使用消毒清洁剂对所有设备进行全面清洁。

3. 在社交动机范式中测试小鼠

1. 将一只经过训练的测试小鼠放入测试室，将一只年龄和性别相匹配的刺激小鼠放入目标室。测试过程中，应使用至少10只刺激小鼠组成的群体为每只测试小鼠分配刺激对象，确保每只刺激小鼠在连续10次每日测试会话后才重复使用。用于塑造阶段的刺激小鼠不得用于正式测试。
2. 将闸门编程为按渐进比率强化程序开启，使操作反应（压杆）次数以每次试验递增3次的固定速率算术增长，以获得15秒接触目标小鼠的社会性奖励。
3. 当测试小鼠连续5分钟不再进行压杆操作时，程序自动结束测试会话。
4. 将最后一次完成（被强化）的比率记录为断点（breakpoint）。将此因变量作为社会动机的指标。每只小鼠连续测试20天每日会话，或在观察到行为表现达到稳定水平后至少继续测试10次会话。
5. 每次测试会话之间使用70%乙醇擦拭穿梭箱，并在每天测试结束后使用消毒清洁剂进行彻底清洁。

4. 社会奖赏与食物奖赏的价值比较

1. 在所有小鼠完成社会动机范式后，使用一项旨在比较社会性奖赏与食物奖赏效价的任务对这些相同的小鼠进行测试。
2. 将一个杠杆程序设置为开启闸门，呈现社会性奖赏持续15秒，将另一侧的杠杆程序设置为呈现液体食物奖赏持续15秒。
   注意：本方案中使用的液体食物奖赏为添加0.2%蔗糖的甜化炼乳。需准备足够量（通常为500 ml），以便向每只小鼠重复提供0.02 ml的奖赏。
3. 为控制小鼠可能存在的杠杆偏好，为测试小鼠分配交替的杠杆-奖赏对应关系。因此，将每组测试小鼠中的一半分配为左侧杠杆对应食物奖赏、右侧杠杆对应社会性奖赏，另一半则分配为左侧杠杆对应社会性奖赏、右侧杠杆对应食物奖赏。
4. 训练小鼠以比较社会性奖赏与食物奖赏的效价。
   1. 将一只测试小鼠放入测试室，并将一只年龄和性别相匹配的刺激小鼠放入目标室。
   2. 每次训练会话中仅激活一种杠杆-奖赏对应关系。训练共包括6个为期1小时的会话，每天交替使用不同的对应关系。每隔一次社会性奖赏会话后更换分配给测试小鼠的刺激小鼠。
   3. 在训练和测试期间，维持小鼠自由摄食标准饲料。由于使用炼乳与蔗糖溶液作为奖赏，无需对小鼠进行食物剥夺即可实现操作性条件反射¹⁸。
5. 对小鼠进行社会性奖赏与食物奖赏效价比较的测试。
   1. 将强化程序设置为固定比率3:1，即每按压杠杆三次才给予一次强化，且仅由其对应的奖赏进行强化。
   2. 将测试会话程序设置为持续60分钟。
   3. 将一只测试小鼠放入测试室，并将一只年龄和性别相匹配的刺激小鼠放入目标室。注意：可用于社会动机任务中的同一组10只刺激小鼠可再次使用，但应采用10天轮换制分配给各测试小鼠。
   4. 在完成6天训练后，对小鼠进行连续20天的每日测试，或至少在观察到行为表现达到稳定水平后继续进行至少10天的每日测试。该范式的主要因变量为每种奖赏类型对应的总杠杆按压次数。
   5. 再次强调，每次测试会话之间应使用70%乙醇擦拭穿梭箱，并在每天测试结束后使用消毒清洁剂进行清洁。

结果

本方案已用于比较具有亲社会性的近交系 C57BL/6J 小鼠与 BTBR 近交系小鼠，后者此前已被报道表现出社交行为减少^10,18。该方法还被用于表征不同基因敲除小鼠品系的社交动机，这些品系被假设具有增强或减弱的社交动机。此前发表的比较 C57BL/6J 与 BTBR 近交系小鼠的结果如图1所示。这些结果表明，与 C57BL/6J 小鼠相比，BTBR 小鼠的社交动机降低。Valence Comparison 范式还显示 BTBR 小鼠的食物动机也降低，提示该品系的整体动机行为普遍减弱（图1B）。

图2A 展示了一些未发表的初步数据，比较了C57BL/6背景品系的野生型同胞与杂合子及纯合子敲除同胞，后者来自一个被假定可促进社交动机的基因（基因X），其蛋白产物减少或缺失。图2B 展示了一些未发表的初步数据，比较了C57BL/6背景品系的野生型同胞与杂合子敲除同胞，后者来自一个被假定可降低社交动机的基因（基因Y），其蛋白产物减少。这两项研究的初步数据均支持各自的假设，并进一步证明了所述操作性社交动机范式的应用价值。

图 1. 来自社交动机与效价比较范式的先前已发表结果。（A） 在社交动机任务中，单只饲养（IH）的 B6 小鼠、群体饲养（GH）的 B6 小鼠以及群体饲养的 BTBR 小鼠在测试最后 10 天内的平均断点。每组共有 9 只小鼠。单只饲养和群体饲养的 B6 小鼠表现相似，但群体饲养的 B6 小鼠与 BTBR 小鼠之间存在显著差异（t = 2.741，df = 16，p = 0.015）。（B） 在效价比较范式最后 10 个阶段中，群体饲养的 B6 小鼠和 BTBR 小鼠获得的食物奖励与社交奖励的平均数量。两组小鼠获得的食物奖励均显著多于社交奖励（BTBR：t = 3.551，df = 8，p = 0.007；B6：t = 9.478，df = 8，p < 0.001）。然而，BTBR 小鼠获得的食物奖励显著少于 B6 小鼠，且获得的社交奖励数量也最少（t = 3.321，df = 16，p = 0.004）。该图改编自参考文献 ¹⁸。

图 2. 利用社会动机范式进行的未发表研究的代表性结果。 (A) 小鼠在停止压杆达 5 分钟前所达到的平均断点（最后被强化的比例）。对于基因 X，共在社会动机范式中测试了 12 只野生型（WT）、7 只杂合子（HET）和 6 只敲除型（KO）小鼠。方差分析显示不同基因型之间存在显著差异（F = 7.18，df = 2, 22，p = 0.004）。事后 Tukey HSD 检验表明，KO 小鼠的表现显著低于 WT 对照组。 (B) 对于基因 Y，共测试了 8 只 HET 和 6 只 WT 小鼠。独立样本 t 检验显示不同基因型之间存在显著差异（t = 2.26，df = 8.97，p = 0.05）。* 表示与 WT 小鼠相比在 α = 0.05 水平上具有显著差异。

讨论

本文所述的操作性社会动机范式是用于表征人类疾病小鼠模型中社会行为的有力工具。这些范式并不仅仅允许测试小鼠被动地选择社会接触，而是要求测试小鼠付出一定的努力才能获得社会性奖赏。测试小鼠为获得社会性奖赏所愿意付出的努力程度，可作为社会动机的定量衡量指标。此外，通过效价比较范式，可以对不同类型奖赏下的动机行为进行比较。通过在闸门另一侧呈现适当的刺激，这两种操作性范式也可用于评估性动机和亲代动机。

这些社会动机范式的建立涉及对多个关键变量的调试。例如，通过预实验研究，社会奖赏的呈现时间从30秒缩短至15秒。尽管该时长已足以支持测试小鼠与刺激小鼠之间的社会互动，但未来的研究可进一步优化社会奖赏的持续时间。类似地，根据预实验结果，杠杆按压次数与社会奖赏之间的递增比率也从固定的5次调整为3次。

最初通过连续30天的每日测试来评估达到稳定杠杆按压行为所需的天数。结果表明，大多数小鼠在7天内即可达到稳定状态，因此将测试次数减少至20次。然而，每日表现存在波动，因此对最后10天的数据进行平均，既能确保行为已达到稳定状态，又能比更少测试天数更准确地反映真实平均表现水平。研究人员应密切监测数据，确保在10次测试日内达到稳定表现，或根据实际情况对实验方案进行相应调整。

训练时间也从1小时缩短至30分钟。所需训练次数确实取决于小鼠品系，某些小鼠在经过固定次数的训练后可被任意判定为“非学习者”¹⁸。达到进入测试范式标准所需的训练天数可作为衡量社交动机的另一项指标，因此值得记录追踪。研究者也可尝试在效价比较范式中使用不同的食物奖励选项。然而，重要的是，测试小鼠最初应使用纯粹的社交奖励进行训练，并在开始效价比较范式之前，先在社交动机范式中完成测试。

这些操作性社会动机范式可通过测量上述方案中未提及的额外变量进行修改和完善。例如，可利用目前可用的商业软件追踪每只小鼠在其相应隔间中的位置。此外，可在社会互动期间对特定行为进行评分，包括鼻对鼻接触或超声波发声。研究人员还可进一步尝试调整社会动机范式中使用的行为比率，或开展涉及无社会伙伴的情境试验，甚至可比较闸门后呈现的其他刺激物，例如同种个体的视频或木偶。在效价比较范式中，对各次试验中选择动态的分析可进一步揭示因特定奖励类型的饱足所引起动机变化的信息¹⁸。

尽管这些操作性社会动机范式为量化小鼠的社会动机提供了亟需的工具，但它们仍存在一些局限性。首先，这些范式要求小鼠具备将按压杠杆行为与社会性奖赏建立习得性关联的认知能力。某些小鼠模型可能在认知功能和社会能力方面均存在缺陷，从而难以利用这些范式准确评估其社会动机。其次，社会互动的性质受到限制，因为小鼠仅能通过金属丝网格进行交互。然而，小鼠仍可成功表现出多种典型的社会行为，尤其是鼻对鼻的探究行为。这些方法的最后一个局限是其劳动强度大，需要耗费大量时间才能完成。两种范式的训练和测试均需要至少连续两个月的每日实验。部分小鼠可能需要更长时间才能学会按压杠杆的关联反应，从而进一步增加所需的实验次数。尽管这些范式显然不属于高通量技术，但其所产生的数据具有高度价值，值得投入相应的人力成本。然而，为了更全面地表征特定小鼠模型的社会行为，建议将这些范式与其他已建立的小鼠社会行为测量方法结合使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
模块化穿梭箱	Med Associates Inc.	ENV-010MC
自动闸门	Med Associates Inc.	ENV-010B
小鼠操作杆	Med Associates Inc.	ENV-3010M
带食物接收器的液体取样器	Med Associates Inc.	ENV-202M-S
八通道红外控制器	Med Associates Inc.	ENV-253C
密胺隔音箱	Med Associates Inc.	ENV-016MD
MED-PC IV 软件程序	Med Associates Inc.	MED-PC IV
Microsoft Lifecam 摄像头	Microsoft
金属丝网			金属丝网可从五金商店购买。我们使用不锈钢小鼠笼盖裁剪制成金属丝网。
70% 乙醇			用于在不同小鼠之间清洁穿梭箱。无需特定品牌。
淡炼乳	Carnation		每只小鼠每次奖励使用 0.02 ml 与 0.2% 蔗糖混合。为保证一致性，我们始终购买同一品牌。
蔗糖			任何品牌的纯结晶糖均可使用，因其将溶解于淡炼乳中。