大鼠高精度前肢抓取技能任务的习得

摘要

本文提出了一种用于分析大鼠高精度前肢抓取技能习得过程的范式。

摘要

运动是中枢神经系统功能的主要可测量输出。为了理解运动功能背后的基本原理和过程，开发能够对运动学习与执行进行详细分析的行为学范式具有重要意义。本文介绍了一种行为学范式，可用于研究单次训练日内（日内）的运动获得，反映快速学习成分和初级习得过程，以及跨多个训练日（日间）的熟练运动学习，反映慢速学习成分及任务记忆的巩固。该行为范式通过两个特征提高了运动技能任务的难度和复杂性：第一，动物在每次获取食丸前需重新调整身体位置，迫使重新定向，并防止从相同角度重复执行动作；第二，食丸从一个与食丸直径相匹配的垂直柱上抓取，该柱位于笼前，要求精确抓握才能成功获取食丸，从而避免动物通过简单拖拽方式将食丸拉向自身。结合新型遗传学、成像和电生理技术，该行为学方法将有助于揭示运动学习与记忆的形态学、解剖学和分子基础。

引言

运动控制是中枢神经系统（CNS）的核心功能之一。运动能力是CNS功能最主要的可测量输出，也是个体与外部世界互动的主要方式。目前，揭示运动功能的基本原理以及 motor task（运动任务）学习背后的机制，是神经科学领域的重要挑战之一。在习得新的运动任务过程中，已观察到形态学、生理学和分子层面的变化。例如，熟练的运动训练会引发突触形态和数量的改变^1-5，且在运动学习后，突触机制的功能也发生相应变化。在经过训练的运动皮层前肢代表区的神经连接中，其突触反应强于同一动物未训练半球，或未经训练动物的相应反应^6,7。电生理学研究还表明，在学习新的运动技能过程中，存在类似长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的机制，并且由LTP与LTD饱和界限所定义的突触运作范围也会发生改变⁸。此外，已有研究表明，活动标记物以及促进可塑性的分子（如c-fos、GAP-43、BDNF）和抑制可塑性的分子（如Nogo-A）均在学习相关的神经可塑性中发挥调控作用^9-16。

这些在理解运动学习机制方面取得的进展，只有通过使用能够精确控制新运动技能习得过程的行为范式才得以实现。 例如， 熟练前肢取物。只有结构完善的行为学任务才能监测和捕捉学习及执行相应任务时发生的关联性变化。本文通过视频直观展示一种改良的大鼠熟练前肢单颗粒取物任务，该方法改编自 Buitrago 等¹⁷ 所呈现的范式可用于分析单次日常训练中的运动习得（会话内），反映快速学习成分和初级获取过程，以及跨多个训练会话的熟练运动学习（会话间），反映慢速学习成分及已习得任务的保持。¹⁸重要的是，由于以下两个特征，该行为范式增加了运动技能任务的难度和复杂性：第一，训练大鼠在每次抓取后围绕自身轴线转身，从而在下一次取食丸之前重新调整身体位置，更新身体朝向，防止始终从同一角度重复执行动作；第二，食丸从位于笼前的垂直杆上获取，由于杆的直径较小，食丸容易被碰落，因此需要精确抓握才能成功获取，从而避免动物通过简单地将食丸拉向自身的方式完成任务。

这种复杂的动物行为测试有助于深入理解运动学习的潜在机制。与小鼠相比，大鼠在执行复杂行为任务方面表现更优，因此更适合用于本研究中所呈现的复杂实验范式。考虑到目前大鼠在遗传学操作方面的可能性日益增加^19,20，将精确且受控良好的行为测试方法与遗传操作、成像技术及生理学技术相结合，为深入理解运动学习与记忆的神经生物学基础提供了一套强大的研究工具。

方案

所有实验均按照瑞士苏黎世州兽医办公室的指南进行。

1. 动物操作与适应

1. 动物操作
   注意: 实验开始前5天起，每天执行步骤1.1.1。
   1. 在行为学实验中，需使动物适应实验操作者。每天进行一次抓取驯化，每只动物持续10–15分钟。每次动物实验结束后清洁实验箱。
      1. 首先，将实验者的手放入笼内，让动物探索并嗅闻，以熟悉实验者。
      2. 接下来，实验人员用手以安全的方式轻轻提起动物，抓住大鼠前肢与后肢之间的身体部位，使其进一步适应。
   2. 每日称量每只动物的体重，以获得禁食前的基础体重。
2. 仪器适应与食物熟悉化
   1. 每日称量每只动物的体重，以获得食物剥夺前的基础体重。
   2. 在开始预训练前3天，开始对大鼠进行食物剥夺，标准实验室饮食条件下，每日给予大鼠0.05 g食物/每1 g体重（例如， 一只体重为200 g的大鼠，初始喂食量为10 g。通过每日监测体重，确保每日体重下降不超过10%。
      1. 如果多只动物饲养在同一个笼子中，优势鼠可能比劣势鼠进食更多。若某只动物的体重下降，应将其单独喂养，而非群体喂养。给予饮水 随意.
   3. 为了让大鼠熟悉抓握装置，将动物放入训练箱中（图1）。在训练箱内靠近狭缝开口处放置糖颗粒，使动物熟悉食物颗粒。每天执行此步骤10-15分钟，持续3天。

2. 预训练与运动技能学习

1. 预训练
   1. 熟悉化训练一天后，将动物放入训练箱内，并将食物颗粒放置在靠近狭缝开口处，使其能够被动物的舌头触及。在预训练阶段使用前肢取食颗粒的动物应予以剔除。
      注意: 在此阶段，动物通常首选用舌头获取食丸，这一行为至关重要。在运动技能学习的第一天之前，绝不可使用前肢抓取食丸，以确保对习得的伸手任务进行充分监测。在预训练期间若出现以前肢抓取食丸的行为，则作为排除标准，且大多数情况下不会观察到该行为。
   2. 训练大鼠跑至笼子后端并返回狭缝开口处，或向后退一步并绕自身轴线转身，以用舌头获取下一颗食物颗粒。给予动物足够时间探索笼内环境，跑至后端并返回狭缝开口处。若动物未能正确执行任务，可用镊子轻轻敲击笼子后端以引起其注意。当动物到达笼子后端后，再轻轻敲击笼子前端，引导其返回狭缝开口处。
      注意: 一旦动物达到规定的标准值（例如， 在15分钟内用舌头成功取回50个颗粒，动物即符合进入运动技能学习阶段的条件。在预训练的第1天和第2天，即可区分学习者与非学习者。非学习者可在该步骤被排除出研究，从而降低在运动学习阶段（2.2）出现大量非学习者的可能性。
   3. 在预训练期间，对大鼠进行标准实验室饮食的食物剥夺处理。给予水 随意摄取每日监测动物体重。训练雄性和雌性大鼠时，不得使用同一房间。确保动物处于安静、无噪音的环境中。
2. 爪偏侧性测定与运动技能学习
   1. 在运动技能学习的第一阶段，将窗口前方的滑块替换为一根立柱。将糖块放置在立柱上，距离窗口约1.5 cm，使动物无法用舌头够到糖块，只能通过精确的前肢伸抓动作才能获取。
      1. 为促使动物使用前肢获取颗粒，可用镊子轻轻将颗粒移至动物嘴边，并在动物试图用舌头摄取时缓慢撤回颗粒。重复此操作，直至动物伸出前肢并抓取颗粒。
   2. 将立柱置于窗口开口中央。为确定前爪偏好，在训练第1天仔细观察前10次试验。超过70%的抓取尝试（即， 7 次）必须使用同侧前肢完成。若未达到此标准，则继续进行下一轮 10 次试验，直至达到 70% 的阈值。
   3. 确定爪偏好后，将立柱向偏好前肢一侧移动，并使其与窗口开口的边界居中对齐。偏好爪对齐是指将立柱向对应爪子的相反方向移动，以提供最佳的抓取角度。图1B、C).
   4. 将每次试验（定义为向动物呈现一个新的食丸）分类为成功（触及、抓握、取回并吃掉食丸）、掉落（触及、抓握，但在取回过程中丢失食丸）或失败（将食丸从支架上击落）。在记录表中逐项记录每次试验结果，并在实验结束后分析数据。
   5. 每天进行一次包含固定次数试验的训练 session（试验 session）例如， 150）或最长时间（例如， 每只动物1小时
   6. 使用首次尝试分析法研究运动的精确性与精细调节。首次尝试定义为大鼠以单一、连续的动作抓取颗粒，过程中无中断、犹豫或动作组分的重复。仔细观察大鼠的每一次抓取动作。
      1. 如果大鼠在伸爪过程中犹豫或回缩，或经过多次尝试才成功抓取颗粒，则将该次试验记录为成功但非首次尝试。若动物通过一次连贯的伸爪动作成功抓取颗粒，则在记录表的单独一栏中将该次试验记为首次尝试成功。
   7. 在运动技能学习期间，给予大鼠标准实验室饮食并进行食物剥夺。提供水 随意摄取每日监测体重变化。

结果

成功的运动技能习得只有通过持续练习才能实现。尽管已仔细考虑了所有因素，仍有一些大鼠无法学会该任务（图2）。这些“未学会者”要么从实验开始就缺乏动机，导致很少或完全不尝试取回食物颗粒，要么总体上对抓取食物颗粒失去兴趣，从而持续尝试失败。相比之下，有些动物表现出攻击性或过度动机行为，导致抓取动作过于仓促和急躁，进而导致失败。第三类学习不成功者是那些起始成功率较高但未能取得显著进步的动物，其学习曲线趋于停滞甚至下降。

成功的运动技能学习包含两个阶段：快速学习阶段，代表技能的初步获得，通常在运动训练的第一天内观察到（会话内；图3）；以及熟练运动学习阶段，通过多次重复训练会话实现（会话间，图4），代表慢速学习成分及所学任务的巩固。会话间学习曲线的特点是在第1至第3天呈现陡峭的学习曲线，而在学习后期则趋于平台期。

为了分析每次每日训练 session 中的表现（session 内分析），将总试验次数分为每 25 次试验为一个区段（...

讨论

本研究所采用的范式改编自 Buitrago et al.¹⁸，与经典单颗粒抓取范式¹⁷相比，主要在以下两个方面有所不同：

首先，研究单次训练 session 内的改善情况，可分析单日内习得任务的表现，从而提供不同于每日平均值所反映的慢速学习成分的信息，例如对快速学习成分的考察（见图3和图4）。其次，本文所介绍的行为范式提高了运动技能任务的难度和复杂性。动物在每次获取食丸前，必须重新调整身体姿势和抓取方向，这阻止了从同一角度进行简单重复的动作执行，并要求具备较强的空间定向能力。此外，食丸被放置在笼前一根细长的垂直杆上，杆的直径与食丸直径相匹配，因此成功获取需要精确的抓握动作，而无法通过简单地将食丸拉向动物身体来完成。

一个重要的步骤是在预训练期间教会动物跑向笼子后部并返回到狭缝开口处。使用镊子轻轻敲击笼子后壁，提示大鼠到达目标位置，有助于动物理解任务要求。实验者应谨慎使用该工具，过度敲击会产生过多噪音...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
训练箱			自制
底座			自制
糖颗粒	TSE Systems Intl. Group		45 mg 无尘精密颗粒
Sprague Dawley 大鼠			5–6 周龄雄性
笔记本电脑	Hewlett Packard
秒表
镊子	Fine Science Tools (FST)
Excel	Microsoft
Prism	GraphPad
电子天平
计数器