本文介绍了一种采用肉汤微量稀释参考方法测定临床相关革兰氏阳性菌对达巴万星敏感性的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
抗菌药物敏感性试验（AST）用于评估抗菌药物对各种细菌的体外活性。AST结果以最小抑菌浓度（MIC）表示，可用于抗菌药物研发和耐药性发展的监测，以及临床中指导抗菌治疗。达巴万星是一种半合成脂糖肽类抗菌药物，于2014年5月获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗由革兰阳性菌引起的急性细菌性皮肤及皮肤结构感染。与当前抗葡萄球菌疗法相比，达巴万星的优势在于其半衰期长，可实现每周一次给药。达巴万星对金黄色葡萄球菌（包括甲氧西林敏感的S. aureus [MSSA] 和甲氧西林耐药的S. aureus [MRSA]）、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、咽峡炎链球菌群、β-溶血性链球菌以及万古霉素敏感的肠球菌均具有抗菌活性。与其他新型脂糖肽类抗菌药物类似，优化临床和实验室标准协会（CLSI）和国际标准化组织（ISO）的肉汤稀释法检测方法时，需在配制储备液时使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，并添加聚山梨酯80（P80）以减少药物在塑料器皿表面的吸附。在临床研究开始前及达巴万星早期研发阶段，尚未使用P80进行敏感性试验，所得MIC值通常高出2–4倍；同样，采用琼脂稀释法检测时也获得较高的MIC值。达巴万星于2005年首次被纳入CLSI微量肉汤稀释法的推荐表格中，并于2006年修订，进一步明确了DMSO和P80的使用。本文所示的微量肉汤稀释法（BMD）专用于达巴万星，符合CLSI和ISO方法要求，详细描述了操作步骤，并特别强调关键步骤以增强可读性和准确性。
引言
达巴万星是一种半合成脂糖肽类抗生素，于2014年5月获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗由革兰氏阳性菌引起的急性细菌性皮肤及皮肤结构感染1。以视频形式详细展示该方法的主要目的是为临床实验室和科研人员提供清晰的指导，以确保达巴万星药敏试验结果的准确性与可重复性，并规范结果报告流程。
通过商业方法测定抗菌剂的最低抑菌浓度（MIC）是临床实验室常规开展的工作，用于评估抗菌剂对致病菌的体外活性。本文所述方法为美国临床和实验室标准协会（CLSI）及国际标准化组织（ISO）推荐的肉汤微量稀释法2,3,4。由于目前尚无可用于达巴万星的商业化药敏检测方法（截至本出版物发布时），且纸片扩散法和琼脂稀释法目前均不推荐用于达巴万星检测，因此参考肉汤稀释法是当前唯一可用的选择12,14。由于该参考方法并非经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的商业化体外诊断方法，美国境内临床实验室若将此方法用于患者检测，必须遵守实验室自建检测项目（LDT）的相关监管要求。随着达巴万星临床应用的增加，预计将有更多实验室需要开展该药物的检测。已有研究证实，使用万古霉素药敏结果作为金黄色葡萄球菌对达巴万星敏感性的替代指标是可行的5。然而，达巴万星可能对万古霉素中介的金黄色葡萄球菌（VISA）仍具活性，因此临床医生可能要求提供达巴万星的MIC检测结果。此外，也可能需要获取其他细菌种类的MIC结果。
美国食品药品监督管理局（FDA）已将达巴万星对S. aureus的敏感折点确定为≤0.12 µg/ml。由于缺乏对耐药分离株的数据，FDA仅设立了敏感类别。野生型S. aureus分离株的正常MIC分布范围为0.03–0.12 µg/ml，其最常见MIC值（modal MIC）明确为0.06 µg/ml。由于方法学差异导致的MIC结果微小变化，加上微量肉汤稀释法（BMD）本身固有的±一个稀释度的变异，可能对敏感率产生显著影响6。与其他脂糖肽类药物类似，达巴万星的药敏试验具有挑战性，原因在于其溶解度较低、分子相对较大以及结合特性7,8,9。本文所述的参考BMD方法包含两个针对不溶性药物和/或脂糖肽类药物特有的关键步骤：（1）使用DMSO制备储备液；（2）在最终MIC检测板的稀释液中添加0.002%的P-80。本视频出版物的目的是阐明达巴万星BMD方法，并重点聚焦于这两个关键步骤，以确保MIC结果的准确性和可重复性。
方案
注意：有关抗菌药物敏感性参考肉汤稀释法的完整细节，请参阅 CLSI 文件 M7-A10 和 M100-S25 及/或 ISO/FDIS 20776-12, 3, 4。参考方法在接种物制备和 MIC 微孔板制备等某些具体操作步骤上允许存在一定选择性，以达到相同的最终结果。本文所述方法针对一种抗菌药物——达巴万星（dalbavancin），其中部分步骤仅代表参考方法可能采用的多种操作方式之一。应采取适当的安全防护措施（符合生物安全二级标准）10。本视频出版物所用的 MIC 微孔板格式见表1。
1. 储存达巴万星粉末
- 收到诊断级达巴万星粉末后，应将其储存在非除霜冰箱中干燥的环境中，温度为 -20 oC。使用前，粉末需在打开前平衡至室温。
2. 准备 MIC 板稀释液
- 在无菌玻璃或塑料管中，用纯DMSO配制浓度不高于1,600 µg/ml的达巴万星储备液，现配现用，或于-20至-60℃保存 oC或更低温度的无霜冷冻柜中以备将来使用。称量粉末时，请参考随粉末提供的文件中注明的达巴万星效价（见 公式 1 例如800 µg/ml的储备液制备。
- 将储备液稀释，稀释方案参照第1列（“源浓度”）所示方案进行 表 2 使用无菌玻璃管或塑料管，以纯净的DMSO进行稀释。使用一支移液器量取稀释液，另一支移液器将初始的达巴万星储备液加入第一支试管中。每配制一种后续的达巴万星储备液浓度时，均须使用新的移液器。
- 用纯DMSO配制100倍终浓度MIC板中间浓度稀释液。如第2-4列所示 表2，混合适量的原液与DMSO，以获得所需的中间浓度（所用体积取决于需制备的MIC板数量）。
- 制备0.004% P80：通过将0.1 ml P80加入4.9 ml dH₂O中，配制新鲜的2% P80工作液2O. 通过0.22微米滤器过滤除菌，于配制当天使用。通过将2% P80按1:500稀释制备0.004% P80稀释液例如，将0.3 ml的2% P80加入149.7 ml CAMHB中。
- 将步骤 2.2 中制备的中间浓度溶液用阳离子调节的 Mueller Hinton 肉汤（CAMHB）进一步稀释 1:100，CAMHB 中需添加 0.004%（v/v）聚山梨酯-80（P-80）和/或 LHB（针对链球菌），上述添加剂的加入浓度应为最终浓度的两倍，因为接种物的加入（步骤 4.3）会导致 1:2 的稀释。参见第 6 和第 7 列 表2.
3. 准备 MIC 板
- 取50 µl步骤2.3中配制的每种达巴万星溶液，分别加入MIC板的相应孔中，并留出一个孔只加培养基（作为生长对照孔）。此步骤可使用带无菌吸头的多通道移液器操作。
- 立即使用MIC板，或用塑料封膜密封后放入塑料袋中，并立即置于≤-20 oC（最好≤-60 oC）的无霜冰箱中冷冻保存，直至使用。若使用冷冻的MIC板，使用前需去除密封膜，将单个MIC板置于实验台上15–30分钟 （直至孔内液体完全解冻），再进行后续的接种操作。
4. 接种 MIC 板，进行纯度检测和菌落计数设置
- 从18-24小时的血琼脂或其他非选择性琼脂平板上选取数个分离良好的菌落。用无菌接种环或拭子接触每个菌落顶部，转移至1-5 ml CAMHB或生理盐水中，直至菌悬液浊度与0.5麦氏标准比浊管相当。通过目视比浊或光度计设备评估浊度。
- 制备后15-30 min 内，将菌悬液以1:100比例稀释于CAMHB中（将100 µl加入10 ml CAMHB）。对于除S. pneumoniae外的大多数测试细菌，此稀释度可使最终孔内浓度达到5 × 105 CFU/ml（可接受范围为2-8 × 105 CFU/ml）。对于S. pneumoniae，由于其浊度与0.5麦氏标准相比通常明显偏低，因此应将菌悬液按1:25稀释（将400 µl加入10 ml CAMHB+10% +LHB）。
- 在菌悬液制备后15分钟内，用多通道移液器吸取50 µl最终菌液，加入第3步中已准备好的MIC板各孔中（除无菌对照孔外）。此步骤可使用带无菌吸头的多通道移液器操作。
- 通过无菌接种环取阳性生长对照孔中的1-10 µl等分试样，转移并涂布于非选择性琼脂平板（例如，含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂），进行纯度检查。
- 用单通道移液器和无菌吸头从生长对照孔中取10 µl，转移至10 ml生理盐水中（1:1,000稀释），进行菌落计数设置。混匀后，用单通道移液器和无菌吸头取100 µl转移至合适的非选择性琼脂培养基（例如，含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂），用无菌接种环在整个琼脂表面涂布，以不同方向重复两次，确保菌液均匀分布（1:10稀释）。
5. 培养 MIC 板、菌落计数及纯度平板
- 将每块MIC板或不超过4块板的堆叠用塑料袋、塑料胶带或紧密贴合的塑料盖密封，然后进行孵育。或者，将一块空的MIC板置于不超过4块MIC板的堆叠顶部，将一张湿润的纸巾放入塑料容器中，将MIC板放入该塑料容器内，并用盖子严密封闭容器。
- 将 MIC 板置于 35 °C ± 2 °C 的常温空气培养箱中孵育，葡萄球菌和肠球菌孵育 16–20 小时，链球菌孵育 20–24 小时，孵育时间应在 30 分钟内开始 接种后，将菌落计数和纯度平板在相同条件下培养，但链球菌需在5% CO₂环境中培养。2 培养箱
6. 读取 MIC 和菌落计数平板；检查纯度平板
- 通过肉眼观察，将 MIC 读取为完全抑制孔中细菌生长的最低浓度。
- 计数菌落计数平板上的菌落数量。将每个菌落乘以稀释倍数（1:10,000）例如，50个菌落相当于5 × 105 CFU/ml）。可接受范围为 20-80 个菌落（2-8 × 105 CFU/ml）并用作近似参考指南。
- 检查纯度平板。如果所有菌落均与步骤 4.1 中所用菌落相似，则可认为接种物为纯培养；若存在其他形态的菌落，则可能存在污染，微量稀释板（MIC panel）中可能含有污染物，应重复试验。
7. 检查质量控制结果。
- 参见表3中CLSI质控菌株的预期范围。只有当质控菌株的达巴万星MIC结果处于预期范围内时，方可报告测试分离株的结果。
- 若任何临床分离的S. aureus菌株的MIC结果≥0.25 µg/ml，应重复达巴万星MIC检测和/或送至参考实验室进行验证。
结果
标准化的 MIC 方法对于监测耐药性的发展至关重要，这也是各类抗菌药物监测项目的重要目标。2011–2013 年在欧洲和美国收集的菌株的达巴万星 MIC 结果为 <0.25 µg/ml 99.9% S.aureus 和100%的链球菌（表 4).
为了评估使用新鲜（密封）DMSO的重要性，采用以下三种DMSO样品对质控菌株S. aureus ATCC 29213和E. faecalis ATCC 29212进行三份重复测试，对S. pneumoniae ATCC 49619进行两份重复测试：（1）来自密封安瓿瓶的DMSO；（2）来自1 L瓶装、在有效期内但已使用过2年的DMSO；（3）取自同一1 L瓶装（样品2）并在开放烧杯中静置72小时后使用的DMSO分装样品。使用这三种DMSO样品制备的微孔板所获得的达巴万星MIC结果相似，且均在可接受的质控范围之内（表5）。
已有充分文献记录表明，达巴万星原液在接触塑料材质且未添加P-80的情况下，其活性会丧失7。在另外两项研究中，向初始和中间原液中添加P-80（表6），以及使用玻璃或塑料管制备初始和中间原液（表7），均未对达巴万星的最低抑菌浓度（MIC）结果产生影响。当使用来自三家不同制造商的聚丙烯和聚苯乙烯板时，对达巴万星MIC结果亦无影响（表7）。
在链球菌检测的肉汤培养基中，裂解马血的存在已被证明具有类似表面活性剂的作用，其效果可与P-80相媲美7, 8。链球菌的达巴万星参考方法确实同时包含P-80和裂解马血；然而，与葡萄球菌和肠球菌不同，无论是否添加P-80，链球菌的达巴万星MIC结果均较为接近（在±1个稀释度范围内）。
如先前所述并如图1所示，达巴万星琼脂稀释法（AD）的最低抑菌浓度（MIC）通常比当前的BMD参考方法高出2-8倍12, 13, 14。与BMD不同，添加0.002%的P-80对达巴万星AD MIC结果无影响12。
公式1：达巴万星储备液配制示例。 配制25 ml浓度为800 µg/ml的达巴万星溶液的操作步骤。
图 1. 达巴万星与万古霉素肉汤微稀释法（BMD）与琼脂稀释法（AD）的比较。 本研究比较了达巴万星与万古霉素对部分革兰氏阳性菌分离株的肉汤微稀释法（BMD）和琼脂稀释法（AD）的最低抑菌浓度（MIC）结果。15 株Staphylococcus aureus、8 株凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）、5 株Enterococcus faecalis 和 14 株链球菌（A、B、C 群）的平均（A）达巴万星和（B）万古霉素肉汤微稀释法与琼脂稀释法 MIC 结果（单位：µg/ml）。请点击此处查看该图的高清版本。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| B | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| C | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| D | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| E | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| F | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| G | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| H | DAL 0.002 | DAL 0.004 | DAL 0.008 | DAL 0.015 | Dal 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | 阳性对照 |
| DAL | Dalbavancin | |||||||||||
| 浓度单位为 µg/ml，基于每孔接种 50 µl | ||||||||||||
表1. MIC 板布局。 本视频出版物中用作示例的96孔板布局，显示了达巴万星稀释液和阳性对照孔的位置
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 原料浓度 (µg/ml) | 原料体积 (ml) | DMSO 体积 (ml) | DMSO 中间浓度 (µg/ml) | 中间浓度取液体积 (ml) | CAMHB + 0.004% P80* 体积 (ml) | 在 CAMHB 中 1:100 稀释后的 2× 浓度 (µg/ml) | 接种后最终检测板浓度 (µg/ml) |
| 800 | 1.0 | 1.0 | 400 | 0.02 | 1.98 | 4 | 2 |
| 400 | 0.5 | 0.5 | 200 | 0.02 | 1.98 | 2 | 1 |
| 400 | 0.5 | 1.5 | 100 | 0.02 | 1.98 | 1 | 0.5 |
| 400 | 0.5 | 3.5 | 50 | 0.02 | 1.98 | 0.5 | 0.25 |
| 50 | 0.5 | 0.5 | 25 | 0.02 | 1.98 | 0.25 | 0.125 |
| 50 | 0.5 | 1.5 | 12.5 | 0.02 | 1.98 | 0.125 | 0.06 |
| 50 | 0.5 | 3.5 | 6.25 | 0.02 | 1.98 | 0.06 | 0.03 |
| 6.25 | 0.5 | 0.5 | 3.13 | 0.02 | 1.98 | 0.03 | 0.015 |
| 6.25 | 0.5 | 1.5 | 1.5 | 0.02 | 1.98 | 0.015 | 0.008 |
| 6.25 | 0.5 | 3.5 | 0.8 | 0.02 | 1.98 | 0.008 | 0.004 |
| 0.8 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.02 | 1.98 | 0.004 | 0.002 |
| 本表格经 CLSI M100-S25 表 8B3 修改而来 | |||||||
表2. 用于肉汤稀释法敏感性试验的难溶于水抗菌剂稀释液配制方案。 制备终浓度为0.002–2 µg/ml的达巴万星MIC溶液所需的达巴万星工作液与稀释剂的体积。
| 质量控制菌株 | 预期达巴万星 MIC (µg/ml) |
| S. aureus ATCC 29213 | 0.03-0.12 |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0.03-0.12 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0.008-0.03 |
表3. 质控菌株的达巴万星预期MIC结果3, 11。为验证方法学的正确性，CLSI建议在检测临床分离株的同时进行质控菌株的测试，本表为其质量控制结果
表 4. 美国和欧洲 2011–2013 年监测研究中达巴万星 MIC 结果的分布（各 MIC 值对应的菌株数）15。该数据来自一项已发表的研究，涵盖近期临床分离菌株，用于反映当前达巴万星体外活性情况。
| 分离株编号 | 达巴万星 MIC（µg/ml） | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| S. aureus ATCC 29213 | 0.12 | 0.06 | 0.06 |
| 0.12 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0.015 | 0.015 | 0.015 |
| 0.03 | 0.015 | 0.015 | |
| DMSO 1 = 未开封的火焰密封 10 ml 安瓿瓶 | |||
| DMSO 2 = 频繁开启的 1L 瓶装 | |||
| DMSO 3 = 频繁开启的 1L 瓶装 —— 置于敞口烧杯中在实验台上放置 72 小时 | |||
表5. 使用三种不同来源DMSO制备达巴万星储备液和中间稀释液所得的达巴万星MIC结果（µg/ml）。一项达巴万星MIC研究的结果，比较了在制备达巴万星储备液和中间稀释液时使用不同DMSO溶剂的影响。
| 分离株编号 | 重复编号 | 达巴万星 MIC (µg/ml) | |
| DALB 含 P80 溶于 DMSO | DALB 不含 P80 溶于 DMSO | ||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.06 |
| 2 | 0.06 | 0.06 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | |
| 4 | 0.06 | 0.06 | |
| S. aureus 临床株 DP80-002SA | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. aureus ATCC 700699 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0.03 | 0.015 |
| 2 | 0.03 | 0.015 | |
| 3 | 0.03 | 0.015 | |
| 4 | 0.03 | 0.015 | |
| S. pyogenes 临床株： | |||
| DP80-004PY | 1 | 0.015 | 0.015 |
| DP80-005PY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-006PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| DP80-007PY | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-008PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| S. agalactiae 临床株： | |||
| DP80-009AG | 1 | 0.06 | 0.12 |
| DP80-010AG | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-011AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-012AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| S. dysgalactiae 临床株 DP80-013DY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. pneumoniae 临床株： | |||
| DP80-014SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-015SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-016SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-017SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
表6. 使用DMSO储备液及含或不含0.002% P-80的中间稀释液制备的达巴万星MIC结果。 一项达巴万星MIC研究的结果，比较了在达巴万星储备液和中间稀释液中添加0.002% P-80的影响。
| 分离株 | 重复编号 | 储备液稀释管 | 微孔板（塑料类型） | ||||||
| 聚丙烯，Greiner | 聚苯乙烯 | ||||||||
| 玻璃 | 塑料 | 塑料 1小时 | 塑料 1小时 / 中间液 1小时 | Greiner | Corning | Nunc | |||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | 0.06 | 0.03 |
| 2 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | |
| 3 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 1 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 |
| 2 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
| 2 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | |
| 玻璃 = 初始储备液在玻璃瓶中配制，立即用于在塑料管中制备中间浓度，再立即用于制备肉汤稀释液。 | |||||||||
| 塑料 = 初始储备液在塑料离心管中配制，立即用于在塑料管中制备中间浓度，再立即用于制备肉汤稀释液。 | |||||||||
| 塑料 1小时 = 初始储备液在塑料离心管中配制，室温静置1小时后用于在塑料管中制备中间浓度，再立即用于制备肉汤中的浓度。 | |||||||||
| 塑料 1小时 / 中间液 1小时 = 初始储备液在塑料离心管中配制，室温静置1小时后用于在塑料管中制备中间浓度，中间液再室温静置1小时后用于制备肉汤中的浓度。 | |||||||||
表7. 使用塑料和玻璃试管配制储备液以及不同来源和类型的塑料微孔板进行达巴万星MIC实验的结果。 一项达巴万星MIC研究的结果，比较了在配制储备液时使用塑料或玻璃试管的影响，以及使用不同来源和类型的塑料微孔板的影响。
讨论
以下方法细节是在准备达巴万星 MIC 检测时需额外考虑的内容。MIC 面板的设计将取决于待检测抗菌剂的数量（即., 单独使用达巴万星或多种试剂）以及待测细菌的种类。达巴万星的浓度应涵盖所有待测细菌种属的解释性折点值，并包含至少一种质控菌株所预期的全部稀释范围。抗菌剂稀释系列可根据抗菌剂数量和/或每板分离株数量及接种方法，按行或按列排列。应计算达巴万星粉末与肉汤的体积，以确保生成适量试剂并尽量减少浪费。本出版物示例中，体积基于制备两块MIC板的需要进行计算。阳离子调节的Muller Hinton肉汤应按照生产商说明进行配制和高压灭菌，并验证培养基无菌。MIC板可在制备当日立即使用，也可使用适当的质控菌株进行测试，经验证合格的MIC板可冷冻保存以备后续使用。整个操作过程中必须采用无菌技术。
使用菌落计数法验证接种物浓度时，尚无严格的判定标准。可针对每种测试菌种在初期或定期进行菌落计数，以验证第4.2步中进行的稀释操作是否准确。同时，应定期使用E. coli ATCC 25922，参照类似第4.5步的操作程序，检查0.5麦氏标准液的有效性。若其浓度未达到1-2 × 108 CFU/ml，则应重新制备或获取新的0.5麦氏标准液。若MIC孔中获得的菌落计数超出可接受范围（2-8 × 105 CFU/ml），且临床分离株的MIC结果偏离预期的正常分布范围（例如S. aureus为0.03-0.12 µg/ml），和/或质量控制菌株的MIC结果超出预期范围，则必须进行验证性检测，并考虑对实验方法进行调整。建议使用经过验证的0.5麦氏标准液重复进行菌落计数；若结果仍偏离预期，则应相应调整第4.2步中的接种物稀释操作，并重复MIC试验。需注意，即使已进行菌落计数，仍需进行纯度检查，因为菌落计数操作所用的是稀释后的样本，可能无法检出低浓度的污染微生物。
要使最小抑菌浓度（MIC）测试被视为有效，生长对照孔中必须出现可接受的生长。对于大多数将接受达巴万星测试的细菌（例如，葡萄球菌、链球菌和肠球菌），生长通常表现为菌落团块（通常 >2 mm），较少情况下可能表现为孔内液体浑浊。与某些随着浓度升高可能出现拖尾效应的抗菌药物不同，达巴万星的终点通常十分明确。目前有多种观察装置可用于辅助判读微量稀释试验，只要不影响对孔内是否生长的判断，均可用于判读含达巴万星的微孔板。
该实验方案中的关键步骤与达巴万星的溶解度以及P80的添加有关。使用达巴万星时，其最高浓度不得超过1,600 µg/ml，必须使用DMSO作为溶剂，并且在进行肉汤稀释前，应先用DMSO配制中间浓度溶液，以确保MIC板孔中DMSO的终浓度不超过1%。DMSO具有吸湿性，因此所用DMSO试剂瓶的存放时间可能会影响达巴万星的溶解度。然而，尽管针对质控菌株开展的小规模BMD研究显示这一因素并非关键变量（见结果部分），但仍建议使用新开封或近期启用的DMSO试剂瓶。此外，在药物稀释液制备的最后一步，必须将P80加入肉汤中，并使其在MIC孔中的终浓度为0.002%。
此处包含的BMD实验步骤采用以下方法制备MIC微孔板：使用50 µl/孔的体积，加入浓度为最终浓度两倍的达巴万星和P-80溶液，再加入50 µl/孔的接种物，使每孔终体积为100 µl。该方法可通过向接种物中添加溶血马血，使同一MIC微孔板格式适用于S. aureus和S. pneumoniae的检测。CLSI和ISO操作规程中还描述了其他制备MIC微孔板的方法，例如使用100 µl/孔，并可额外加入最多10 µl/孔的试剂。
达巴万星对S. aureus的敏感折点为 ≤0.12 µg/ml（FDA药品说明书）。近期监测数据显示，大多数分离株在达巴万星浓度为0.06 µg/ml时即被抑制15。由于敏感折点接近众数MIC值，不同方法导致的MIC变异可能影响敏感率的判定。达巴万星的肉汤微稀释（BMD）实验包含若干独特步骤（特别是使用DMSO配制药物原液和中间稀释液，以及在MIC孔中加入0.002% P80），因此必须严格遵循标准操作流程。S. aureus质量控制菌株（ATCC 29213）的达巴万星众数MIC值明确为0.06 µg/ml，是检测方法变异性的良好指标，应常规用于BMD方法的验证。若MIC结果处于预期范围0.03–0.12 µg/ml之内，但持续偏向该范围的低端或高端，应进一步验证实验方法的可靠性。
建议对所有相关的革兰氏阳性菌（葡萄球菌、肠球菌和链球菌）添加0.002%的P80。然而值得注意的是，已有研究表明，裂解马血在抗结合能力方面的作用与P-80相似，且在CAMHB+LHB培养基中添加P-80对达巴万星抗链球菌的MIC结果无额外影响。
目前尚无用于测试达巴万星的纸片扩散法，由于BMD与AD结果的相关性较差，因此不推荐使用AD方法进行达巴万星的药敏试验12, 14。未来对达巴万星敏感性的评估应采用BMD方法，并将其作为开发商业化抗菌药物敏感性检测的金标准。
披露
Sandra McCurdy 是 Durata Therapeutics 的员工；Laura Koeth 和 Jeanna Fisher 的雇主 Laboratory Specialists, Inc. 受 Durata Therapeutics 委托负责准备本文稿。本文的出版费用由 Laboratory Specialists, Inc. 支付。
致谢
关于达巴万星药敏试验的前期工作对标准化方法的建立具有重要价值，特此感谢JMI实验室、Robert Rennie和Beth Goldstein对此工作的贡献。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 达巴万星 | Metrics, Inc. | 中国台湾，格林维尔 | BI-397 |
| 万古霉素 | Sigma-Aldrich | 美国密苏里州圣路易斯 | C5793 |
| 阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤 | Becton Dickinson | 斯帕克斯，医学博士 | 212322 |
| 溶血马血 | 克利夫兰科学 | 美国俄亥俄州巴特 | |
| Dose-it 蠕动泵 | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| 多通道移液器（Viaflo II） | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12通道移液器（Matrix） | 赛默飞世尔科技 | 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | |
| 单通道移液器（Ovation 10 µl - 100 µl) | VistaLab | 纽约州布鲁斯特 | |
| 96孔微孔板 | Greiner Bio-one | 北卡罗来纳州门罗 | 650161 |
| 50 ml 平盖锥底离心管 | 赛默飞世尔科技 | 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | |
| 16x125 mm 一次性玻璃试管 | ThermoFisher Scientific | 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | |
| 12x17 毫米螺帽，聚苯乙烯管 | 赛默飞世尔科技 | 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | |
| 16 ml 离心管 | BioExpress | 犹他州凯斯维尔 | C-3394-2 |
| 试剂储液槽 | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| 一次性无菌接种环（1 µl &和 10 µl) | Biologix | 堪萨斯州莱内萨 | 65-0001,65-0010 |
| 胰蛋白酶大豆琼脂 + 5% 羊血 | Becton Dickinson | 斯帕克斯，医学博士 | |
| 培养箱（常温） | Sanyo | ||
| 培养箱（5% CO₂） | Sanyo | ||
| 分析天平 | 赛默飞世尔科技 | 马萨诸塞州沃尔瑟姆 | |
| 手套 | Kimberly-Clark | 52817 | |
| 实验服 |
参考文献
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
重印与许可
