利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率

摘要

微生物群体中存在显著的细胞异质性，这种异质性可决定群体的整体行为。通过流式细胞术进行分子探针分析能够确定细胞的生理状态，但其应用效果在不同物种之间存在差异。本研究提供了一种准确测定蓝细菌群体中细胞死亡率的实验方案，可避免低估细胞死亡率或产生假阳性结果。

摘要

在野外和实验室研究中，微生物亚群在形态学和生理学参数方面表现出高度异质性。确定微生物细胞的实时状态已超越简单的“活”或“死”分类，因为微生物可能处于休眠状态，此时细胞分裂和代谢活动均降低。鉴于对微生物检测与定量的需求，结合分子探针的流式细胞术（FCM）提供了一种快速且准确的方法，有助于评估整个种群的活力状态。本研究利用SYTOX Green和SYTOX Orange对模式蓝细菌Microcystis aeruginosa进行膜完整性检测，建立了一种可转移的单细胞死亡快速指示方法。本文中所使用的分子探针分别称为绿色和橙色核酸探针（尽管存在其他具有相似激发和发射波长、作用机制类似的产品，但我们特指上述两种探针）。不同物种使用分子探针的实验方案存在差异，主要体现在探针浓度和孵育时间上。针对M. aeruginosa所建立的本方案中，绿色核酸探针在30分钟孵育后的最适浓度为0.5 µM，橙色核酸探针在10分钟孵育后的最适浓度为1 µM。若两种探针的浓度低于上述最优值，则会导致膜损伤细胞的检测结果偏低。相反，当两种探针的浓度达到5 µM或更高时，会出现非特异性染色现象，即“活”细胞产生目标荧光信号，从而高估“非存活”细胞的数量。阳性对照（热灭活）提供了可检测的死亡生物量，但对照制备方法的适宜性仍存在争议。通过系统展示绿色和橙色核酸探针优化的逻辑步骤，我们阐明了如何建立一套可用于有效分析蓝细菌生理状态的实验方案。

引言

细胞是一个复杂的系统，会通过改变生理参数和调整功能来持续响应环境变化。同基因型微生物群体在自然环境和实验室条件下的群体动态受到亚群形成的影响，即使在相对恒定的环境条件下也会出现这种现象^1-3。天然微生物群落的变异性源于环境条件的高度可变性。这些有时具有随机性的过程随后会产生与群体平均水平差异显著的生理亚群。最近的研究表明，这些生理亚群对环境条件的响应各不相同，并可能产生信号分子或抑制物，从而显著影响整个群体的行为和动态^3,4。

建立一种用于界定种群内异质性的方法，对于理解微生物在不同环境中的生态特征至关重要，且在研究有害蓝藻（如产毒蓝藻）时尤为关键 微囊藻，这对人类产生重大影响 水安全. 物种如 Anabaena 在环境波动下表现出形态异质性，可形成异形胞和厚壁孢子等特化细胞²相比之下， 微囊藻 细胞在应激反应期间未表现出明显的形态学异质性。区分活细胞与非活细胞是生理分化中最关键的方面，有助于更深入理解微生物群体动态。然而，细菌活力本身这一概念性问题仍然难以界定且表征不足^1,5,6.

流式细胞术（FCM）是一种可靠且快速的单个细胞分析方法。为了通过流式细胞术增进对单细胞生理学的理解，研究人员已使用分子探针来区分....

方案

1. 分子探针和流式细胞仪的准备

1. 将核酸探针的储存液（以5 mM浓度溶于二甲基亚砜（DMSO）中）稀释为所需浓度的等分试样，使用超纯过滤水（H₂O）配制₂O.
2. 在 -5 至 -20 °C 的避光条件下储存核酸探针 ^oC 和 -25 ^oC 保存至使用。
3. 打开流式细胞仪并加载软件包（参见材料/设备表中的流式细胞仪规格）。
4. 将一个空的溶血管（12 × 75 mm）置于样品进样探针（SIP）上，点击“unclog”然后“back flush”，以启动FCM清洗程序。
   注意：SIP 的某些样品台可容纳多种类型的试管，包括微量离心管。  流式细胞仪所用的分子探针稀释液和鞘液均来自经0.22 µm滤膜过滤的分析纯“一级”水源。
5. 放置一支含有2 ml新鲜溶血管 超纯过滤H₂在SIP上，设置10-15分钟的时间限制，并将流体速度设为快速（或设定流速为 >66 µl/min。
6. 选择一个新的数据细胞，设置荧光和光散射通道的相关阈值以减少背景噪声，然后点击“运行”。
7. 如果每秒总事件数未低于制造商建议值，则运行2 ml去污溶液样本2分钟 快速进行，然后重复步骤 1.4 & 1.5.
   注意：....

结果

处于指数生长期的 M.aeruginosa 批量培养物的前向光散射（FSC）和侧向光散射（SSC）输出分别提供有关细胞大小（直径）和内部颗粒度的信息（图 1A）。FSC 可用于区分过大或过小而不属于 M.aeruginosa 的细胞。这种区分或设门可通过限定 FSC 输出曲线上特定区间的信号数据来实现（图 1C）。藻蓝蛋白是 M.aeruginosa 光合作用系统的主要组分之一，在红光激发（ex: 640 nm；em: 675 ± 12.5 nm）下可产生强荧光信号，可用于进一步设门区分细胞群体，其原理类似于 FSC 设门，但基于荧光信号（图 1D）。结合 FSC 和荧光信号，可从原始输出数据中（图 1A）对 M.aeruginosa 相关数据进行设门，从而获得用于最终细胞计数的特异性数据（图 1B）。

讨论

使用分子探针的出版物数量不断增加，表明可以获得可靠且具有信息量的数据^{5,6,8-15,19,22,23}。迄今为止，尚无一种理想的细胞活力染料能够在所有物种中均以相同的浓度和孵育时间有效发挥作用^6,10。即使是荧光发射特性有所改变的同类型探针，也需要确定合适的浓度和孵育时间（表1 & 3）。如本实验方案所示，橙色核酸探针的最佳浓度和孵育时间为1 µM下孵育10分钟 ，而绿色核酸探针所需浓度仅为前者的一半，但孵育时间需延长至三倍（图5 & 6）。当这两种细胞膜不通透性氰化物单体的浓度超过1.0 µM时，开始在非膜损伤细胞中产生发射光谱的重叠。这种信号重叠表明发生了非特异性染色，即“活细胞”摄取了分子探针。非特异性染色导致的过强荧光产生了假阳性结果，凸显了为每种分子探针及目标生物体谨慎建立实验方案的必要性。优化分子探针最关键的步骤包括：1）理解分子探针与流式细胞仪（FCM）仪器之间的相互作用；2）采用合适的活细胞与死细胞对照；3）掌握来自FCM输出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝藻培养基	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 淡水浓缩液（稀释 50 倍）
去污染液	BD Biosciences	653155	当快速模式下每秒输出事件数超过 12 个或流速达到 66 µl/min 时，运行 2 分钟。  随后用鞘液 H2O 运行 2 分钟。
流式细胞仪	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	核酸染料 – DMSO 中 5 mM 溶液
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	核酸染料 – DMSO 中 5 mM 溶液