利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率

摘要

微生物群体中存在显著的细胞异质性，这种异质性可决定群体的整体行为。通过流式细胞术进行分子探针分析能够确定细胞的生理状态，但其应用效果在不同物种之间存在差异。本研究提供了一种准确测定蓝细菌群体中细胞死亡率的实验方案，可避免低估细胞死亡率或产生假阳性结果。

摘要

在野外和实验室研究中，微生物亚群在形态学和生理学参数方面表现出高度异质性。确定微生物细胞的实时状态已超越简单的“活”或“死”分类，因为微生物可能处于休眠状态，此时细胞分裂和代谢活动均降低。鉴于对微生物检测与定量的需求，结合分子探针的流式细胞术（FCM）提供了一种快速且准确的方法，有助于评估整个种群的活力状态。本研究利用SYTOX Green和SYTOX Orange对模式蓝细菌Microcystis aeruginosa进行膜完整性检测，建立了一种可转移的单细胞死亡快速指示方法。本文中所使用的分子探针分别称为绿色和橙色核酸探针（尽管存在其他具有相似激发和发射波长、作用机制类似的产品，但我们特指上述两种探针）。不同物种使用分子探针的实验方案存在差异，主要体现在探针浓度和孵育时间上。针对M. aeruginosa所建立的本方案中，绿色核酸探针在30分钟孵育后的最适浓度为0.5 µM，橙色核酸探针在10分钟孵育后的最适浓度为1 µM。若两种探针的浓度低于上述最优值，则会导致膜损伤细胞的检测结果偏低。相反，当两种探针的浓度达到5 µM或更高时，会出现非特异性染色现象，即“活”细胞产生目标荧光信号，从而高估“非存活”细胞的数量。阳性对照（热灭活）提供了可检测的死亡生物量，但对照制备方法的适宜性仍存在争议。通过系统展示绿色和橙色核酸探针优化的逻辑步骤，我们阐明了如何建立一套可用于有效分析蓝细菌生理状态的实验方案。

引言

细胞是一个复杂的系统，会通过改变生理参数和调整功能来持续响应环境变化。同基因型微生物群体在自然环境和实验室条件下的群体动态受到亚群形成的影响，即使在相对恒定的环境条件下也会出现这种现象^1-3。天然微生物群落的变异性源于环境条件的高度可变性。这些有时具有随机性的过程随后会产生与群体平均水平差异显著的生理亚群。最近的研究表明，这些生理亚群对环境条件的响应各不相同，并可能产生信号分子或抑制物，从而显著影响整个群体的行为和动态^3,4。

建立一种用于界定种群内异质性的方法，对于理解微生物在不同环境中的生态特征至关重要，且在研究有害蓝藻（如产毒蓝藻）时尤为关键 微囊藻，这对人类产生重大影响 水安全. 物种如 Anabaena 在环境波动下表现出形态异质性，可形成异形胞和厚壁孢子等特化细胞²相比之下， 微囊藻 细胞在应激反应期间未表现出明显的形态学异质性。区分活细胞与非活细胞是生理分化中最关键的方面，有助于更深入理解微生物群体动态。然而，细菌活力本身这一概念性问题仍然难以界定且表征不足^1,5,6.

流式细胞术（FCM）是一种可靠且快速的单个细胞分析方法。为了通过流式细胞术增进对单细胞生理学的理解，研究人员已使用分子探针来区分多种代谢和生化过程⁷。这使得在细胞和群体水平上对物种的认识不断加深，并进而有助于水资源管理^8,9。然而，由于细胞壁和细胞膜上的孔道和泵的存在，不同生物体在分子探针的摄取和外排方面存在差异，这促使了多种分子探针的设计及实验方案的建立^6,10,11。目前 commercially available 和用于科研的分子探针通常附带通用型实验方案，而这些方案可能适用于完全不同类型的细胞。因此，在将为某一细胞类型开发的实验方案应用于其他细胞类型时必须格外谨慎⁶，故而在使用前对分子探针进行有效优化是一项至关重要的任务。

绿色和橙色的核酸探针能够以极低的碱基选择性结合双链和单链核酸，用于评估细胞的质膜完整性。与基于碘化丙啶的化合物等其他分子探针相比，绿色核酸探针在细胞标记的荧光信号方面有显著提升¹²，也可作为细胞活力的指示剂。此处的“细胞活力”是指DNA降解发生在质膜完整性丧失之后。这些核酸探针为具有三个正电荷的不对称氰基染料，在已知浓度下无法进入质膜完整的细胞，这一特性在真核生物^11,13和原核生物^14,15中均成立。当核酸探针与核酸结合时，可使质膜完整性受损细胞内的内源性信号荧光发射增强超过>500倍。尽管分子探针（如绿色核酸探针）可良好地反映单个细胞的生理状态，但仍需针对目标生物体对每种探针进行优化，仅在铜绿微囊藻（Microcystis）的实验中，孵育时间就曾从7分钟 到30分钟 不等，浓度范围也从0.1 µM至0.5 µM不等^15-19。

本文介绍了一种优化绿色及相对较新的橙色核酸探针流式细胞检测方法的实验方案（迄今为止，该方法尚未在铜绿微囊藻（M.aeruginosa）这一蓝细菌物种上进行测试）。所建立的方法可推广应用于其他物种，并可作为优化其他分子探针检测方案的平台，从而加深对微生物及其生态行为的理解。

方案

1. 分子探针和流式细胞仪的准备

1. 将核酸探针的储存液（以5 mM浓度溶于二甲基亚砜（DMSO）中）稀释为所需浓度的等分试样，使用超纯过滤水（H₂O）配制₂O.
2. 在 -5 至 -20 °C 的避光条件下储存核酸探针 ^oC 和 -25 ^oC 保存至使用。
3. 打开流式细胞仪并加载软件包（参见材料/设备表中的流式细胞仪规格）。
4. 将一个空的溶血管（12 × 75 mm）置于样品进样探针（SIP）上，点击“unclog”然后“back flush”，以启动FCM清洗程序。
   注意：SIP 的某些样品台可容纳多种类型的试管，包括微量离心管。  流式细胞仪所用的分子探针稀释液和鞘液均来自经0.22 µm滤膜过滤的分析纯“一级”水源。
5. 放置一支含有2 ml新鲜溶血管 超纯过滤H₂在SIP上，设置10-15分钟的时间限制，并将流体速度设为快速（或设定流速为 >66 µl/min。
6. 选择一个新的数据细胞，设置荧光和光散射通道的相关阈值以减少背景噪声，然后点击“运行”。
7. 如果每秒总事件数未低于制造商建议值，则运行2 ml去污溶液样本2分钟 快速进行，然后重复步骤 1.4 & 1.5.
   注意：请查阅制造商关于流式细胞仪启动清洁程序的建议，因为不同型号之间的要求可能有所不同。  测试特定阈值时还需与流式细胞术（FCM）模型保持一致，因为某些设备允许用户对光电倍增管（PMTs）施加电压增益，从而增强或减弱从光学检测器记录的电信号。  本实验所用的FCM模型配备固定电压PMT，采用80,000前向光散射（FSC-H）作为阈值，以排除小于2.0 µm的颗粒及电子噪声。

2. 培养物的制备与初始细胞计数

1. 高压灭菌98 ml超纯过滤H₂O 和 2 ml 藻类培养基（50 倍浓度）置于 250 ml 烧杯中，孵育 20 分钟 在 120 ^oC.
2. 从最初的单一种群培养中 M.aeruginosa （PCC 7806）在高稳态密度下，取2 ml样品置于SIP下的试管中。通过涡旋振荡或超声处理分散任何可能形成的菌落。²⁰ 并通过光学显微镜确认细胞均匀分散。
   注意：超声波暴露过度可导致细胞裂解，应谨慎使用。  由于超声处理可使气囊泡破裂（如在某些物种中发现的） M.aeruginosa) 侧向光散射（SSC-H）强度等信号输出可能变得更加敏感。
3. 在流式细胞术软件中，选择直方图以记录前向散射光（FSC-H）数据，并通过点击配置图表参数 "对数" 以对数尺度显示在轴上。
4. 在另一个输出中，选择另一个直方图（对数轴）以记录天然荧光，例如存在于藻类中的辅助光合色素藻蓝蛋白（FL4-H，675 ± 12.5 nm）， M.aeruginosa.
5. 使用能够激发藻蓝蛋白的光源，以及可过滤荧光发射信号的检测器。
   注意光合色素（如叶绿素）可被常用的488 nm蓝激光激发，而藻蓝蛋白的激发波长超过600 nm，只能通过红光光源检测。²¹.  请查阅流式细胞仪制造商提供的激发光源以及发射检测器的光谱信息，此处使用了488 nm和640 nm两种激发光 激光被同时使用 675 ± 12.5 nm 光学滤光片
6. 为获得最高分辨率的图像，应选择与目标生物体核心尺寸（10 µm）最接近的设置，并采用相对较慢的流速（14 µl/min）。
   注意为了获得最佳分辨率，样品应按照制造商推荐的每秒事件数进行检测。
7. 在采集数据之前，使用阈值来设门，以排除由电子背景噪声或细胞样本碎片引起的光散射和/或荧光信号。
8. 选择一个新的数据单元，使用FSC-H和SSC-H参数在对数尺度上创建密度图，然后点击运行。
9. 如果样本浓度过高导致事件速率过快，可进行稀释以提高检测的准确性和精确性。
10. 在密度图上，应用之前直方图中的软件门控，排除由背景噪声或碎片产生的低水平散射信号（FSC <320,000）。反之，对细胞中相对荧光较高的藻蓝蛋白信号进行设门，仅包含这些事件（FL4，56,000 - 1,950,000）。
11. 利用门控区域内记录的细胞数量，除以流式细胞仪检测过程中通过的样品总体积，计算出每毫升的细胞数量。
    注意该FCM模型采用由微处理器控制的蠕动泵系统，可测定样品体积。  其他FCM设备可能需要校准微球悬浮液或进行H的计算₂O 重量/体积差异以验证总样本体积。
12. 将所需体积的细胞加入 freshly prepared 培养基中，以启动批次生长周期（250,000 个细胞/ml） M.aeruginosa.
    注意：不同物种的生长速率会因其种类而异 原位 环境参数和营养物质的可利用性，因此应预先记录一个批次周期以确定生命周期的各个阶段。

3. 分子探针细胞摄取的优化

1. 从第2步制备的处于指数生长期的 M.aeruginosa 培养物中收获一半，作为“活”对照。
   注意：将高密度培养物直接稀释至指数期可能因死细胞周转而影响优化结果，与从初始滞后期/诱导期接种的培养物相比存在差异。
2. 通过以下方法将另一半制备为“死”对照：70%乙醇处理、60 ^oC 加热1小时、使用多聚甲醛或4%甲醛处理30分钟^6,11,22。检查样品微环境（例如，pH）的变化。
   注意：M.aeruginosa 中阳性的、热灭活的“死”对照可通过藻蓝蛋白信号的降低与“活”样品区分开来。  使用其他方法诱导死亡可能不会产生相同的结果，且在不同物种中表现各异。
3. 使用不同比例的“活”和“死”样品（例如，0%、25%、50%、100%）制备混合样品。
4. 通过涡旋振荡或超声处理分散菌落结构，并检测pH值。
5. 选择488 nm激光器，配合可记录绿色（FL1，530 ± 15 nm）和橙色（FL2，585 ± 20 nm）核酸探针荧光的检测器，以及640 nm激光器，通过相应检测器记录藻蓝蛋白信号。
   注意：当与DNA结合时，绿色核酸探针的荧光激发波长约为504 nm，发射峰值为523 nm；而橙色核酸探针的激发波长为547 nm，发射峰值为570 nm。  可使用488 nm氩离子固态激光器激发两种分子探针，但绿色激光（最高至547 nm）可产生更强的橙色荧光。
6. 以制造商推荐的浓度将分子探针加入50%“活”和50%“死”的培养物中，作为起始点，并在避光条件下孵育。
7. 选择一个新的数据单元，将样品置于SIP下，设置阈值和触发条件以降低背景噪声（FSC-H 80,000）。
8. 创建一个以FSC-H和SSC-H为参数的密度图，以及三个直方图：一个使用相应的分子探针光学检测通道（FL1或FL2），一个用于检测藻蓝蛋白发射信号（FL4-H），另一个为FSC-H，均采用对数刻度。
9. 将M.aeruginosa样品与核酸探针在避光条件下孵育最多60分钟，在多个时间点（1、5、10、15、30和60分钟）分别记录于不同的数据单元中。
   注意：在调节pH等参数时，需查阅制造商说明，确认某些化学物质是否可能引发反应（对于测试的核酸探针，缓冲液中不能含有磷酸盐或高浓度的一价或二价阳离子，否则会影响与DNA的结合）。
10. 应用软件门控，仅将目标生物细胞大小范围内的FSC-H直方图（320,000 - 1,500,000）纳入相应的荧光探针通道直方图中。
    注意：本方案中使用的浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、50和100 µM，可通过增加或减少M.aeruginosa样品体积或核酸探针初始储备液的体积进行调整。
11. 在荧光探针通道中，对直方图中的最高峰应用另一个包含性软件门控（绿色FL1-H：240,000 - 1,650,000；橙色FL2-H：30,000 - 165,000），随后将该阳性探针荧光信号门控至密度图中。
12. 对100%"活"、100%“死”及所有混合培养样品重复执行步骤3.1–3.11，必要时调整分子探针浓度（例如×0.1至×10）和/或温度与pH水平。
13. 将阳性分子探针荧光信号的数量与“死”细胞的原始细胞密度（来自总FSC-H的一半或100%“死”培养物）进行比较，计算出被核酸探针染色的细胞总百分比。
14. 对每个浓度下的各个时间段均进行上述分析，以确定在不产生非特异性染色的前提下，细胞核酸探针摄取率最高的最佳实验方案（若数据为非参数型，可使用单因素方差分析One-Way ANOVA或Kruskal-Wallis单因素秩和检验的均值进行分析）。

4. 分子探针荧光鉴别

1. 为检测来自细胞内在荧光或非特异性染色的荧光干扰/重叠，请选择50%“活”细胞与50%“死”细胞混合培养的数据，并移除所有门控。
2. 应用软件门控，仅将目标生物细胞大小范围（320,000 - 1,500,000）的FSC-H直方图纳入藻蓝蛋白通道直方图中。
3. 对藻蓝蛋白信号的最高峰进行门控，并标记为“活”细胞，同时将最低峰标记为“死”细胞。
4. 进一步在相应的分子探针荧光直方图通道中进行门控操作，依次使用“活”细胞和“死”细胞的藻蓝蛋白（FL4）信号，分别记录两者的平均波长。
   注意：  本实验中诱导细胞死亡的方法为热处理，根据该方案，此方法可明显降低藻蓝蛋白信号。  使用其他方法制备“死”细胞群体可能在检测运行中产生不同的结果。
5. 计算分子探针阳性荧光（“死”细胞）与内在/非特异性信号（“活”细胞）的平均波长比值，以确定该方案的灵敏度。
   注意：为提高“活”与“死”细胞群体的荧光区分能力，可增加碳源以促进营养缺乏细胞对活性染料的摄取，或添加乙二胺四乙酸（EDTA）以增强细胞壁通透性，从而提升荧光信号强度⁶。  某些流式细胞仪型号对光谱重叠的补偿能力有限，用户可在样本采集过程中通过手动调节光电倍增管电压进行成对校正，或使用后期分析专用软件进行校正。
6. 选择最优方案，即在未出现非特异性染色的前提下，使最多数量的“死”细胞被染色的条件。若多个测试结果相似，则采纳染色剂浓度最低、孵育时间最短且荧光信号区分良好的方案。随后按照仪器制造商的说明执行流式细胞仪的关机程序。

结果

处于指数生长期的 M.aeruginosa 批量培养物的前向光散射（FSC）和侧向光散射（SSC）输出分别提供有关细胞大小（直径）和内部颗粒度的信息（图 1A）。FSC 可用于区分过大或过小而不属于 M.aeruginosa 的细胞。这种区分或设门可通过限定 FSC 输出曲线上特定区间的信号数据来实现（图 1C）。藻蓝蛋白是 M.aeruginosa 光合作用系统的主要组分之一，在红光激发（ex: 640 nm；em: 675 ± 12.5 nm）下可产生强荧光信号，可用于进一步设门区分细胞群体，其原理类似于 FSC 设门，但基于荧光信号（图 1D）。结合 FSC 和荧光信号，可从原始输出数据中（图 1A）对 M.aeruginosa 相关数据进行设门，从而获得用于最终细胞计数的特异性数据（图 1B）。

讨论

使用分子探针的出版物数量不断增加，表明可以获得可靠且具有信息量的数据^{5,6,8-15,19,22,23}。迄今为止，尚无一种理想的细胞活力染料能够在所有物种中均以相同的浓度和孵育时间有效发挥作用^6,10。即使是荧光发射特性有所改变的同类型探针，也需要确定合适的浓度和孵育时间（表1 & 3）。如本实验方案所示，橙色核酸探针的最佳浓度和孵育时间为1 µM下孵育10分钟 ，而绿色核酸探针所需浓度仅为前者的一半，但孵育时间需延长至三倍（图5 & 6）。当这两种细胞膜不通透性氰化物单体的浓度超过1.0 µM时，开始在非膜损伤细胞中产生发射光谱的重叠。这种信号重叠表明发生了非特异性染色，即“活细胞”摄取了分子探针。非特异性染色导致的过强荧光产生了假阳性结果，凸显了为每种分子探针及目标生物体谨慎建立实验方案的必要性。优化分子探针最关键的步骤包括：1）理解分子探针与流式细胞仪（FCM）仪器之间的相互作用；2）采用合适的活细胞与死细胞对照；3）掌握来自FCM输出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝藻培养基	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 淡水浓缩液（稀释 50 倍）
去污染液	BD Biosciences	653155	当快速模式下每秒输出事件数超过 12 个或流速达到 66 µl/min 时，运行 2 分钟。  随后用鞘液 H2O 运行 2 分钟。
流式细胞仪	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	核酸染料 – DMSO 中 5 mM 溶液
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	核酸染料 – DMSO 中 5 mM 溶液