分子探针的优化，以确定细胞死亡的光合生物（铜绿微囊藻）使用流式细胞仪

摘要

微生物群含有大量细胞的异质性，它可以决定整体行为。通过流式细胞分子探针分析可以决定细胞的生理状态，然而它的应用物种之间变化。本研究提供了一个协议，以精确地确定一个蓝藻群体内的细胞死亡，而不低估或记录假阳性结果。

摘要

在野外和实验室研究微生物亚群已经示出，以显示高的异质性的形态和生理参数。确定微生物细胞的实时状态超出活的或死的类型，如微生物可以处于休眠状态，由此细胞的分裂和代谢活性被降低存在。鉴于需要检测和微生物的定量，流式细胞术（FCM）用分子探针提供了一种快速，准确的方法，以帮助确定总体人口生存能力。通过使用SYTOX绿色和橙色SYTOX模型中的蓝藻铜绿微囊藻检测细胞膜的完整性，我们开发了单细胞死亡率迅速指示的转移方法。在该刊物中使用的分子探针将被分别称为绿色或橙色核酸探针（虽然也有其他的产品与具有共同行动的一个可比较的方式类似激发和发射波长N，我们专门请参考前面提到的探针）。利用分子探针协议物种之间有所不同，在浓度和温育时间不同的主要。根据这一协议，载于微囊藻绿色核酸探针孵育30分钟，并在1μM橙色核酸探针10分钟后，经过优化的0.5μM的浓度。在这两个探测器的浓度低于规定的优化导致了在报告细胞的细胞膜破坏。相反地​​，5μM的浓度和较高的两种探针表现出型非特异性染色的，由此"活的"细胞产生的目标的荧光，导致"非活"的细胞数目过表示。阳性对照（热灭活）提供的可检验的死亡生物量，虽然在控制一代的适当性还有待讨论。通过展示步骤的逻辑顺序进行优化绿色和橙色核酸探针，我们去monstrate如何创建，可以用来有效地分析蓝藻生理状态的协议。

引言

细胞是一个复杂的系统，它不断地通过修改的生理参数和改变其功能响应环境。无论是在自然和实验室等基因微生物种群的种群动态是由亚群的发展受到影响，即使在相对 ​​恒定的环境条件发生^{1 - 3。}天然微生物群落的变异性的出现是由于环境条件的高度可变的性质。这些有时随机过程随后产生亚群是非常不同的人群的平均水平。最近的证据表明，这些亚群生理反应不同的环境条件，并且能够产生信号的化合物或抑制剂显着影响，并影响整体人口^3,4。

建立以群体内定义的异质性的方法，关键是未derstanding在各种环境中的微生物的生态和建设时滋扰蓝藻知识，如有毒的微囊 ，从而影响严重人类水的安全性。物种如鱼腥响应于环境波动显示形态异质性，开发专门细胞如异形是必不可少和akinetes ^2。与此相反， 微囊细胞不期间应激反应显示明显的形态的异质性。可行的和非存活细胞之间的区别是生理分化的最重要的方面，并且允许更好地理解微生物种群动态的。然而，细菌存活本身的概念性的问题仍然是困难和特征^1,5,6很差。

流式细胞术（FCM）是分析单个细胞的可靠和快速的方法。为了提高单细胞生理的理解通过FCM迟缓，分子探针已被用于区分一个号码代谢和生化过程^7。这导致了物种对细胞和群体水平增加的知识和反过来帮助水资源管理^8,9。然而，在生物分子探针摄取和排出方面由于孔隙和泵在蜂窝壁和细胞膜，这都导致了许多分子探针设计和协议实现^6,10,11不同。可用于商业和研究用途分子探针通常与一个通用的协议，该协议可以是适用于非常不同的细胞类型提供。我们必须在传输的一种细胞类型开发协议， ^另外 6非常谨慎，因此它是一个重要的任务，使用前有效地优化分子探针。

绿色和橙色核酸探针结合于两个双和单链核酸与最小化的基本选择ivity和用于评估细胞质膜完整性。绿色核酸探针具有显着改善的细胞标记的荧光信号相对于其它分子探针，如碘化丙啶-基化合物^12，它也可以作为细胞活力的指标。术语"细胞活力"这里假定DNA降解的细胞膜完整性的丧失后出现。所述核酸探针是不对称花青染料具有三个正电荷和不能进入细胞胎膜完整特征的浓度下，在这两种真核^11,13和^14,15原核生物有机体。的核酸探针与核酸的结合可导致多达从内源性信号荧光发射中的细胞，具有其膜完整性破坏一个> 500倍增加。虽然分子探针如绿色核酸探针可以是单细胞生理学的良好指标，有必要吨Ø优化每个探头的预定目标生物体，如孵化时间从7分钟变化-在微囊藻实验中0.5微米单独^{15 -} - 30分钟，浓度为^0.1μM19。

在这里，我们提出了一个协议，以优化绿色的流式细胞检测和比较新的橙核酸探针（其至今尚未测试的蓝藻种类微囊藻 ）。下面发达方法然后可以转移到其他物种和用作其它分子探针优化协议，从而增加微生物的理解及其生态行为的平台。

方案

1.准备分子探针和流式细胞仪

1. 稀释储备溶液的核酸探针，它们被提供在二甲基亚砜（DMSO）5mM溶液至所需浓度的等分试样的超纯过滤_的 H 2 O.
2. 存储核酸探针在^-5℃，与黑暗的条件- ^25°C，直到使用。
3. 打开流式细胞仪和负载软件包（见表材料/设备的FCM规格）。
4. 放置在进样探针（SIP）的空溶血管（12×75毫米），点击疏通，然后再冲水启动FCM清洗过程。
   注 :为SIP一些样品台可容纳多种类型的管子，包括离心管中。在FCM装置中使用的分子探针稀释剂和鞘流体是从分析级"1型"0.22μm滤膜过滤源。
5. 地点15分钟和流体速度快（或> 66微升/分钟的流速） -一个新鲜溶血管与2ml超纯过滤_H 2 O的的SIP上，为10设定时间限制。
6. 选择一个新的数据单元，把相关阈值，荧光和光散射渠道，降低背景噪音，然后单击"运行"。
7. 如果每秒的总事件不是低于制造商的建议，然后运行2ml样品的去污溶液对快2分钟，然后重复步骤1.4＆1.5。
   注 :请检查制造商对FCM建议启动清洁的协议，因为他们可以型号而有所不同。测试对于特定阈值也需要在与FCM模型线作为一些设备允许用户申请的电压增益，以光电倍增管（PMT）增强或减少从光检测器记录的电信号。在这个experi使用的FCM模型换货有固定电压光电倍增管和使用80,000前向光散射（FSC-H）的阈值以排除颗粒小于2.0微米和电子噪音。

2.准备工作文化与初始细胞计数

1. 高压釜98毫升超纯过滤_的 H 2 O和2 ml的藻媒体（50倍 ​​浓度）在250ml烧杯中20分钟的在^120℃。
2. 从微囊藻 （PCC 7806）的在一个高稳定状态密度地点2毫升样品的初始单一到SIP下的管。分解任何集落形成涡旋或超声处理²⁰并通过光学显微镜确认均匀分散细胞。
   注 :过度暴露于超声波可导致细胞裂解，应谨慎使用。因为超声波可以折叠气囊产出，如侧向光散射（如物种，如微囊藻中）（SSC-H）的强度可以变得更SEnsitive。
3. 内将FCM软件，选择直方图来记录从正向光散射（FSC-H）数据，并通过点击"登录"，以查看在轴线对数标尺配置情节规格。
4. 在一个单独的输出，选择另一个直方图（登录轴）来记录自然荧光，如附件光合色素藻蓝蛋白（FL4-H，675±12.5纳米），在微囊藻找到。
5. 使用能够激发藻蓝蛋白和一个检测器，它可以从所得荧光过滤排放的光源。
   注 :光合色素如叶绿素可以兴奋与常用的488纳米的蓝色激光，而藻蓝蛋白是奋达600纳米，只会有一个红色的光源²¹进行检测。检查与流式细胞仪的制造商为激励光源和发射检测器的光谱，这里既一个488纳米，640纳米的激光被连同用于一个675±12.5 nm的光学滤波器。
6. 用于记录的最接近目标生物体（10微米）和相对慢的流速（14微升/分钟）的芯尺寸的最高分辨率选择设置。
   注:最佳分辨率样品应按照制造商每秒事件的建议下运行。
7. 采集数据前使用门槛，门出光散射和/或荧光信号是由电子背景噪音或细胞样品碎片造成的。
8. 选择一个新的数据单元，创建具有FSC-H和SSC-H参数对数标度的密度的情节，然后点击运行。
9. 如果样品密度导致了过度的事件发生率，可以采取稀释步骤来增加准确度和精度。
10. 在密度图应用软件门从以前的直方图排除低电平散射信号，通过背景噪声或碎屑（FSC <320000）生产的。反之门更高的相对荧光从细胞中藻蓝蛋白的信号，只包括这些事件（FL4，56000 - 1,950,000）。
11. 使用记录在门控区的细胞的数量和通过样品的总体积是通过将FCM已通过将其划分，制定出每毫升多少细胞。
    注 :这里使用的FCM模式有一个微处理器控制的蠕动泵系统，允许被确定样本量。其他FCM设备可能需要校准珠暂停或计算的_H 2 O的重量/体积的不同来验证总样本量。
12. 细胞的需要的体积添加到新鲜制备的介质，以便开始微囊藻的一个批次生长周期（250,000细胞/ ml）。
    注 :种将不同生长率取决于它们的原位环境参数和养分有效性，所以一个批量周期应预先记录，以确定生命周期阶段。

3.的Optim的分子探针细胞摄取化

1. 在微囊藻培养收获一半的指数相准备在步骤2中作为一个"活"的控制使用。
   注 :样品由高密度培养稀释直奔指数期可以通过死细胞的营业额影响优化的结果，相比于文化从最初的滞后/诱导阶段接种的。
2. 制备的另一半通过使用方法如70％的乙醇，加热的样品^在 60℃1小时，多聚甲醛或4％甲醛30分钟^6,11,22一个"死"的控制。检查中的变化样品微环境（如，pH值）。
   注 :正，热灭活，'死'在微囊藻的控制是通过其在藻蓝蛋白的信号下降一"活"样本区分。通过其它方法诱导的死亡率可能不会导致相同的输出和将VARŸ物种。
3. 设置为使用不同比例的混合样品"活"和"死"的样本（例如，0％，25％，50％，100％）。
4. 分列集落形成涡旋或超声检查pH值。
5. 选择488nm的激光沿着探测器可从绿色记录荧光（FL1，530±15纳米），橙色（FL2，585±20毫微米）的核酸探针和640纳米的激光通过其相应的检测器来记录藻蓝蛋白的信号。
   注意:当与DNA结合，绿色核酸探针具有504 nm，发射523纳米的最大值近似的荧光激发波长，而橙色核酸探针具有547 nm和排放为570nm极大值的激发波长。甲的488nm氩离子的固态激光器可被用于激发两个分子探针，然而，一个绿色激光（高达547纳米）将产生一个较高的橙色荧光。
6. 作为一个起点，介绍分子探针与厂家推荐使用浓度为50％的"活"，50％"死"的文化和孵化在黑暗中。
7. 选择一个新的数据单元，将与阈值和触发器，这将降低背景噪音（FSC-H 80000）的SIP下的样本。
8. 创建具有FSC-H和SSC-H的参数和三个直方图密度的情节。一个直方图使用各自的分子探针光检测通道（FL1或2），一个用于检测排放藻蓝蛋白（FL4-H）和其它的FSC-H，所有对数尺度。
9. 孵育微囊藻与在黑暗的核酸探针的样品达60分钟，记录在单独的数据单元，在多个时间点（1，5，10，15，30和60分钟）。
   注 :当调整参数，如pH检查与生产的某些化学品的潜在反应（用于测试核酸探针的缓冲不能含有磷酸盐或高单价或女主角的价阳离子，作为与DNA结合将减少）。
10. 应用软件门仅包括FSC-H直方图（320,000 - 1500000）为靶标生物细胞的大小，进入各自的荧光探针通道直方图。
    注意:在这个协议中所用的浓度分别为0.05，0.1，0.5，1，5，10，50和100微米，这可以通过增加或减少微囊藻样品或核酸探针的初始储备液的体积可以改变。
11. 在荧光探针信道时，使用另一包容软件门到直方图中的最高峰（​​绿色FL1-H，240000 - 1650000，橙FL2-H，30000 - 165000），并随后栅极阳性探针荧光入密度图。
12. 运行步骤3.1 - 3.11 100％"活"，100％"死"和所有的混合培养样品，调整分子探针浓度（例如:X为0.1〜×10）和/或温度和pH水平如果必要的。
<利>比较的阳性分子探针的荧光信号的数量为"死"细胞的原始细胞密度（从半总FSC-H或100％的"死"培养采取）找到细胞染色核酸的总百分比探头。
13. 每个浓度范围内做到这一点的每个时间段找到细胞核酸探针的吸收比例最高的最优协议不产生非特异性染色（使用方法在单因素方差分析和方差的秩和检验单因素分析，如果数据是非参数）。

4.分子探针荧光歧视

1. 对于荧光干扰/重叠从固有的或不特定的细胞染色测试选择50％"现场"和50％的"死"混合培养数据和起飞所有闸门。
2. 应用软件门仅包括FSC-H直方图（320,000 - 1500000）为靶标生物细胞的大小，成藻蓝蛋白通道直方图。
3. 门最高的藻蓝蛋白峰和标签为"现场"，增加标记为'死'的最低峰。
4. 使用一次，在'活'，然后'死'藻蓝蛋白（FL4）信号，记录两者的平均波长执行另外的门一步进入各自的分子探针荧光直方图通道。
   注 :该模式用于在这个实验中引起的死亡率是通过热处理，此协议下，显然降低了藻蓝蛋白信号完成。 '死'细胞产生群体的其它方法可能会产生不同的输出中获得的运行。
5. 比正分子探针荧光（"死"）和本征/非特异性信号（"现场"）的平均波长，以确定协议灵敏度。
   注 :为提高"活"与"死"波波尔荧光歧视ations，增加碳源以活性防污摄取营养物耗尽的电池或乙二胺四乙酸（EDTA），以提高细胞壁的渗透性和产生的荧光信号^6。在一些FCM模型光谱重叠有限的补偿可通过用户操纵成对校正期间样品采集（PMT电压的变化）或从分析后专门的软件来执行。
6. 选择优化的协议，其中已被染色的最高量的"死"细胞不发生非特异性染色。如果一个数测试的有类似的结果接受协议与最低浓度和温育时间，以及良好的荧光信号鉴别。按照制造商的流式细胞仪关机程序的指令。

结果

正向光散射（FSC）和侧向光散射（SSC）的输出从指数生长期的微囊藻分批培养提供了分别对细胞尺寸（直径）和内部粒度信息（图1A）。 FSC可以区分细胞太大和/或小到可以微囊藻 。这个判别或选通可以由FSC输出（图1C）的某些点之间精制数据来完成。藻蓝蛋白， 微囊藻光合装置的主要结构产生强信号时由红色光源询问（例如:640; EM:675±12.5纳米），其可以被用来进一步栅极种群，类似于在FSC做选通但与荧光（图1D）。从FSC和荧光信号，数据可以从原始输出 （图1A），以特定的数据被选通上微囊藻对于fINAL细胞计数（ 图1B）。

在蓝藻种群每个细胞的自体荧光的不同生理状态的功能...

讨论

使用分子探针的出版物的数目增加表明可靠和信息数据可以得到^{5,6,8 - 15,19,22,23。}作为然而没有完美的染色细胞存活，可以是有效的在所有物种具有相同的浓度和温育时间^6,10。即使是同一类型的探针具有改变的荧光发射的表示需要建立正确的浓度和温育时间（ 表1和3）。如使用此协议时看到的那样，最佳浓度和温育时间为橙色核酸探针是在1μM的10分钟，而绿色核酸探针将只需要一半的浓度，但不对三倍长（ 图5和6）。这两种细胞非透性花青单体与浓度大于1.0微米的开始，以产生在排放光谱与非膜损伤的细胞的重叠。 SI的这种重叠gnals提供的证据表明非特异性染色时，其中"活"细胞被占用的分子探针。在从非特异性染色所得超过荧光产生误报，强调必须仔细针对每个分子探针与靶生物确定，必须对协议的发展。在优化的分子探针的最重要的步骤是:1）如何理解分子探针进行交互与FCM仪器; 2）采用合适的活的和死的控制; 3）从发展FCM输出的门控参数的知识和4）通过现场环境的理解修改的协议。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝藻培养基	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 淡水浓缩液（x50 稀释）
去污液	BD Biosciences 653155		当输出超过每秒 12 个事件或流速为 66 µ 时运行 2 分钟;升/分钟。然后是 2 分钟的护套 H2O。
流式细胞仪	BD Biosciences	根据要求	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	核酸染色剂 – 5 mM DMSO 溶液
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	核酸染色剂 – 5 mM DMSO 溶液