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方法文章

混合导电聚合物/富勒烯纳米颗粒光敏剂的光动力治疗

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DOI：

10.3791/53038

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2015年10月28日

 , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida, 2Department of Chemistry, University of Central Florida, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Central Florida, 4CREOL, The College of Optics and Photonics, University of Central Florida

本文内容

摘要

本方案描述了一种制备与富勒烯共混的导电聚合物纳米颗粒的方法。这些纳米颗粒被研究用于作为下一代光动力疗法（PDT）光敏剂的潜在用途。

摘要

本文介绍了一种用于制备和可重复 体外 报道了将导电聚合物纳米颗粒与富勒烯混合用作下一代光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）光敏剂的评估。这些纳米颗粒通过半导体聚合物 MEH-PPV（poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]）与富勒烯 PCBM（phenyl-C61在非相容性溶剂存在下，生成丁酸甲酯。MEH-PPV具有高消光系数，可导致三重态形成速率较高，并能高效地向富勒烯PCBM进行电荷和能量转移。后一过程通过富勒烯介导的三重态和自由基形成，以及MEH-PPV激发态的超快去活化，增强了光动力治疗（PDT）系统的效率。本文报道的结果表明，该纳米颗粒光动力治疗增敏系统具有高效性，并对癌细胞系表现出意外的特异性。

引言

在光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）中，光敏剂被施用于靶组织，当暴露于光照时，光敏剂会产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。诸如单线态氧和超氧阴离子等活性氧物种可诱导细胞和组织的氧化应激，并导致其结构损伤1-4。由于该方法操作简便，已受到广泛研究，并已开展多项临床试验5,6。然而，仍存在若干重要问题，例如光敏剂的暗毒性、患者对光的敏感性（源于光敏剂的非特异性分布）以及光敏剂的疏水性（这会导致生物利用度降低和潜在的急性毒性）。

在此，我们报告一种用于制备和 体外 评估将导电聚合物纳米颗粒与富勒烯混合用作下一代光动力治疗光敏剂。这些纳米颗粒由半导体聚合物 MEH-PPV（聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]）与富勒烯 PCBM（苯基-C61-丁酸甲酯）当这些材料溶解于相容性溶剂中并迅速注入非相容性溶剂时图1A）。选择MEH-PPV作为主体聚合物，是因其具有高消光系数，可导致高比例的三重态形成，同时能够实现向富勒烯PCBM高效且超快的电荷和能量转移7这些特性非常适合于光动力疗法中单线态氧和超氧阴离子的生成。

富勒烯实际上已以分子形式和纳米颗粒形式应用于光动力疗法（PDT）中8-13。然而，其严重的细胞毒性阻碍了进一步的发展12。本文表明，将富勒烯包埋于MEH-PPV宿主基质中，形成复合型MEH-PPV/PCBM纳米颗粒，可获得一种非固有细胞毒性的PDT增敏材料；该材料因纳米颗粒的尺寸和表面电荷而对癌细胞具有特异性，并且由于前述的光物理特性，可在低光照剂量下实现高效的PDT治疗。

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方案

1. 细胞系培养

  1. 将TE 71（小鼠胸腺上皮细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、A549（人肺癌细胞）和OVCAR3（人卵巢肿瘤细胞）的冻存管置于温水中解冻，时间不超过2分钟。每种细胞系加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，于106 × g条件下离心6分钟。
  2. 吸除上清液，向细胞沉淀中加入3 ml培养基，通过反复吹打充分混匀细胞。将该细胞悬液加入已预热的、含7 ml补充10% FBS的DMEM培养基的T75培养瓶中，置于37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中培养。将此培养瓶标记为第0代（Passage 0）。
  3. 当细胞融合度达到80%时，用0.05%胰蛋白酶孵育10分钟以收获细胞。加入等体积的培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液于106 × g离心6分钟。弃去上清液，向沉淀中加入3 ml新鲜培养基，充分混匀后取少量（100 µl）转移至含有7 ml培养基的培养瓶中。将培养瓶放入培养箱中孵育，并标记为第1代（Passage 1）。
  4. 持续培养各细胞系至第11或第12代。

2. 纳米颗粒的制备

  1. 制备约 10-6 M（调整后）未稀释的 MEH-PPV 储备液
    1. 在样品瓶中加入 1 mg 聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]（MEH-PPV），其分子量（平均 Mn）为 150,000–250,000 g/mol，再加入 3 ml 四氢呋喃（THF）。将混合物在加热板上于 80 °C 加热并搅拌 2 小时。
    2. 使用 0.2 µm 注射器滤膜将上述溶液过滤至新的样品瓶中。将此溶液标记为“未稀释 MEH-PPV 储备液”。该溶液将在后续步骤 2.1.3 和 2.1.4 所述的浓度精细调节后用于纳米颗粒的制备。
    3. 取 50 µl 未稀释 MEH-PPV 储备液加入 3 ml THF 中。将此溶液标记为“稀释 MEH-PPV 储备液”。转移至 1 cm 石英比色皿中，通过紫外-可见光谱法测定其在 495 nm 处的吸光度。
    4. 若稀释 MEH-PPV 储备液的吸光度高于 0.17，则通过每次加入 1 ml THF 对未稀释 MEH-PPV 储备液进行进一步稀释，并重复步骤 2.1.3，直至在 495 nm 处测得的吸光度处于 0.13–0.17 范围内。
    5. 利用朗伯-比尔定律计算稀释 MEH-PPV 储备液的摩尔浓度，如下所示。此处以 0.15 的吸光度为例用于后续实验方案（i.e.，根据实际测得的吸光度调整所有后续计算），所用 MEH-PPV 的消光系数为 107 M-1 cm-1，光程为 1 cm。
      A = ε × b × c （公式 1）
      （ε — 摩尔消光系数，A — 吸光度，b — 光程，c — 溶液浓度）
      0.15 = 107 M-1 cm-1 × 1 cm × c （公式 2）
      c = 1.5 × 10-8 M （公式 3）
      利用该浓度按如下方式计算未稀释 MEH-PPV 储备液的浓度：
      M1V1 = M2V2 （公式 4）
      0.15 × 10-7 M × 3050 µl = M2 × 50 µl （公式 5）
      M2 = 9.15 × 10-7 M （公式 6）
      此即“调整后未稀释 MEH-PPV 储备液”的浓度。
  2. 计算调整后未稀释 MEH-PPV 储备液中 MEH-PPV 的质量
    1. 利用步骤 2.1.4 中获得的摩尔浓度及 MEH-PPV 的分子量（Mw）106 g/mol，计算 1 ml 调整后未稀释储备液中 MEH-PPV 的质量，如下所示：
      M = n/V （n — 摩尔数，V — 体积，单位为 L）（公式 7）
      因此，1 ml 调整后未稀释储备液中 MEH-PPV 的质量为 9.15 × 10-4 g。
  3. 在 MEH-PPV 中掺杂 PCBM
    1. 计算需加入储备 MEH-PPV 溶液中的[6,6]-苯基-C61-丁酸甲酯（PCBM）的质量，以制备含 50 wt% PCBM 的 MEH-PPV 掺杂溶液，其中 50 wt% PCBM 是相对于 MEH-PPV 的质量而言（i.e.，为 MEH-PPV 质量的一半）。使用步骤 2.2 中获得的 MEH-PPV 质量进行计算：
      PCBM 质量 / 9.15 × 10-4 g MEH-PPV × 100% = 50 wt% PCBM （公式 8）
      PCBM 质量 = 4.57 × 10-4 g （公式 9）
    2. 称取 1 mg PCBM 置于样品瓶中，加入 500 µl THF。利用 PCBM 的分子量 910.88 g/mol 计算该溶液中 PCBM 的浓度：
      PCBM 溶液摩尔浓度 = 0.001 g / (910.88 g/mol × 500 µl) （公式 10）
      PCBM 溶液摩尔浓度 = 2.19 × 10-9 mol/µl （公式 11）
    3. 利用步骤 2.3.2 中计算的摩尔浓度，计算需加入调整后未稀释 MEH-PPV 储备液中的 PCBM 溶液体积，以在 THF 中获得含 50 wt% PCBM 的 MEH-PPV 掺杂溶液：
      4.57 × 10-4 g PCBM × 1 mol / 910.88 g × 1 µl / 2.19 × 10-9 mol = 229 µl （公式 12）
      将 229 µl PCBM 溶液加入 1 ml 调整后未稀释 MEH-PPV 储备液中，并充分混合。
  4. 通过再沉淀法制备纳米颗粒
    1. 将 1 ml 混合的 MEH-PPV/PCBM 溶液转移至带有针头的 1 ml 注射器中。
    2. 迅速将 1 ml 混合 MEH-PPV/PCBM 溶液注入正在以 1,200 rpm 搅拌的 4 ml 去离子水中。注射完成后立即停止搅拌。这些纳米颗粒无需进一步处理即可使用。

3. 用于成像的细胞系与纳米颗粒孵育

注意：所有成像实验均在 35 mm 培养皿中完成

  1. 细胞系对纳米颗粒的摄取
    1. 培养细胞系至第12代th 传代。在第12代th 将细胞传代培养于35 mm培养皿中。调整接种至35 mm培养皿中的细胞浓度，使细胞在24小时后达到40%汇合度。
    2. 在此阶段，从培养皿中移除添加了10% FBS的DMEM培养基，用1×DPBS洗涤细胞两次，然后将100 µl纳米颗粒悬液加入2 ml DMEM中，并加入培养皿。
    3. 24小时后，从培养皿中移除DMEM/纳米颗粒悬液，并用1×DPBS洗涤细胞3次。随后加入4%多聚甲醛孵育10分钟以固定细胞，再用DPBS洗涤两次。加入300 nM DAPI染色液，孵育2分钟对细胞进行染色，之后用DPBS洗涤两次。最后将细胞置于DPBS中保存，用于成像。
  2. 活性氧检测
    1. 在培养皿中培养 A549 和 OVCAR3 细胞系，每种细胞系各 6 个培养皿，具体方法如第 3.1.1 节所述。按照图示标记培养皿 表1.
    2. 向三个培养皿中的每一个加入100 µl纳米颗粒悬浮液至2 ml DMEM中，如图所示 表1 孵育24小时。对于将接受光照剂量的培养皿，在24小时后洗涤细胞，并将细胞重悬于无染料的HBSS（Hank’s平衡盐溶液）培养基中。
    3. 将太阳光模拟器的光源预热15分钟。在光源前放置紫外滤光片以滤除紫外光。使用参考太阳能电池校准光源，调节光源功率，使光强达到0.5个太阳（50 mW/cm²）。2培养皿表面的光照强度。在此特定实验装置中，通过向光源提供218 W的功率来实现该条件。
    4. 将培养皿置于灯下（打开皿盖）照射60分钟，光照剂量为180 J/cm2 如下列计算所示：
      50 mW/cm2 × 3,600 秒 / 1,000 = 180 J/cm2
    5. 移除 HBSS，无需洗涤，向培养皿中直接加入 2 ml 添加了 10% FBS 的 DMEM 培养基。将细胞继续孵育 2 小时。
    6. 作为阳性对照，将细胞与100 µM过氧化氢（H₂O₂）孵育2O230 分钟
    7. 在所有培养皿中加入活性氧检测试剂，使其终浓度为5 µM，将细胞与染料于37 °C孵育30分钟。
    8. 用4%多聚甲醛孵育细胞10分钟以固定细胞。用DPBS洗涤两次。加入300 nM DAPI染色液，孵育2分钟对细胞进行染色。用DPBS洗涤两次。随后将细胞置于DPBS中用于成像。
  3. PI 与 annexin V FITC 检测细胞凋亡与坏死
    1. 将每种细胞系分别培养于5个培养皿中。其中3个培养皿用于实验组，另外2个培养皿作为对照组样本。按照3.1.2节所述方法，将实验组的3个培养皿与纳米颗粒共同孵育。对照组样本不与纳米颗粒孵育。
    2. 孵育24小时后，执行步骤3.2.3。
    3. 将3个实验培养皿置于灯下（打开皿盖），分别在20分钟、40分钟和60分钟时取出一个。这样可获得三个接受光剂量分别为60、120和180 J/cm的样品。2，分别（计算方法见第3.2.4节）。随后，给予180 J/cm2 向其中一个对照培养皿施加光照剂量。此对照组为未添加纳米颗粒但施加光照剂量的样本。对剩余的对照样本不施加光照剂量（无纳米颗粒且无光照剂量施加）。
    4. 用添加了10% FBS的DMEM培养基替换HBSS，并将培养皿置于培养箱中孵育4小时。
    5. 将实验组和对照组培养皿中的细胞与20 µl Annexin V FITC共孵育15分钟进行染色。用DPBS洗涤两次。再将细胞与300 nM DAPI以及300 nM PI（碘化丙啶）共孵育2分钟进行染色。用DPBS洗涤两次。随后将细胞置于DPBS中用于成像。

4. 纳米颗粒的内在细胞毒性

  1. 细胞计数及在96孔板中培养
    1. 通过移除培养基并用DPBS洗涤细胞两次，从培养瓶中收获细胞，随后加入0.05%胰蛋白酶孵育10分钟。向所得细胞悬液中加入2 ml含10% FBS的DMEM培养基。充分混匀溶液，使细胞团块分散为单细胞。
    2. 取100 µl细胞悬液加入900 µl含10% FBS的DMEM培养基中，充分混匀。取10 µl该悬液置于血细胞计数板上，使用血细胞计数板计数细胞，并将4.1.1步骤中细胞悬液的浓度调整为5 × 104 个细胞/ml。
    3. 取5块96孔板，分别标记为0小时、24小时、48小时、72小时和96小时。按照表2所示，将浓度为5 × 104 个细胞/ml的细胞悬液（TE 71和A549）各50 µl加入孔中，使每孔接种2,500个细胞。对OVCAR3和MDA-MB-231细胞系进行相同操作。
    4. 24小时后，用1× DPBS洗涤各孔，并按照表2所示向各孔中加入50 µl不同浓度的纳米颗粒。通过将2.4.2步骤中制备的纳米颗粒悬液分别取20 µl、100 µl和180 µl加入DMEM培养基中，定容至2 ml，得到终浓度分别为0.4 × 10-4 mg/ml、2.0 × 10-4 mg/ml和3.6 × 10-4 mg/ml的纳米颗粒溶液。每种细胞系在每种纳米颗粒浓度下均设三个复孔。
  2. 在避光条件下测定细胞活力
    1. 在向0小时板加入纳米颗粒后立即加入10 µl MTT溶液。孵育4小时以形成甲臜晶体。向各孔中加入50 µl溶解液，继续孵育6小时以充分溶解甲臜晶体。
    2. 使用酶标仪在570 nm波长下测定0小时板的吸光度，以评估细胞活力。
    3. 对于24小时板，在与纳米颗粒共孵育24小时后，用1× DPBS洗涤细胞，每孔加入50 µl培养基。随后按照4.2.1和4.2.2步骤加入MTT并读取吸光度。
    4. 对于48小时、72小时和96小时板，在与纳米颗粒共孵育24小时后，用1× DPBS洗涤细胞，并向各孔中加入50 µl培养基，继续孵育至相应时间点。
    5. 按照4.2.1和4.2.2步骤所述，在特定时间点测定细胞活力。
    6. 重复整个实验三次（n = 3）。

5. 光动力疗法后细胞活力的测定

  1. 细胞计数及在96孔板中培养。
    1. 按照 表3 所示，标记一组96孔板，包括TE 71 + A549孔板和OVCAR3 + MDA-MB-231孔板。孔板的布局应与4.1.3中所示相同。
    2. 按照4.1节所述方法接种96孔板，其布局与4.1.2节中表2所示相同。
    3. 24小时后，按照4.1.4节所述向孔板中加入纳米颗粒。
    4. 加入纳米颗粒24小时后，用1×DPBS洗涤细胞，并向每孔加入50 µl HBSS。
    5. 按照3.2.3节所述，用相应的光照剂量照射孔板。
    6. PDT处理后，将HBSS替换为50 µl添加了10% FBS的DMEM培养基，并将孔板在相应时间点继续孵育。
    7. 在每个时间点后，按照4.2.1和4.2.2节所述测定细胞活力。

6. 荧光显微镜

  1. 纳米颗粒的摄取
    1. 成像前30分钟打开显微镜光源和激光器。将含有固定细胞的培养皿（如第3.1节所述）放置在显微镜载物台上。
    2. 使用如表4所示的滤光片收集纳米颗粒和DAPI的荧光信号。在ImageJ软件中叠加相衬图像、纳米颗粒图像和DAPI图像。
  2. 活性氧（ROS）的检测
    1. 成像前30分钟打开显微镜光源。将含有细胞的培养皿（如第3.2节所述）放置在显微镜载物台上。
    2. 使用如表4所示的滤光片收集纳米颗粒、DAPI以及ROS检测试剂的荧光信号。在ImageJ软件中叠加相衬图像、纳米颗粒图像、DAPI图像和ROS检测试剂图像。
  3. 通过PI和Annexin V FITC检测细胞凋亡与坏死
    1. 成像前30分钟打开显微镜光源。将含有细胞的培养皿（如第3.3节所述）放置在显微镜载物台上。
    2. 使用如表4所示的滤光片收集纳米颗粒、DAPI、PI以及Annexin V FITC的荧光信号。在ImageJ软件中叠加相衬图像、纳米颗粒图像、DAPI图像、PI图像和Annexin V FITC图像。

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结果

纳米颗粒的摄取及其内在细胞毒性

将50 wt%混合的MEH-PPV/PCBM纳米颗粒与TE 71、MDA-MB-231、A549和OVCAR3细胞系共同孵育。选择50 wt%的PCBM掺杂比例，因其已被证明可在共轭聚合物与富勒烯之间提供理想的电荷和能量转移特性14。纳米颗粒摄取的荧光图像如图1B所示。细胞与纳米颗粒共孵育24小时，以确保充分摄取。随后用4%多聚甲醛固定细胞，并用DAPI染色以识别细胞及细胞核位置。为获得足够分离的单个细胞图像，细胞汇合度维持在40%。荧光图像及其对应的相差图像显示，A549和OVCAR3癌细胞系对纳米颗粒具有优先摄取能力。在TE 71对照细胞系和MDA-MB-231癌细胞系中未观察到可检测的荧光信号，表明其摄取有限。而A549和OVCAR3癌细胞系则表现出显著的纳米颗粒摄取。通过将50 wt%混合的MEH-PPV/PCBM纳米颗粒与TE 71、MDA-MB-231、A549和OVCAR3细胞系共孵育，并采用MTT法测定细胞活力，评估其固有细胞毒性（暗毒性）。图1C

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讨论

为实现纳米颗粒的摄取，在制备纳米颗粒时必须维持若干关键参数。10-6 将MEH-PPV溶液（与50 wt% PCBM共混）溶于THF中，用于注入去离子水中。由于该溶液的浓度对所形成纳米颗粒的尺寸具有重要影响，因此需通过紫外-可见光谱法检测其浓度。请注意，在方案步骤2.1.3中，必须先将初始配制的MEH-PPV溶液（未稀释的MEH-PPV储备液）进行稀释，再进行紫外-可见光谱测定，因为该溶液的吸光度远大于1。注射速度在决定纳米颗粒尺寸方面也起着关键作用，应在剧烈搅拌去离子水的同时尽可能快速地完成注射；缓慢注射会导致形成较大的纳米颗粒。注射完成后应立即停止搅拌，以避免进一步聚集。在将溶液注入水中时，需将针头插入液面以下，并保持靠近小瓶内壁，以避免产生气泡，否则会影响纳米颗粒的尺寸。在本实验中，通过动态光散射（DLS）测得的纳米颗粒尺寸为61.5 ± 23.3 nm。选择DLS而非透射电子显微镜（TEM），是因为DLS方法快速、成本低、对本尺寸范围可靠且易于获取。这些纳米颗粒的zeta电位为-9.66 ± 8.12 mV。 即， 轻微负电至中性表面电荷

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢美国国家科学基金会（NSF）通过CAREER奖（CBET-0746210）以及奖助项目CBET-1159500为本研究提供的经费支持。我们感谢夏威夷大学癌症研究中心的Turkson博士和中佛罗里达大学医学院的Altomare博士在细胞培养方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基乙烯]（MEH-PPV）Sigma Aidrich536512-1G平均 Mn 150,000–250,000
[6,6]-苯基-C61 丁酸甲酯（PCBM）Sigma Aidrich684449-500MG>99.5%
四氢呋喃（THF）EMDTX0284-6Drisolv
1 ml 注射器National Scientific Company37510-1用于过滤 MEH-PPV 溶液
注射器滤器VWR28145-49525 mm，0.2 µm，PTFE
1 ml 注射器Hamilton Company81320用于将 MEH-PPV 溶液注入水中制备纳米颗粒
DMEM/F12 培养基（50/50 混合液），杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Corning (VWR)45000-350
不含酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS）Quality Biological (VWR)10128-740
不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（1× DPBS）Corning (VWR)45000-436
胎牛血清，常规型（热灭活）（FBS）Corning (VWR)45000-736
胰蛋白酶 EDTA 1× 0.25%Corning (VWR)45000-664不含碳酸氢钠、钙和镁的 HBSS 中的胰蛋白酶/2.21 mM EDTA，经猪细小病毒检测
16% 戊二醛Electron Microscopy Sciences 15710通过加入 PBS 将 16% 戊二醛稀释至 4%
DAPI Biotium VWR89139-054细胞核染色剂
5 ml 移液管VWR82050-478
75 cm2 培养瓶VWR82050-856用于细胞培养
96 孔板VWR82050-771用于 MTT 检测
带通气孔的组织培养皿Greiner Bio-One (VWR)82050-538
碘化丙啶Molecular probesP3566
Annexin V FITCInvitrogenA13199凋亡染色剂
Celltiter 96 非放射性细胞活力检测试剂盒（1000 次检测）Promega (VWR)PAG4000MTT
CellROX Green 试剂，用于氧化应激检测InvitrogenC10444用于活性氧（ROS）检测
紫外-可见分光光度计Agilent 8453
荧光分光光度计NanoLog HoribaJobin Yvon
动态光散射仪PD2000DLS，Precision detector
培养箱NuAir DH Autoflow
共聚焦显微镜Zeiss Axioskop263X 油浸物镜
落射荧光显微镜Olympus IX7160X 水浸物镜，Andor Zyla sCMOS 相机
太阳光模拟器Newport 67005 Oriel Instruments
参考太阳能电池Oriel VLSI Standards Incorporated
酶标仪BioTek Ex808
血细胞计数板Hausser Scientific Partnership3200用于细胞计数

参考文献

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