通过抗体干扰和三维重建研究蛋白质功能及异常蛋白质表达的作用

摘要

调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，而且也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。本文介绍的方案展示了抗体干扰技术在哺乳动物细胞（包括原代海马神经元）中的应用，并演示了如何利用三维重建技术研究蛋白质功能。

摘要

严格调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。因此，近年来的研究开发了多种工具，用于靶向哺乳动物细胞系甚至动物模型中的蛋白质表达，包括RNA干扰和抗体干扰技术。尽管过去二十年中，前一种策略受到了广泛关注，但介导抗体货物穿过细胞膜进入细胞的肽段 却受到较少关注。在本论文中，我们提供了一种详细的实验方案，介绍如何在人胚胎肾细胞以及原代海马神经元中利用一种名为Chariot的肽载体进行抗体干扰实验，并进一步展示了三维重建技术在分析蛋白质功能中的应用。我们的研究结果表明，Chariot可能因其含有核定位信号，特别适用于靶向定位于胞体和细胞核内的蛋白质。值得注意的是，在应用于原代海马神经元培养时，该试剂被分离的神经元出乎意料地良好耐受。

引言

对蛋白质表达的严格调控对于每个生物体控制自身发育以及响应环境信号至关重要。因此，在进化过程中产生了多种机制，以精确调控真核细胞在其生命过程中任意时刻所含约20,000个基因编码的每种蛋白质的表达水平。这些调控机制发生在蛋白质合成的不同阶段，范围从染色质结构、转录和RNA加工的调控，到翻译后蛋白质修饰、转运和降解的调控。

因此，基础分子机制的功能障碍以及蛋白质表达水平的改变与多种疾病（如癌症或智力障碍）相关，这并不令人意外。事实上，考虑到神经元发育和哺乳动物大脑功能所具有的显著复杂性，这些精密系统对蛋白质表达变化的敏感性在多种已知的智力缺陷疾病中得以体现，包括阿尔茨海默病和帕金森病（AD 和 PD），以及自闭症谱系障碍（ASD），例如脆性 X 染色体综合征（FXS）。后者疾病的特征是多种蛋白质的广泛异常表达，其原因是丢失了一种单一的翻译调控蛋白——FMRP（脆性 X 智力低下蛋白）^1-4。此外，最近研究发现，影响 Variable charge x linked protein A（VCXA）的染色体重排与智力障碍相关；VCXA 是一种通过修饰 mRNA 加帽来调控 mRNA 稳定性和翻译的蛋白质⁵，而截至目前，在认知障碍患者中尚未发现点突变^6,7，这表明所观察到的精神功能损害源于 VCXA 表达水平的改变及其靶蛋白表达的失调。与这些发现一致，一项研究探讨了基因的de novo拷贝数变异是否与 ASD 相关，结果证实新发的基因重复和缺失是 ASD 的重要风险因素⁸，从而支持了蛋白质表达水平升高或降低可能导致智力障碍的观点。

值得注意的是，最近的研究进一步提供了证据，表明特定蛋白质的表达水平被精确调控，以防止因蛋白质含量过高而导致其发生聚集，且几乎没有安全余量⁹。因此有研究提出，即使蛋白质表达量轻微增加，也足以诱发阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等疾病⁹。尽管参与蛋白质表达调控的分子机制多种多样，提示在这些发现背景下可能存在复杂的调控机制，但一项针对超过5,000个哺乳动物基因表达水平的研究¹⁰表明，自然界更倾向于一种更为简约的调控策略：细胞中蛋白质的丰度主要在翻译水平上进行调控¹⁰，这说明RNA可用性的调控主要作用在于对蛋白质表达进行精细调节。

因此，研究目的蛋白（POIs）的剂量不仅对于理解蛋白的内源性功能至关重要，而且对于多种疾病的研究以及治疗策略的开发也具有重要意义。为此，过去几十年已发展出多种利用RNA干扰来调控POI剂量的策略。尽管RNA干扰被广泛用于研究蛋白功能，并且已应用于癌症、眼部疾病以及抗病毒治疗的临床试验中^11-13，但该策略在实施过程中可能遇到一些困难，甚至导致其无法实现。例如，介导基因沉默的“种子序列”因依赖同源性而相对较短，容易引发脱靶效应。由于高效序列较为稀少，且需从成千上万种候选序列中筛选（综述见¹⁴），寻找合适序列的过程可能耗时且昂贵，但结果仍可能不尽如人意。

另一种策略是利用抗体直接靶向目标蛋白（POI）。在此，我们展示了使用蛋白载体Chariot （由Active Motif公司生产）以降低细胞内蛋白的可用性，并结合三维重建技术研究蛋白在敲低后的功能。

Chariot 的活性基序本身是一种 2.8 kDa 的多肽，可用于将多肽、蛋白质和抗体穿过哺乳动物细胞的膜进行转运¹⁵。该多肽通过疏水相互作用与目的蛋白（POIs）形成非共价结合的大分子复合物，随后 Chariot-POI 复合物以非依赖内体的方式被细胞内化。重要的是，研究表明 Chariot 既不会影响被转运蛋白在细胞内的定位，也不会产生细胞毒性作用或影响其运载物的生物学活性¹⁵。

方案

1. 储备溶液

1. 将冻干的活性基序粉末重悬于无菌 H₂O至终浓度为2 µg/µl。轻轻振荡混匀。
2. 制备小份 aliquot（例如， 每份12 µl，每个反应需要2 µl，于-20 °C保存。

2. 细胞的制备

1. 在24孔板中接种哺乳动物细胞（如HEK293细胞或原代神经元），每孔加入500 µl含抗生素的生长培养基。
   注意：使用神经元时，应以低密度接种细胞，并仅使用24孔板中的中间两行。每个孔均需保留一个对应的空孔，用于孵育期间盛放培养基（步骤4.2）。操作神经元时，务必确保细胞在体外环境（非培养箱内）停留时间不超过几分钟。
2. 在适当条件下培养细胞（湿润环境，5% CO₂）₂ 并在 37 °C 条件下培养至细胞汇合度约为 50%。
   注意：使用神经元时， 将细胞培养至所需发育阶段，每周两次更换约25–50%的培养基。培养基：Neurobasal培养基（含1× B27、5 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素；参见参考文献16）。

3. Chariot 复合物的形成

1. 每个反应中，将0.1–2 µg的目的蛋白（POI）或相应抗体，以及对照蛋白或对照抗体，分别用50 µl PBS稀释。
   注意：该技术也可用于由预先结合的一抗和二抗组成的复合物（参见“代表性结果”部分的图1）。混匀后离心。
2. 每个样品中，用单独的离心管将2 µl Chariot储存液加入50 µl PBS中稀释，以避免Chariot发生自聚集。混匀后离心。
3. 通过移液将稀释后的目的蛋白或抗体（步骤3.1）转移至Chariot稀释液中。混匀后离心。
4. 室温孵育30分钟（形成Chariot-POI复合物）。

4. 细胞转染

1. 稀释 将Chariot复合物（步骤3.4）加入100 µl预热的生长培养基（37 °C，无添加物）中。移除培养基，用预热的1×PBS洗涤细胞一次。
   注意：使用神经元时，不要丢弃培养基，需重复利用。将培养基置于37 °C保存。洗涤时使用含有0.5 mM MgCl₂的PBS₂ 和 CaCl₂.
   建议：在孵育培养板时（步骤 4.5），在空孔中保留培养基。
2. 将Chariot复合物溶液（步骤4.1）加入细胞中，轻轻摇动细胞以确保溶液均匀分布。在标准条件下（步骤2.2）培养细胞1小时。加入血清至终浓度为10%。当使用神经元时， 加入步骤4.1的培养基，继续培养细胞1至2小时。
   注意：最佳孵育时间取决于货物分子的大小和特性，可能需要根据经验进行调整。以下建议可作为参考指南：对于肽类，通常1小时已足够；对于蛋白质，建议1-2小时；对于抗体，建议2小时；而对于神经元的抗体转染，则建议4小时。
3. 按常规方法处理细胞以进行分析。请注意：该技术适用于采用固定化处理方案的实验，也适用于活细胞成像实验。

5. 成像

1. 使用激光扫描显微镜，以大约 0.25–0.5 µm 的间距对目标细胞和/或细胞区室进行 z 轴层扫成像。具体的层间距离取决于待重建结构的大小，需根据实际情况单独确定。

6. 重建

1. 在以下步骤中，使用 Esc 键在“选择”和“导航”模式之间切换，按住 Cntr 键并单击以选择多个对象，按住 shift 键以剪切对象（参见步骤 6.10）。
2. 在 Imaris 中打开 lsm 文件。
3. 对每个通道使用“显示调整”功能，调整图像对比度，直至最亮的结构达到饱和。请注意，此调整不会影响表面重建，仅用于辅助实验人员进行图像阈值设定。
4. 点击“添加新表面”图标，将弹出一个向导窗口。
5. 选择：仅分割感兴趣区域。然后进入下一步。
6. 调整选框的边界以匹配您感兴趣的对象。请注意，图像具有三维结构，因此还需在 z 轴平面上进行调整。如果选框的矩形形状未能准确贴合目标对象，可旋转对象和/或扩大选框，确保所有需要的结构均被包含在内。不需要的对象可在后续步骤中移除（参见步骤 6.10）。完成后继续。
7. 选择合适的通道。表面区域细节级别或球体直径应根据待重建结构的大小进行设置。  根据信号特征，可选择“绝对强度”或“局部对比度”方法。  通常情况下，对于弥散性信号，“局部对比度”效果更佳。无论采用何种方法，均需针对每种信号或感兴趣结构分别调整参数。
8. 使用“阈值设定”工具重建感兴趣结构。
9. 点击绿色箭头按钮完成重建。
10. 使用铅笔工具进一步调整对象，按需剪切并删除表面。剪切操作仅能在南北方向进行，因此需倾斜图像以实现对目标对象的准确剪切。
11. 通过选择“统计”、“详细统计”和“平均值”，获取每个表面的体积、面积和强度测量数据。
12. （可选步骤）如需观察颜色编码的统计结果（参见图 2E 和F），请选择相应表面的颜色选项卡，并将显示模式由“基础”更改为“统计编码”，系统将显示多个可选参数。

结果

以下段落展示了使用Chariot转染试剂和抗体干扰技术对目的蛋白（POI，即Simiate；更多细节请参见^16,17）实现功能性敲低的典型实验结果。研究结果表明，Simiate表达水平降低会损害转录活性，并以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡；当使用较高剂量的抗体（> 1 µg 抗体）时，最终导致超过99%的细胞死亡率（该发现此前已发表于文献¹⁶中）。本文中，我们将详细展示所采用的技术与实验方案，并进一步说明如何利用Chariot试剂对原代培养的离体海马神经元进行转染。

为了研究Chariot肽是否能够有效介导抗体的转运，特别是这些抗体在操作过程中是否仍保持功能活性，我们在HEK293细胞中表达FLAG-Simiate 24小时，随后利用与Chariot偶联的rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子转染细胞（图1）。HEK293细胞对FLAG-Simiate表达良好，该蛋白定位于细胞胞体及细胞核内（图1A）。在此，F...

讨论

本文介绍了一种研究蛋白质表达水平在剂量依赖性方式下调控细胞功能重要性的实验方案。该方案可在多种哺乳动物细胞类型（包括海马神经元）中实现对蛋白质表达的精细调控，从而促进在细胞水平上对蛋白质功能进行深入研究。

尽管RNA干扰是一种众所周知的下调目的基因（POIs）的策略，但它也存在一些缺点（参见¹⁴）。不仅高效且高特异性序列的筛选可能耗时且成本高昂，而且细胞内转录本的生成过程也可能导致不可预知的结果，因为有毒RNA构建物的积累、核输出机制的超负荷以及内源性RNA干扰加工系统的饱和，均可能引发脱靶效应或导致干扰效率低下。此外，大量外源性RNA干扰载体也可能诱发非特异性效应，并干扰细胞稳态。

另一方面，抗体一旦进入细胞，无需细胞内源性机制进一步加工，可立即发挥效应，因此不仅支持节省时间的实验设计，还可用于研究即时的细胞过程。尽管抗体也可能存在非特异性的脱靶效应，但随着越来越多经过充分表征且高度特异性的抗体问世，这一替代方案值得考虑。由于将大分子复合物递送入细胞仍是一个主要障碍，近年来已发展出多种转染技术，包括R8...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Chariot	Active Motif	30025	于 -20 °C 保存
Neurobasal 培养基	Life technologies	21103-049	使用前预热至 37 °C
1x B27	Life technologies	17504044	于 -20 °C 保存
L-谷氨酰胺	Life technologies	25030-149	于 -20 °C 保存
青霉素和链霉素	Life technologies	15140-122	于 -20 °C 保存
Imaris 软件	Bitplane	n.a.	价格昂贵，但无可匹敌
激光扫描显微镜	Zeiss	n.a.