传统的头部固定技术采用金属框架连接颅骨，作为头部固定装置的接口。本方案展示了一种无框架、基于丙烯酸树脂塑形的啮齿类动物行为学实验头部固定技术。
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摘要
摘要
头部固定是一种通过在颅骨上安装头柱以实现刚性夹持来固定动物头部的技术。传统的头部固定需要通过手术将金属框架固定在颅骨上，随后将这些框架夹持到静止平台上，从而实现头部的固定。然而，在一般实验室环境中，用于头部固定的金属框架在设计和实施上存在技术难度。在本研究中，我们提供了一种新型的头部固定方法。在植入手术过程中，使用定制的头部固定杆构建头部安装器。在使用丙烯酸树脂将电极、套管等植入物固定于颅骨后，进一步在上方添加树脂，构建出与固定杆接口相匹配的模具。该成型的头部安装器起到导轨的作用，研究人员可通过将头部安装器插入固定杆的接口中，便捷地完成动物头部的固定。该方法适用于需要使用牙科丙烯酸树脂进行植入手术的情况，对于无法轻易制造数控加工金属头柱的实验室可能尤为适用。
引言
头部固定或头部约束是一种通过在颅骨上安装框架或固定板以实现刚性夹持，从而固定动物头部的技术。该技术已被广泛应用于清醒动物的精确感觉刺激以及伴随或不伴随神经记录的行为感知研究。1-3 以及睡眠-觉醒周期中的邻近细胞标记4也用于 体内 脑成像5,6现在，头部固定技术是神经科学和行为学研究中常用的工具。
传统上，头部固定需要通过手术将金属头柱固定在颅骨顶部6-8。随后将这些固定装置夹紧在静止平台上，从而实现头部的固定。在清醒动物中进行的神经生理学研究，例如神经或光学记录、脑环路干预、脑成像等，通常伴随使用牙科丙烯酸树脂进行的植入手术。因此，当实验需要时，在这些实验室中实施头部固定似乎是一项简单的任务。这些固定装置应设计得足够轻便且体积足够小，以避免干扰动物在饲养笼内的自然行为。同时，在夹紧于静止平台时，装置还需具备足够的机械刚性。此外，根据实验目的的不同，装置还需具备一定的生物相容性。因此，在一般实验室条件下设计和制造此类头柱在技术上具有较大难度。
本研究介绍了一种新型的头部固定方法，通过便捷的夹持方式提供机械刚性，而无需使用金属头柱。采用该方法可在常规实验室条件下完成头部固定，这些条件通常用于啮齿类动物脑部研究的植入手术。该方法在植入手术过程中，利用自制的头部固定杆部分成型丙烯酸树脂水泥，从而替代金属头柱。该固定杆与其他植入物（如神经记录探针、刺激电极）具有较高的空间兼容性，同时通过省去螺钉固定步骤，简化了将动物头部夹持到固定平台上的操作流程。我们在先前的行为学研究中应用了该方法，结果表明该方法易于实施，且在实际实验操作中十分便捷9。
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方案
伦理声明：
本实验经庆北国立大学机构动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（1996年）发布的《实验动物护理与使用指南》进行。实验结束后，动物在二氧化碳安乐死条件下被处死。
1. 大鼠头部固定杆的设计
注意：此步骤仅为固定杆设计的通用指南。根据动物种类或植入物的不同，可对尺寸和材料进行相应调整。建议使用 CAD 软件设计头部固定杆，但并非必需。
- 使用 CAD 软件设计一个固定杆。
- 设计一个矩形形状的固定杆（123 × 35 × 6 mm）（图 1A）。在固定杆中部开一个矩形凹槽（16 × 20 mm；端口）。在端口边缘添加用作导轨的斜面或凹陷结构（图 1A-a，图 1B-箭头）。
注意：确保端口区域覆盖大鼠颅骨上大脑范围的估计矩形区域，以便通过颅骨开窗后使用立体定位操纵器垂直进入大脑大部分区域。 - 在固定杆两侧各安装一块带两个长条形锚定孔的板（50 × 20 × 6 mm）。确保这些孔可容纳直径为 6 mm 的螺钉（图 1A-d）。在端口前方制作一个直径为 3 mm 的孔，用于安装锁定钩（图 1A-b）。
- 制作一个底部为（135 × 305 mm）、侧壁为（305 × 76 mm）的盒子。按图 1A（插图）所示位置钻两个直径为 6 mm 的孔。在固定杆上添加支撑壁（图 1A-e）。
- 设计一个矩形形状的固定杆（123 × 35 × 6 mm）（图 1A）。在固定杆中部开一个矩形凹槽（16 × 20 mm；端口）。在端口边缘添加用作导轨的斜面或凹陷结构（图 1A-a，图 1B-箭头）。
- 制造所设计的固定杆和盒子，并如图 1A（插图）所示使用氰基丙烯酸酯胶水进行组装。使用直径为 6 mm 的螺钉将固定杆安装在盒子上。通过调节固定杆的螺钉位置，形成倾斜角度，以实现符合人体工学的头部固定（图 1A-插图）。
注意：对于小鼠，固定杆尺寸为 60 × 20 × 4 mm（由两层厚度为 2 mm 的丙烯酸板组成）。端口为上方宽 8 mm 的正方形，下方为 9 × 10 mm 的矩形，如图 1C所示。锚定板尺寸与大鼠用相同。盒子底板和侧壁分别为 100 × 72 mm 和 100 × 50 mm。
2. 植入手术期间头部固定装置的构建
警告：处理牙科丙烯酸树脂时需谨慎。液体可能引起皮肤刺激。请佩戴口罩并戴上手套，在通风良好的区域操作。
- 术前准备
- 使用石蜡膜紧密包裹固定杆端口的边缘，以防止所涂抹的丙烯酸树脂粘附到杆上（见图1B和图2A）。在被石蜡膜覆盖的端口边缘涂上一层薄薄的丙烯酸树脂。
- 使用灭菌的外科器械。用70%乙醇彻底消毒立体定位仪及其周围环境。
- 进行立体定位植入手术
- 通过腹腔注射混合剂（2 ml/kg）对动物进行麻醉，混合剂成分为氯胺酮10 ml（50 mg/ml）、盐酸赛拉嗪1.5 ml（23.32 mg/ml）和生理盐水2.5 ml。确认动物已完全麻醉，对尾部和脚趾夹捏无反应。必要时在手术过程中追加注射1 ml/kg的混合剂。
- 将动物固定在立体定位装置上。在眼睛上涂抹眼膏以防止术中干燥。用70%乙醇剃毛并清洁头皮。皮下注射2%利多卡因，沿颅骨中线切开头皮。彻底刮除骨膜。多次用生理盐水冲洗。
- 在颅骨边缘附近钻孔。将螺钉植入颅骨表面下4-5圈（深度约1 mm），以避免穿透硬脑膜。确保螺钉植入后颅骨表面无脑脊液或血液渗漏。用生理盐水冲洗，并用气流吹干颅骨表面，尤其是螺钉周围区域。
- 在颅骨表面涂一层薄薄的“牙科粘合剂（Super-Bond C&B）”。如果计划进行额外的电极植入，则不要完全覆盖包括前囟在内的整个颅骨表面。以前囟作为标记点确定开颅坐标。植入电极和/或微型驱动装置，并在周围涂抹丙烯酸树脂将其固定在颅骨上。
- 在牙科水泥上方再涂抹一层丙烯酸树脂。在固定螺钉和/或电极时，使用适量的丙烯酸树脂，使固定杆上的树脂与初始安装树脂之间留有足够的填充空间（图2A）。
- 将头固定杆置于颅骨表面以上5 mm或更高位置，并使其中心对齐（图2A-左）。
- 将丙烯酸树脂填充至颅底与初始安装树脂之间的间隙中（图2A-中）。等待树脂完全硬化。
- 移除耳杆，并将成型的安装器从固定杆端口中拉出（图2A-右）。如有必要，小心地在成型安装器的边缘导轨周围补充涂抹丙烯酸树脂。
- 用无菌生理盐水冲洗头皮创面。 术后立即注射抗生素（恩诺沙星，5 mg/kg，皮下）和镇痛剂（酒石酸布托啡诺，2 mg/kg，皮下）。将动物单独饲养于单个笼子中。
3. 动物头部固定适应训练
注意：此步骤描述了基于作者实证成功评估的适应性训练方案。有关头部固定适应性程序的概述，请参见Schwartz10或Guo11的研究。
- 给予动物足够的恢复时间（一周或更长时间）。第1天，以分段的短时间频密地接触动物。
- 次日（第2天），将动物暴露于固定环境中（盒子）。不要将动物的头固定装置插入固定杆的接口中。让动物自由适应环境。用手牢固抓住头固定装置1至2秒后立即松开。重复多次用手短暂固定的操作。
- 第3天，使动物适应头部固定。
- 从饲养笼中取出动物，将其放入盒子中，使头部朝向固定杆的接口方向。抓住头固定装置并将其插入固定杆的接口中。
- 使用橡皮筋将固定装置（动物头部）绑在固定杆的锁扣上。保持站立状态5分钟。
注意：固定后不要触碰动物的躯干或尾巴，以免引起动物尖叫和挣扎，增加其应激反应。若动物持续挣扎超过1分钟，应立即释放，并在稍后再次尝试。 从这一步开始，动物每次接受头部固定时均可能出现排尿和排便现象，但随着适应过程的进行，此类反应将逐渐减少。 - 取下锁定用橡皮筋，将头固定装置从接口中退出。将动物放回饲养笼，并在笼内放入一片谷物或一颗向日葵籽作为奖励。下一次试验在30分钟后开始。每天重复3.4.1至3.4.4步骤至少五次。
- 第4至7天，按照第3.4节所述方法使动物接受头部固定。随着适应过程的推进，逐步延长头部固定时间（依次为10分钟、20分钟、30分钟和50分钟）。
注意：若动物不摄取食物奖励，可能表明其处于较高应激水平，此时不应增加固定时间。若动物反复出现挣扎行为，应延长适应周期。 - 每日检查动物体重。若体重持续下降，应视为适应失败。在成功适应后，方可进行后续的头部固定行为任务。
注意：成功的适应有助于后续行为训练的顺利开展（图3E和F）。
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结果
这种头部固定方法适用于大鼠和小鼠。共有八只大鼠接受了双侧埋植刺激电极至内侧前脑束的手术。其中四只大鼠 additionally 在M1前肢区域埋植了定制的钨丝电极（微型驱动装置）（图2C）。对于小鼠（n = 2），将四根不锈钢丝电极植入额叶/枕叶皮层区域。在手术过程中，按照方案第2节所述，为大鼠和小鼠均塑形制作了用于头部固定的装置。术后恢复后，这些动物每日接受头部固定训练，用于适应性训练或行为任务。成型的头部固定装置在整个实验期间均保留在动物头部（大鼠术后保留40.5 ± 1.73（均值 ± 标准差）天，小鼠术后保留81 ± 5.66（均值 ± 标准差）天）。大鼠在行为任务期间每日接受40至60分钟的头部固定；小鼠每日接受20至40分钟的行为任务训练。
此前，我们采用该技术训练大鼠在头部固定状态下推拉杠杆。奖励为对内侧前脑束进行直接电刺激。尽管该刺激会引发明显的运动行为，但头部固定状态始终保持稳定，未发生意外的固定装置分离。
适应后，通过将橡皮筋固定到挂钩上，几秒钟内即可将头固定装置与固定杆的...
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讨论
本方案展示了一种利用手边材料进行简单便捷的头部固定方法。为实现有效的物理头部固定，手术中的首要关键步骤是在涂抹牙科粘接树脂胶之前，彻底冲洗并干燥颅骨表面。其次，该方法无需在颞肌下植入螺钉，仅依赖于颅骨上的螺钉，因此螺钉垂直植入颅骨边缘表面至关重要10。这可降低树脂固定基座意外从颅骨脱落的可能性，尤其是在大鼠中。
用于构建头部固定装置的丙烯酸树脂会粘附在固定杆上。我们通过在端口上覆盖石蜡膜来防止这一问题，但该操作较为繁琐。一种可能的改进方案是采用金属材料制作固定杆。此外，使用金属固定杆可消除石蜡膜所占据的间隙，从而在夹持时提供更高的稳定性。由于石蜡膜引入的微小间隙，所述方法可能不适用于脑成像研究。该问题也可通过使用金属固定杆或文献中提出的其他方法加以解决12。
该方法的优点之一是具有灵活性（或兼容性）。由于端口区域覆盖了通往大脑几乎所有区域的垂直通路，因此无需针对特定实验设计专用的头部固定框架。一旦设计好固定杆，便可无需任何修改地重复使用。此外，该方法可直接适用于常规实验室条件。通过使...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会通过教育科学技术部资助的基础科学研究中心项目（2010-0022362）和（2012R1A2A2A02046812）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牙科丙烯酸树脂 | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | 用于制作模制固定架 |
| 石蜡膜 | Bemis | Parafilm | 防止丙烯酸树脂粘附到固定杆上 |
| 牙科粘合剂 | Sun Medical | Super-Bond C&B | 用于丙烯酸树脂与颅骨之间的粘结 |
| 有机玻璃或其他丙烯酸板 | 用于制作固定杆和箱体平台 | ||
| 氰基丙烯酸酯胶 | 用于粘合丙烯酸板 |
参考文献
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