微电极引导下大鼠丘脑底核电极植入术用于长期深部脑刺激

摘要

本文介绍了一种将电极植入大鼠丘脑底核（STN）的方法。通过使用微电极记录系统，实现了对STN更精确的定位。此外，还介绍了一种刺激装置，其特点是动物头部与刺激器之间具有持久稳定的连接。

摘要

脑深部电刺激（DBS）是一种广泛使用且有效的治疗方法，适用于多种神经系统疾病，例如特发性帕金森病、肌张力障碍或震颤。DBS 的原理是向中枢神经系统的特定深部解剖结构输送电刺激。然而，DBS 作用机制仍不明确。这促使研究者对 DBS 在动物模型（尤其是大鼠）中的影响产生兴趣。由于 DBS 是一种长期疗法，研究应重点关注 DBS 后数周内神经回路发生的分子遗传学变化。在大鼠中实施长期 DBS 具有挑战性，因为大鼠在笼内活动会导致从动物头部连接至刺激器的导线难以保持固定。此外，大鼠脑内刺激靶区较小，因此电极难以准确放置到所需位置。为此研究建立了一种使用铂/铱电极（阻抗约为 1 MΩ）对大鼠进行长期刺激的装置。采用此类参数的电极不仅能够实现充分的刺激，还可记录深部脑区信号，以确定 DBS 的靶向区域。在本装置中，带插头的电极通过四个固定在颅骨上的锚定螺钉嵌入牙科水泥中。从插头至刺激器的导线由不锈钢弹簧保护。电路连接了一个旋转接头，以防止导线缠绕。总体而言，该刺激装置在保障大鼠高度自由活动的同时，使头部插头以及插头与刺激器之间的导线连接保持长期稳固。

引言

脑深部电刺激（DBS）是一种通过植入电极向特定脑结构（如苍白球内侧部¹、丘脑底核（STN）^2–4或丘脑腹中间核⁵）输送电脉冲的治疗方法。在过去的二十年中，该疗法已被确立为治疗帕金森病^1–4、肌张力障碍⁶和震颤⁷的有效治疗手段，同时也被用于调节慢性疼痛⁷、精神疾病（即强迫症⁸、重度抑郁症⁹）或难治性癫痫^10,11。此外，DBS未来可能成为难治性动脉性高血压¹²或直立性低血压¹³的治疗选择。

DBS 作用背后的生理机制目前仍不甚清楚。在麻醉动物模型中开展的研究揭示了神经对高频刺激的反应，这种刺激可模拟临床应用的 DBS¹⁴。然而，这些研究不仅缺乏 DBS 效应的行为学验证，而且其结果在很大程度上因所采用的刺激参数不同而表现出显著变异性¹⁴。

为了更简洁地研究清醒啮齿类动物中深部脑刺激（DBS）的行为效应及其潜在机制，需要建立满足特定要求的刺激装置。DBS通常作为一种长期治疗手段（例如，帕金森病、慢性疼痛）。因此，啮齿类动物的刺激装置应设计为包含一个带有插头的电极，以及一根从插头连接至外部刺激器的导线；该装置在固定于颅骨上时应轻便且坚固不易断裂。此外，在长时间刺激过程中，必须保证大鼠具有自由活动的能力。DBS的作用靶区体积较小；例如，大鼠的丘脑底核（STN）长度仅为1.2 mm，体积为0.8 mm^3,15。因此，电极的设计必须确保在插入过程中不损伤核团，且靶向定位必须精确。由于目前大多数在啮齿类动物中开展的DBS研究均采用基于解剖标志的立体定位插入法将电极置入靶区，即使使用Paxinos和Watson¹⁶提供的坐标，误差率仍可能相对较高，从而导致需要使用更多的动物才能获得具有统计学意义的结果。

本研究介绍了一种电极植入技术，该技术在推进电极的同时利用微记录系统，能够高精度地靶向丘脑底核（STN）。此外，还介绍了一种刺激系统，该系统不仅允许被刺激动物具有高度的活动自由，而且通过将刺激导线（由不锈钢弹簧保护）牢固地固定在大鼠头部，确保了持续稳定的刺激。

方案

动物实验已获得维尔茨堡大学和州政府法律主管部门（下弗兰肯行政区，批准编号：54-2531.01-102/13）的批准，并依照实验性脑卒中研究领域的研究建议¹⁷以及现行的《活体动物实验研究报告指南》（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments Guidelines，http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）进行。

1. 麻醉

1. 检查麻醉系统，确保手术全程有足够的供气（氧气）和异氟烷供应。将鼻罩连接到立体定位仪的门齿杆上，并将门齿杆置于 -3.3 mm 位置。
2. 打开供气（2 L/min）。将大鼠放入诱导箱并密封顶部。开启异氟烷挥发器至 3.5%。
3. 当大鼠呈侧卧状态时，切换系统，使麻醉气体流向固定在门齿杆上的鼻罩。 
4. 将大鼠从诱导箱中取出，剃除耳部与眼部之间的毛发；使用浸有Jodosept PVP的棉签擦拭剃毛区域，以清除松散的毛发。
5. 将大鼠置于鼻罩中（图1），继续以2.5%异氟烷（O₂中，1 L/min）维持麻醉。通过夹捏趾间区域检查麻醉深度。若大鼠已充分麻醉，则防御反射消失（即，缩足反应消失）。
6. 在操作过程中监测呼吸及对刺激的反应，并根据需要调节挥发器。
7. 在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。使用反馈控制的加热系统监测并维持体温在 37 ± 0.5 °C。

2. 手术

1. 整个手术过程中保持手术区域无菌。一旦手术者双手及手术区域已达到无菌状态，移动时务必小心，切勿破坏无菌环境。这包括使用无菌区域（即 无菌防水手术巾），以便放置器械。
2. 在剃毛区域中心皮下注射 0.2 ml 甲哌卡因 。甲哌卡因是一种局部麻醉药，作用持续时间可达 3 小时，可进一步麻醉手术区域。 
3. 使用手术刀，从两耳之间开始沿中线切开，向前延伸约 2 cm。确保骨膜（皮肤下的光泽膜）也被切开。用四个夹钳暴露颅骨（图 2）。
4. 使用棉签轻轻去除骨膜，直至暴露冠状缝和矢状缝；随后用脱脂棉止血。
5. 使用固定在探针架上的针头确定前囟坐标，然后用黑色记号笔标记针尖位置。通过前后（AP）、中线/侧向（ML）和背腹（DV）驱动螺钉，将针尖精确定位于前囟正上方。
6. 读取 AP 和 ML 游标刻度：将 AP 读数减去 3.6 mm，ML 读数减去 2.5 mm，用于右侧丘脑底核（STN）电极植入；若为左侧 STN 植入，则 ML 读数增加 2.5 mm。当针尖下降至颅骨表面时，记号笔染料将标记该位置。
7. 将牙科钻固定在立体定位仪的大探针架上。将牙科钻移至计算出的区域——即颅骨上的标记点。通过显微镜观察，钻出一个直径约 1 mm 的孔，直至可见硬脑膜（颅骨厚度约为 1 mm）。使用显微解剖镊或无菌针头将硬脑膜拉开。硬脑膜质地坚韧，可能损坏电极尖端。
8. 使用牙科钻在每侧额鳞及与电极孔对侧的顶间鳞部各钻一个孔。将探针架从立体定位仪上拆下。切勿在颅骨缝处钻孔，因静脉血管沿颅骨缝下方走行。
9. 将骨螺钉旋入五个 孔中。避免将螺钉旋入过深。对于不锈钢螺钉（M1.6），旋转 2–3 圈即可牢固固定螺钉，同时不会对脑组织施加压力。具体圈数取决于螺钉螺距。将带有电极的探针架夹紧于显微操作器中（图 3）。
10. 利用 AP、ML 和 DV 驱动螺钉，移动带电极的探针架，使针尖接近前囟。记录此时前囟处的 AP、ML 和 DV 游标刻度读数。读数完成后，将电极抬高数毫米，以防移动过程中电极刮擦颅骨。为确定电极插入孔的位置坐标，将 AP 读数加上 3.6 mm，ML 读数加上（或减去）2.5 mm。
11. 使用 AP 和 ML 驱动螺钉，将电极移至计算出的位置。此时电极尖端应正对已钻好的电极孔。然后通过显微镜观察，将电极下降至硬脑膜水平（图 4）。此水平作为 DV 方向的零基准。随后，在显微镜下轻柔地将电极尖端插入脑组织。
12. 将电极插针连接至记录系统的接口。将法拉第笼（或用铝箔替代）罩在立体定位仪中的大鼠上方（图 5）。将立体定位仪与所在房间的接地装置连接以实现接地。
13. 启动记录系统。如有条件，可同时使用扬声器，在推进电极过程中获取单个神经元放电/簇发放的声学信号。
14. 在推进电极的同时记录电活动，缓慢将电极插入脑内。当电极深入硬脑膜下 7.5 至 8.1 mm 时，通常可检测到 STN 的特异性电活动（图 6）。STN 神经元的典型放电特征为不规则放电模式和高放电频率（平均频率：40.9 ± 12.9 Hz）¹⁸。
15. 记录过程中应尽可能降低麻醉深度（例如降至 0.8–1.0%）；低麻醉状态的动物表现出更清晰的脑电活动。
16. 当电极下降时，若颅骨表面有血液或脑脊液溢出，应予以擦拭清除。
17. 调配少量牙科水泥，用小刮刀将其涂抹于电极周围以及五个 螺钉中的四个 周围（图 7）。第五个 螺钉将用于固定插头的地线。
18. 当牙科水泥固化后，断开电极插针与记录系统探针架及接口的连接。
19. 旋下未被牙科水泥固定的螺钉。将插头安装到电极插针上，并用第五个 螺钉固定插头的地线（图 8）。
20. 调配牙科水泥并涂抹于插头周围。随着水泥变稠，将其塑形包裹插头形成帽状结构。避免水泥边缘尖锐而伤害动物，并在硬化过程中修整去除尖锐部分（图 9A 和 B）。
21. 清创伤口边缘，并在帽状结构前后以缝线闭合伤口。对伤口边缘进行消毒。
22. 将头部插头连接至固定在旋转接头上的导线。将大鼠从立体定位仪中取出。
23. 在手术干预结束时给予曲马多（12.5 mg/kg，腹腔注射），之后每日一次，持续 2–3 天。将大鼠置于带保温支持的清洁笼具中，将旋转接头固定于该笼具（图 10），并密切观察 1 小时。
24. 在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。接受手术的动物在完全康复前不得与其他动物合笼饲养。

3. 刺激

1. 使用阻抗仪测定动物在刺激前的电阻。
2. 将滑环的插头与导线连接，并将导线另一端的插头分别连接至刺激器的电流输出端和接地线输出端。将刺激器与计算机连接，以便对刺激器进行编程。
3. 在程序中选择刺激参数；例如，帕金森病研究中常用的参数为脉冲宽度：60 μsec；频率：130 Hz。以逐渐增加的电流强度刺激大鼠，直至出现运动障碍。将电刺激强度降低至诱发运动障碍强度以下的10–20%，或降至神经学症状消失且动物状态舒适为止。本研究中采用单相矩形脉冲。
4. 实验结束后，使用异氟烷实施安乐死：调节异氟烷的流速或浓度至5%或更高，持续暴露至呼吸停止后1分钟。

结果

使用记录系统将电极植入大鼠的丘脑底核（STN）——如本文所述——是一种有效且精确的深部脑刺激（DBS）操作，每只动物耗时约1小时。该模型属于创伤较小的手术：在接受手术的10只大鼠中，全部成功存活。术后24小时对每只大鼠的状态进行监测，根据严重程度评分标准，任何动物均未超过3分中的1分。在持续刺激期间（14天，每天24小时），电极导线无一脱落、断裂或被咬断。10只大鼠中无一丢失牙科水泥帽，也未在刺激阶段因设备造成损伤。这10只动物在刺激前测得的阻抗为353 ± 101 kΩ。大鼠的刺激频率为130 Hz，脉宽为60 µsec。平均刺激强度为60 µA，设定为低于口面部或对侧前爪运动障碍阈值强度的20%，从而避免在刺激期间出现摄食或运动障碍等问题。

干预和持续刺激14天后，所有10只大鼠在深度麻醉后经断头处死，并迅速取出脑组织。使用大鼠脑切片模具，切取包含丘脑底核（STN）的2 mm厚脑组织块，并立即在–80 °C下冷冻。将这些脑组织块切成冠状切片（厚度8 µm）。每张切片均用苏木精和伊红染色，以确定电极尖端的位置，并检测因电极引起的炎症或瘢痕组织迹象。在10只动物中，有8只成功将电极...

讨论

本研究提供了一套逐步操作指南，用于将单极慢性电极植入大鼠的丘脑底核（STN）。尽管通常采用低阻抗钨电极进行深部脑刺激（DBS）^18,19，但本实验选用了一种由铂/铱（Pt/Ir）制成、阻抗约为1 MΩ的单极电极。由于其优良的性能，铂/铱电极也常用于帕金森病患者：只要不使用高电荷密度，这类电极表现出极小的腐蚀性²⁰，且不会引起明显的组织损伤²¹。鉴于本研究旨在建立长期刺激模型，并为了实现可转化的研究方法，本实验采用了上述规格的电极。对显示电极尖端定位的脑切片进行组织学检查，进一步证实了本实验中铂/铱材料引起的异物反应较弱²²。

本研究中使用了阻抗为 1 MΩ 的铂/铱（Pt/Ir）电极。  阻抗更低或更高的电极仅适用于记录脑活动或刺激脑结构中的一种功能，而无法同时实现两种功能。相比之下，本研究所采用的 1 MΩ 阻抗电极既可用于记录深部脑区的电活动，也可用于刺激如丘脑底核（STN）等脑结构。记录电活动的主要优势在于能够在较短时间内准确定位 STN。正如我们的结果所示，记录法可实现 STN...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铂/铱电极	FHC Inc.	UE	定制：规格：UEPSEGSECN1M
塞子	GT Labortechnik (Arnstein/德国)		定制
针座	DISTRELEC	143-95-324	单排，90° 1x3 datamate，型号 M80-8420342
插座	DISTRELEC	143-95-621	单排，直型 2 mm 极数 1 x 3 datamate，型号 M80-8400342
不锈钢弹簧	Plastics ONE	SS0102	部件编号：.120 X .156 弹簧内径 (mm)：3.0  弹簧外径 (mm)：4.0
牙科水泥/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	液体，500 ml
牙科水泥/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	粉末，玫瑰色，500 g
头螺钉	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
碘伏消毒剂（Jodosept PVP）	Vetoquinol		435678/E04
甲哌卡因 1%	AstraZeneca		PZN03338515
肾上腺素	Sanofi-Aventis		PZN00176118
盐酸曲马多	Rotexmedica		38449.00.00