对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录可实现神经呼吸网络输出信号的监测

摘要

中枢呼吸驱动位于脑干。通过在第四腹根放置电极，可记录离体脑干-脊髓自发产生的呼吸运动输出。该实验方法对于研究药物作用、评估呼吸挑战以及遗传操作对节律性运动行为的影响具有重要价值。

摘要

尽管已知中枢呼吸驱动位于脑干，但其基本功能、发育过程以及对刺激的反应仍有许多方面尚未完全阐明。为了克服在完整动物体内难以接触脑干的困难，可分离脑干及部分脊髓进行研究。该标本被置于人工脑脊液中，其中气体浓度、成分和温度均受到控制并持续监测。呼吸神经网络的输出信号通过放置在第四腹根上的吸吮电极记录。通过这种方式，可直接向脑干施加刺激，并直接记录其效应。所记录的信号与经由膈神经传递至膈肌的吸气信号相关，表现为规律性爆发活动（约每分钟8次爆发）。通过对这些爆发活动（包括频率、幅度、持续时间及曲线下面积）的分析，可精确表征刺激对呼吸神经网络的影响。该方法的主要局限在于标本在出生后早期阶段之外难以维持活性。因此，该技术主要集中于研究新生大鼠中不受外周输入影响的完整呼吸网络。

引言

呼吸是一种由大脑控制的复杂而重要的活动，能够实现氧气（O₂）的摄取和二氧化碳（CO₂）的排出。中枢呼吸驱动由位于脑干的复杂神经网络产生，在哺乳动物¹、两栖动物²、爬行动物³、鸟类⁴以及鱼类⁵中均存在。尽管呼吸研究可以在体内（in vivo）进行，但深入的机制性研究需要直接接触呼吸控制网络。为此，Adrian 和 Buytendijk 开发了一种简化版的金鱼模型，通过在脑干表面放置电极，记录与鳃部通气相关的节律活动⁵。此后，Suzue 于1984年⁶将该方法改进并应用于新生啮齿类动物。这一模型的出现极大地推动了呼吸神经生物学的发展。由于该技术相对简便，本文所介绍的方法适用于对新生啮齿类动物节律性运动行为及其起源开展广泛的基礎研究。

该方法的总体目标是记录呼吸网络产生的、与吸气活动相关的神经信号，即一种称为“拟呼吸”的呼吸样节律。该方法可广泛应用于多种研究目的，旨在探究野生型⁷和转基因⁸动物中吸气活动对呼吸变化或药物干预的响应。由于实验在低温条件下进行，缺乏感觉传入神经，且人工脑脊液（aCSF）中葡萄糖和O₂浓度较高，因此有人对所记录信号的生理相关性提出了质疑。尽管体内（in vivo....

方案

本方法需使用动物实验对象，已获拉瓦尔大学动物伦理委员会批准（方案编号 # 2012-170）。

1. 设置与准备

1. 溶液
   1. 根据以下配方制备 aCSF 储存液 ^7,17其他具有浓度变化的配方可在文献中找到。储存储备液于4 °C，最长可保存一个月。
      1. 盐溶液：加入75.39 g NaCl（终浓度129 mM）；2.5 g KCl（终浓度3.35 mM）；0.81 g NaH2PO4（终浓度0.58 mM）；2.33 g MgCl2（终浓度1.15 mM）；1.85 g CaCl2（终浓度1.26 mM）。溶于800 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。
      2. 碳酸氢盐溶液：加入17.65 g NaHCO₃₃ （终浓度21 mM）。先溶于900 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。碳酸氢盐浓度的改变将导致pH值的变化。
      3. 葡萄糖溶液：加入54.06 g葡萄糖（终浓度30 mM），溶于400 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至500 ml。
   2. 通过将100 ml盐溶液、100 ml碳酸氢盐溶液和50 ml葡萄糖溶液加入1 L蒸馏水中进行稀释，配制aCSF。4 °C保存备用。
   3. 通过加热和拉伸玻璃管制备玻璃电极，直至其断裂。使用前将尖端打磨光滑。....

结果

如引言中所述，该技术最重要的优势之一是能够直接接触脑干以施加各种刺激。例如，本实验中应用了低氧刺激。 图1.A.B. 展示了完整实验方案的记录，包括常氧和低氧条件。 图1.C.E. 显示在常氧条件下记录的节律（即，用95% O₂混合气体饱和的aCSF₂ 和5% CO₂ 在 26 °C）。如先前在此完全相同的制备中已证实的那样 ¹¹，频率约为每分钟8次爆发，振幅约为0.800 mV。需要注意的是，由于不同样本之间存在显著差异，振幅仅具有参考意义。上部曲线表示积分信号，下部曲线表示原始信号。 图1.D.F. 显示在缺氧条件下记录的节律（即，用95% N₂混合5% CO₂饱和的aCSF₂ 和5% CO₂₂ 在 26 °C）。如先前所描述的那样²³在缺氧期间，频率显著降低。 图1.G.H. 显示单次爆发，呈现常氧.......

讨论

准确量化呼吸活动可能具有挑战性。事实上，呼吸是一种既可自动进行又可受意识控制的功能，且会根据环境、机体需求、情绪状态和行为而发生调节。该技术的优势在于能够分离出产生呼吸指令的神经元结构。因此，脑干-脊髓离体标本的电生理记录与体积描记法分别作为互补技术，可用于在体外和体内研究完整的呼吸神经网络in vitro和in vivo。在脑干-脊髓离体标本上进行膜片钳记录（例如，从腹侧表面接近）也是可行的，可在保持完整的呼吸神经网络环境中研究特定神经元²⁴。

该方案包含若干关键步骤，主要集中在解剖过程。为避免神经组织损伤，所有解剖操作均应迅速而精确地进行。神经组织不得受损，并须通过持续浸入人工脑脊液（aCSF）中加以小心保护。如前所述，神经根丝与电极之间连接的质量是第二个关键步骤。通过吸吮根丝可使电极更贴近制备样本。虽然电极与脑干之间的接触可提高封接质量，但必须避免造成凹陷或对样本产生物理性损伤。

分析时应始终使用积分信号，但原始信号有助于区分真实的簇状放电与背景.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	在通风橱中使用
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-葡萄糖	Bioshop	GLU501
碳酰气	Linde	343-02-0006
温度控制器	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
吸引电极	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 573000
差分交流放大器	A-M Systems, Everett, WA, USA	型号 1700
移动平均器	CWE, Ardmore, PA, USA	型号 MA-821
数据采集系统	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	型号 DI-720
LabChart 软件	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism 软件	Graphpad, La Jolla, CA, USA
解剖室	塑料盒（例如培养皿）即可
记录室	自制
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
显微操作器	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
底座	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
蠕动泵	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
法拉第屏蔽笼	自制
计算机