方法文章

利用双选择回放测试确定小鼠超声波发声偏好

DOI：

10.3791/53074

⸱

2015年9月3日

 ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine, Azabu University, 2Division of Electric and Information Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Kato Acoustics Consulting Office

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠的超声波发声（USVs）因年龄、性别、状态和遗传背景的不同而有所差异。通过在不同位置同时使用两个超声波发射器，这种双选择测试可评估小鼠对USVs不同特征的识别和偏好反应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠在多种情况下会发出超声波叫声（USVs），例如幼崽隔离和成年个体之间的社交互动。这些超声波叫声会因发声动物的年龄、性别、状态和遗传背景而有所不同。尽管已有大量研究对这些差异进行了表征，但尚不清楚接收叫声的小鼠是否能够区分客观上不同的超声波叫声，并对某些特定的声音特征表现出偏好。为了确定小鼠是否能够区分超声波叫声的不同特征，近期开发了一种回放实验，可通过位置偏好来评估小鼠对两种不同超声波叫声的偏好反应。

首先，记录小鼠的超声波发声（USVs）。然后，对记录到的超声波发声进行编辑，按需裁剪，并导出为立体声音频文件。接下来，调节实验中使用的两个超声发射器所生成的USV振幅，使其达到相同的声音压力水平。采用纳米晶硅热声发射器回放超声波发声。最后，为了研究受试小鼠对特定超声波发声的偏好，在双选择测试箱中同时回放两种不同的USV信号。小鼠通过反复进入靠近某一超声发射器的指定区域，并在该发射器前方的金属丝网处搜寻，表现出对其中一种声音的偏好。该模型可用于在不同情境下比较小鼠超声波发声各种特征的吸引力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

许多动物利用发声进行种内交流。在小鼠 Mus musculus 中，一种重要的交流信号是超声波发声（USVs），其频率高于 20 kHz。小鼠发出的超声波发声被认为在雄性-雌性1-4、雌性-雌性1, 5 和雄性-雄性1, 6 的互动中参与社会识别过程。当幼鼠与母鼠分离时，也会发出超声波发声，从而增强母鼠的捡回行为，进而提高幼鼠的存活率7。尽管已有大量研究对小鼠的超声波发声进行了分析和分类8,9，但接收个体的行为反应及其神经机制的报道相对较少10, 11。后者对于阐明超声波发声各种特征的生物学意义至关重要。为了揭示这些机制，回放实验是一种高效的方法。近期的回放研究表明，雌性小鼠会被超声波发声所吸引12，并且更偏好来自与其亲本不同的雄性小鼠的超声波发声13, 14。

本文介绍了用于评估小鼠对超声波发声（USV）偏好的回放测试。设计了一种双选择测试箱，可在测试 enclosure 的两个隔间内同时播放两种不同的超声波发声，如图1所示。该类型的测试箱通过使用铅板将测试区域分隔为三个子腔室，从而防止声音交叉污染。超声波发射器位于每个房间的外部。在房间与超声波发射器之间的墙壁上设有小孔，小孔覆盖有金属网。小鼠可在三个房间内自由活动，并表现出“寻找金属网”的行为，仿佛对超声波发射器回放的超声波发声作出反应。在此测试中，小鼠会在不同时间段内停留在某一声音发射器附近或另一发射器附近。这些参数可被记录下来，以获得对声音偏好的敏感测量指标。

为了回放小鼠超声 vocalizations（USVs），采用纳米晶硅热声发射器（即“nc-Si 发射器”），方法与先前研究一致15-17。该装置由一层薄膜加热电极、一层纳米多孔硅层以及一片单晶硅晶圆组成。数字音频文件被转换为模拟信号后，通过加热电极传递。该装置将随之产生的电压依赖性热信号转化为具有低失真的显著声压。此装置的独特之处在于，不同于依赖机械振动的常见声音发生器，它无需振膜即可重现声音。该发射器在 20 至 160 kHz 频率范围内表现出平坦的声压级（图 2），并能在持续时间、频率和声压级方面非常准确地重放数字记录的小鼠超声 vocalizations（USVs）15, 18, 19。

在 图3 所示的一个代表性实验中，C57BL/6（B6）雌性小鼠被允许在BALB/c（BALB）雄性小鼠的超声发声（USVs）与背景噪音之间进行选择。此外，图4 展示了B6和BALB雌性小鼠在同时播放的BALB雄性与B6雄性USV之间的选择行为，该结果来自先前的一项研究14。B6与BALB品系雄性小鼠的USV特征存在差异20。这些结果表明，利用本实验方案可以评估USV的吸引力，该方案包括从活体个体中记录声音、进行声学分析，并将声音回放给其他个体。

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方案

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所有操作均经Azabu University伦理委员会批准。所有实验均在隔音室内进行。

1. 动物准备

  1. 用于录音的雄性小鼠
    1. 获取有交配经验的性成熟雄性小鼠。
  2. 雌性实验对象
    1. 获取未交配过的雌性小鼠，每笼饲养 2 至 5 只同窝仔鼠（通常为 8 - 12 周龄）。
    2. 根据 McLean21 的方法，在实验前每日采集阴道涂片以确定动情周期的阶段。操作时应尽量减少对阴道的刺激，以避免假孕的发生。
    3. 用吉姆萨染色法对涂片进行染色，并根据白细胞、角化上皮细胞和有核上皮细胞的有无来判断动情周期的阶段，具体方法参照 Nelson22。

2. 仪器设备（图1）

带有电脑、A/D、D/A转换器和小鼠测试环境示意图的超声行为实验装置。
图1. 双选择测试箱及设备示意图。 小鼠可通过位于中性区与A室、B室之间的狭小通道进入A室或B室。双选择测试箱及两个超声发射器置于隔音室地面。麦克风悬挂在隔音室内。缩写：PC，个人计算机。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用于录音
    1. 使用 USB A/D 转换器将超声电容麦克风连接到计算机。
    2. 将 A/D 转换器的增益水平设置为“7”。
    3. 使用音频采集软件以 16 位格式、400 kHz 采样率记录声学数据。
  2. 用于播放
    1. 通过 USB 接口将 D/A 转换器连接到计算机。
    2. 通过衰减器将两个放大器连接至 D/A 转换器。（后者用于防止过载。）
    3. 将超声发射器连接至每个放大器。

3. 超声波发声（USV）记录

  1. 将一只雄性小鼠放入一个小型（17 x 10 x 11 cm）或中型（21 x 14 x 13 cm）笼子中，笼壁侧面开有一个直径为6 cm的孔，并用0.5 cm的金属网覆盖该孔。使用中型笼子时，需在笼子中央设置隔板以减小活动区域。
  2. 笼内不要使用垫料，以避免产生沙沙声干扰录音。
  3. 将麦克风放置在金属网旁边。
  4. 使用步骤2.1中所示的录音装置开始超声波发声监测。
  5. 将一只性成熟的、处于间情期或动情后期的雌性小鼠放入与雄性小鼠相同的笼子中。
  6. 记录超声波发声（USVs）持续3–5分钟。

4. 测试盒

  1. 使用亚克力板构建测试箱（图1）。
    注意：测试箱（35 × 20 × 20 cm 高）分为三个区域：一个中性区（15 × 20 cm）和 A、B 两个房间（每个房间为 20 × 10 cm）。房间 A 和 B 各有一个直径为 4 cm 的孔，孔上覆盖 0.5 cm 的金属网。孔和金属网分别位于房间 A 和 B 的末端。在中性区与房间 A 和 B 之间设置闸门（每个 5 × 5 cm）。
  2. 为防止声音泄漏，使用橡胶板对每个超声波发射器进行包裹绝缘处理，仅保留朝向金属网的一侧暴露，并将橡胶板沿每个金属网的周边密封固定在测试箱上。
  3. 在房间 A 与 B 之间的隔板两侧加装铅密封条，以实现声音隔离。

5. 准备声音播放

  1. 播放声音的制作
    1. 使用数字音频编辑软件从录音文件中截取一段持续 20 秒的超声波发声（USV）片段。
    2. 从 20 秒的 USV 片段文件中选取并截取背景噪声（0.35 秒）。通过重复该噪声片段创建一个时长为 20 秒的背景噪声文件。
    3. 为同时播放这两个声音文件，将其导出为单个立体声声音文件，其中一个文件对应“左耳”，另一个文件对应“右耳”。
    4. 使用截止频率为 40 kHz 的高通滤波器对声音文件进行滤波。
    5. 在后期处理软件中使用降噪工具降低噪声。选取文件中不含 USV 的一段作为降噪轮廓样本，以强度等级 40 执行降噪处理。
  2. 播放声音的校准
    1. 确保超声波发射器与麦克风之间的距离为 10 cm。
    2. 为校准超声波发射器发出的声音压力水平，采用步骤 2.1 中描述的配置进行超声监测。通过麦克风测量声音压力水平（单位：分贝，dB）。
    3. 利用衰减器和放大器，将超声波发射器生成的 USV 音量调节至与步骤 3 中记录的雄性 USV 相同的声音压力水平。
    4. 当使用两个超声波发射器以及由 USV 和背景噪声组成的声音文件时，在进行行为测试前，应使用校准音（e.g.，75 kHz 纯音）确认两个超声波发射器具有相同的声音压力水平。
    5. 当重放由两路 USV 组成的声音文件时，应在测试前将两个生成的声音压力水平调节至相同水平。

6. 双选择测试

  1. 将超声波发射器放置在测试箱的网格后方。
  2. 用丙烯酸板关闭A室和B室的门，让雌性受试动物在中性区域适应30分钟。用丙烯酸板盖住箱子，防止小鼠逃逸。
  3. 使用安装在箱子上方的CCD摄像机开始视频记录。该摄像机（未在图1中显示）覆盖所有三个隔室的区域。
  4. 移除门板和盖板，允许雌性小鼠自由探索测试箱，包括声音区域。
  5. 当雌性小鼠已探查过两个网格并返回中性区域后，开始重复播放一段20秒的声频文件，持续5或10分钟。
  6. 进行5或10分钟的行为监测。
  7. 为减少前一只受试动物留下的不必要嗅觉线索，每次测试之间用70%乙醇清洁测试笼。
  8. 随机交换超声波发射器A和B的位置，以避免对A室或B室产生固有的侧向偏好效应。

7. 统计分析

  1. 使用行为事件评分软件，分析以下参数：进入每个房间的总次数；在每个中央区域停留的总时长；在每个声音区域停留的总时长；以及在超声发射器前方每个网格前搜索行为的总时长。图1说明了“中央区域”和“声音区”的定义。
    注意：当小鼠停留在两个区域之间的分界线上时（图1，虚线），应根据其头部朝向判断所在区域。若头部朝向网格一侧，则记为在声音区停留。
  2. 针对每个行为参数，使用Wilcoxon符号秩检验或配对t检验（显著性水平为0.05），比较房间A与房间B的反应差异。

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结果

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在代表性实验中（如图3所示），播放声音采用了来自一只BALB雄性小鼠记录到的超声发声（每20秒161个音节）以及背景噪声。本实验使用了7只9周龄的B6品系雌性小鼠。为确定雌性小鼠对播放声音反应的最佳测试时长，将整个10分钟测试时间分为前5分钟和后5分钟，分别分析其行为参数。

首先，在播放前的探索时间内，小鼠在A室或B室的总停留时间无显著差异（图3A），表明不存在侧向偏好。结果还显示，在分析前5分钟、后5分钟及整个测试时间时，背景噪声侧与雄性超声发声（male-USVs）侧在进入房间次数上均无显著差异（图3B）。图3C展示了播放期间在每个房间的累计停留时间（即在中央区域和声音区域的总停留时间）。在分析前5分钟（p = 0.043）或整个测试时间（p = 0.043）时，实验对象在BALB品系雄性超声发声侧的停留时间显著长于背景噪声侧；但在分析最后5分钟时，这些参数无显著差异。在中央区域，背景噪声侧与雄性超声发声侧之间也无显著差异

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讨论

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本实验的代表性结果表明，雌性小鼠能够区分人工雄性超声 vocalization（USVs）与背景噪声（图3）。从这些结果可以得出结论：小鼠的辨别行为体现在其在房间和声音区域停留的时间，以及在测试前5分钟内对网格区域的搜寻时间，但在第二个5分钟内则无此表现（图3C、E和F）。这些数据表明，小鼠对播放的声音产生了习惯化，可能是因为在超声发射器附近缺乏真实的社会互动。因此，最佳测试时长为5分钟。

这些发现或许可以解释一个现象，即超声波发声（USVs）可能仅仅是“比噪声听起来更新颖”。然而，之前的一项回放研究表明，雌性小鼠会被雄性超声波发声的声音所吸引，但不会被新颖的人工声音吸引12。因此推测，仅仅具有新颖性的声音对雌性小鼠并不具备吸引力。

与预期一致，超声波发声（USV）偏好依赖于动情周期的阶段，因为中等水平的雌激素会增强对雄性的社交探查行为23。先前一项研究发现，处于动情前期或动情期的雌性并未表现出对本研究中观察到的异品...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）研究员项目对 A.A. 的资助；日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究项目（编号 4501 和 25132712）对 T.K. 的资助；以及由麻布大学资助的研究项目支持。图 2 重印自 Kihara, T., Harada, T., & Koshida, N. 《纳米晶硅热诱导超声发射器的晶圆兼容制备与特性》，载于《Sensors and Actuators A: Physical》第125卷，Elsevier，第 426 页，(2006)，经 Elsevier 许可授权。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
隔音室Muromachi Kikai
小型笼具CLEA JapanCL-0113-1
中间笼位CLEA JapanCL-0103-1
超声波电容式麦克风Avisoft BioacousticsCM16/CMPA
A/D转换器Avisoft BioacousticsUltraSoundGate116H
音频软件Avisoft BioacousticsRECORDER USGH
Adobe Audition 3.0 / 音频编辑软件Adobe 系统公司Adobe Audition 3.0
非晶硅发射极原始目前尚未商业化，但预计在不久的将来会实现商业化
D/A转换器国家仪器公司NI USB-6251 BNC
衰减器原始
放大器Yamatake
PCWindows 7 专业版英特尔® 酷睿 i7-2600K 处理器 @ 3.4GHz，8GB 内存，64 位操作系统
事件记录器 Excel宏 / 事件评分软件原始由 Naoto Akagawa 编程 && Takeru Yamamoto
CCD相机
橡胶板（由弹性体树脂制成）东京暴乱TI-75BK B4将它们裁剪至合适尺寸 http://www.piano-bouon.jp/shopping/?pid=1329272401-447630&ca=6&p=3
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参考文献

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  1. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PLoS One. 2 (4), e351(2007).
  2. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T+tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10 (1), 44-56 (2010).
  3. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133(2012).
  4. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PLoS One. 9 (5), e97244(2014).
  5. Amato, F. R., Moles, A. Ultrasonic vocalizations as an index of social memory in female mice. Behav. Neurosci. 115 (4), 834-840 (2001).
  6. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401(2012).
  7. Ehret, G. Infant rodent ultrasounds–a gate to the understanding of sound communication. Behav. Genet. 35 (1), 19-29 (2005).
  8. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (1), e386(2005).
  9. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46 (1), 28-34 (2007).
  10. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136 (6), 3401(2014).
  11. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PLoS One. 9 (1), e85405(2014).
  12. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biol. Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  13. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice, Mus musculus musculus. Anim. Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  14. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in iice. PloS one. 9 (2), e87186(2014).
  15. Uematsu, A., et al. Maternal approaches to pup ultrasonic vocalizations produced by a nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitter. Brain Res. 1163, 91-99 (2007).
  16. Okabe, S., et al. The effects of social experience and gonadal hormones on retrieving behavior of mice and their responses to pup ultrasonic vocalizations. Zoolog. Sci. 27 (10), 790-795 (2010).
  17. Okabe, S., et al. Pup odor and ultrasonic vocalizations synergistically stimulate maternal attention in mice. Behav. Neurosci. 127 (3), 432-438 (2013).
  18. Shinoda, H., Nakajima, T., Ueno, K., Koshida, N. Thermally induced ultrasonic emission from porous silicon. Nature. 400 (6747), 853-855 (1999).
  19. Kihara, T., Harada, T., Koshida, N. Wafer-compatible fabrication and characteristics of nanocrystalline silicon thermally induced ultrasound emitters. Sensor. Actuat. A-Phys. 125 (2), 422-428 (2006).
  20. Kikusui, T., et al. Cross fostering experiments suggest that mice songs are innate. PloS One. 6 (3), e17721(2011).
  21. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389(2012).
  22. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biol. Reprod. 27 (2), 327-339 (1982).
  23. Tomihara, K., et al. Effect of ER-beta gene disruption on estrogenic regulation of anxiety in female mice. Physiol. Behav. 96 (2), 300-306 (2009).
  24. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R. Hearing loss associated with the modifier of deaf waddler (mdfw) locus corresponds with age-related hearing loss in 12 inbred strains of mice. Hear. Res. 154 (1-2), 45-53 (2001).
  25. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  26. Grimsley, J. M., Monaghan, J. J., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PLoS One. 6 (3), e17460(2011).
  27. Sugimoto, H., et al. A role for strain differences in waveforms of ultrasonic vocalizations during male-female interaction. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  28. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 7 (7), e40782(2012).
  29. Wang, H., Liang, S., Burgdorf, J., Wess, J., Yeomans, J. Ultrasonic vocalizations induced by sex and amphetamine in M2, M4, M5 muscarinic and D2 dopamine receptor knockout mice. PLoS One. 3 (4), (2008).
  30. Moles, A., Kieffer, B. L., D'Amato, F. R. Deficit in attachment behavior in mice lacking the mu-opioid receptor gene. Science. 304 (5679), 1983-1986 (2004).
  31. Hiramoto, T., et al. Tbx1: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse. Hum. Mol. Genet. 20 (24), 4775-4785 (2011).
  32. Ey, E., et al. Absence of deficits in social behaviors and ultrasonic vocalizations in later generations of mice lacking neuroligin4. Genes Brain Behav. , (2012).
  33. Roy, S., Watkins, N., Heck, D. Comprehensive analysis of ultrasonic vocalizations in a mouse model of fragile X syndrome reveals limited, call type specific deficits. PLoS One. 7 (9), e44816(2012).

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