小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮及血小板-白细胞相互作用的活体显微成像

摘要

这种简化的小鼠肠系膜静脉活体显微成像方法可用于多种炎症模型，以观察白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。

摘要

活体显微成像是一种可用于研究活体动物不同区域和血管内多种生理过程的方法。本实验方案描述了肠系膜静脉的活体显微成像技术。该方法可在较短时间内完成，结果具有良好的可重复性，能够清晰显示白细胞与血管内皮间的相互作用 体内我们描述了内皮在脂多糖（LPS）刺激后所形成的炎症环境。然而，在此模型中，可应用多种不同类型的炎症条件，如细菌性、化学性或生物性刺激，并可用于研究药物给药及其对活体动物的直接作用，以及对白细胞募集的影响。该实验方案已成功应用于多种小鼠处理方式，并用于分析其对血管炎症反应的影响。本文中，我们通过使用罗丹明6G对白细胞和血小板进行荧光标记，实现其可视化。此外，还可利用靶向性荧光标记分子进行特定成像。

引言

本实验方案的目的是描述一种简化的活体小鼠肠系膜静脉内窥显微技术，用于在炎症条件下直接观察白细胞-内皮细胞以及白细胞-血小板之间的相互作用。

活体显微镜技术最初用于在炎症条件下研究白细胞与内皮细胞的相互作用in vivo^1,2，这对于理解炎症过程中白细胞的募集与功能具有重要意义，尽管实现该技术并不容易。本方案中所描述的方法基于先前已发表的研究建立。与观察血小板在生长中血栓中的整合过程³类似，并参照此前已发表的方法⁴，通过透射光显微镜检测外置的肠系膜静脉。此外，还有其他多种活体显微镜模型，例如大鼠的提睾肌模型⁵，以及小鼠和大鼠的肝脏模型⁶。

活体显微镜观察肠系膜静脉的技术已被多个研究团队开发并应用于先前的研究中。我们利用该技术观察了野生型小鼠与色氨酸羟化酶1（Tph1）-/-小鼠在白细胞募集方面的差异，后者缺乏非神经元来源的血清素，并将结果与通过长期给予选择性血清素再摄取抑制剂氟西汀而使其血小板中血清素被药理学耗竭的小鼠进行了比较⁷。我们还研究了急性氟西汀处理后白细胞与内皮细胞之间的相互作用⁸。

在本实验方案中，我们重点关注肠系膜静脉的活体显微成像，因为该模型操作快速，且能够有效测量白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。相比之下，在其他器官（如骨骼、肝脏、皮肤或提睾肌）的活体显微成像中，此类观察更具挑战性且耗时更长。本文所述模型非常适合在给予炎症刺激（例如腹腔注射脂多糖）后，对炎症性细胞间相互作用进行可重复的评估。

方案

所有动物实验均依照德国动物保护法（TierSchG）进行。小鼠的饲养与操作均遵循FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php）及国家动物福利机构GV-SOLAS（www.gv-solas.de/index.html）所规定的良好动物实验规范。所有动物实验均已获得弗莱堡大学动物福利委员会以及地方主管部门（弗莱堡行政区政府，Regierungspräsidium Freiburg）的批准。

1. 动物处理、准备及炎症诱导

1. 使用4至6周龄的雄性小鼠，体重范围为16至20 g。注意：若小鼠年龄较大或体重较重，其血管周围脂肪组织过多，会限制显微观察。
2. 手术前对所有工具和显微镜台进行灭菌。
3. 腹腔注射 20 mg/kg LPS（脂多糖），4 小时后 在显微镜检查前，向活体小鼠体内诱导细菌性炎症。
4. 将0.9%生理盐水溶液在37 °C水浴中预热，以湿润塑料腔室和肠系膜组织。
5. 在显微成像操作前，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）进行麻醉。也可使用其他麻醉方案， 例如， 2% 异氟烷吸入。 通过反射刺激（用力捏压脚趾或尾巴）无反应来确认麻醉到位。
6. 使用剃须刀剃除腹部毛发，并用浸有70%乙醇的纱布擦去松散的毛发。
7. 在麻醉状态下，将眼用软膏涂抹于小鼠眼部以防止干燥。

2. 手术

1. 使用70%乙醇对腹部进行消毒。该方法并非无菌操作，实验结束时可能对动物造成致命影响。
2. 行正中剖腹术：使用小型弯头镊子和小剪刀切开腹部皮肤。辨认剑突下血管，并在白线区域切开腹膜，以保护血管。
3. 向腹腔内滴加数滴预热的生理盐水，以保持组织湿润。
4. 通过眶后注射50 µl罗丹明6G（1 mg/ml）对白细胞和血小板进行荧光标记，操作方法如前所述^9,10。
5. 外置一段回肠并将其置于直径为10 cm的培养皿中，注意每隔一分钟添加一次37 °C预热的生理盐水（0.9%），以确保组织保持湿润。

3. 活体显微成像

1. 将小鼠置于显微镜下，使直径为 200 - 300 µm 的肠系膜静脉位于视野中央。选择周围无明显脂肪组织的血管。
2. 避免触碰肠系膜血管，以防止刺激内皮细胞。小心操作回肠袢。
3. 使用倒置或正置显微镜配合相机及显微镜软件观察血细胞与内皮细胞的相互作用。每只小鼠在 4 条不同的静脉中各记录 1 分钟 的血细胞-内皮细胞相互作用。
4. 成像实验完成后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。

4. 分析

1. 对所有参数进行离线且盲法分析。使用任何合适的软件程序进行分析。
2. 在高时间分辨率的动态影像片段（最高帧率）中，聚焦管腔内血细胞流动，确认血流状态稳定且个体间具有可比性。
3. 定量滚动中的白细胞数量。为此，在静脉中画一条垂直线，统计1分钟内穿过该线的所有白细胞。
4. 通过测量单个白细胞在内皮上稳定滚动时通过50 µm距离所需的时间，确定其滚动速度。为此，在静脉中画两条相距50 µm的垂直线。
   1. 测量一个代表性白细胞从一条线移动到另一条线所需的时间。通过将50 µm除以所需时间，计算白细胞的滚动速度（µm/s）。
5. 在0.04 mm²的视野范围内测量白细胞黏附数量。为此，在静脉内绘制一个边长为200 µm的正方形。
   1. 统计该正方形内牢固黏附的白细胞数量，定义为在30秒内无可见移动的白细胞。
6. 计数结合在单个白细胞上的血小板数量，以量化血小板-白细胞相互作用。

结果

本方案所述实验设置的概述见图1，图中显示了一只小鼠的外置回肠袢及其血管，可用于活体显微观察。图2显示，由于手术操作本身的影响，未经处理的小鼠体内白细胞出现一定程度的激活，但与脂多糖（LPS）处理的小鼠相比，几乎没有缓慢滚动或牢固黏附的白细胞。图2还展示了野生型小鼠在饮用水中接受氟西汀处理3周或未处理时，活体显微观察结果的差异。图2A-C显示了未接受额外LPS炎症刺激的结果，而图2F-H中的小鼠则额外接受了LPS处理。在此可见，LPS刺激后滚动和黏附的白细胞数量增加，同时滚动速度降低。通过这些实验，我们证明了血小板中的5-羟色胺在炎症过程中白细胞募集的初始阶段起关键作用⁷。

在图3中，活体显微镜检查在未进行额外LPS刺激的情况下进行，仅在手术前2小时经腹腔急性给予氟西汀治疗后立即实施。我们可以观察到，经氟西汀处理的小鼠中牢固黏附的白细胞数量增多，滚动速度降低，表...

讨论

本文描述了小鼠肠系膜静脉活体显微镜检查的制备与操作方法 体内该方法使我们能够观察白细胞-内皮细胞和血小板-内皮细胞之间的相互作用¹¹ 在活体生物体内直接进行。

作为炎症的早期反应，内皮细胞被激活，并与白细胞和血小板相互作用，导致滚动、黏附和跨内皮迁移¹²。但白细胞也与血小板相互作用，形成所谓的血小板-白细胞复合物，主要是血小板-中性粒细胞复合物（PNCs）和血小板-单核细胞复合物（PMCs）^13,14。这些相互作用可通过本方法进行观察和定量。

此外，该技术还可利用VCAM-1或ICAM-1等标志物检测内皮细胞的活化状态（例如， 血小板/白细胞相互作用后¹⁵.

该操作过程本身的物理刺激会引起一定程度的内皮细胞活化，从而导致白细胞出现可见的滚动现象（但几乎无缓慢滚动，也无牢固黏附）。这意味着操作者必须非常小心地处理肠系膜。如果因粗暴操作导致过度活化，将引...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
罗丹明 6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
来自大肠埃希氏菌 055:B5 的脂多糖	Sigma-Aldrich	L2637