在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
尽管微流控技术能够精确控制细胞微环境，但在微流控装置内培养细胞仍具有挑战性。在I型胶原凝胶中进行细胞的三维培养有助于稳定细胞形态和功能，这对于在微器件中构建微流控组织模型至关重要。由于微通道尺寸有限，将传统的三维培养技术从组织培养板转移至微流控装置往往较为困难。在本方法中，我们描述了一种对天然I型胶原进行修饰的技术，以制备可带多正电荷和多负电荷的胶原溶液，并可利用逐层沉积法在微流控装置内培养的细胞上方形成超薄胶原结构。这些薄层胶原能够稳定细胞形态和功能，本文以原代肝细胞作为示例细胞进行了验证，从而实现微组织在微流控装置中的长期培养。
引言
尽管微流控技术能够精确控制细胞微环境，但在微流控装置中培养细胞（尤其是原代细胞）仍具有挑战性。许多传统的细胞培养技术已被开发用于在组织培养板中维持和稳定细胞功能，但将这些技术转化应用于微流控装置中往往较为困难。
其中一种技术是将细胞培养在胶原凝胶上或夹在胶原凝胶之间，以此作为生理性的三维细胞环境模型。1 I型胶原是生物材料应用中最常用的蛋白质之一，因其在细胞外基质中广泛存在、天然丰度高、具有稳定的细胞黏附位点以及良好的生物相容性。2 多种细胞均可从胶原三维培养中获益，包括癌细胞3,45、微血管内皮细胞6和肝细胞7等。尽管在组织培养板等开放体系中使用胶原凝胶较为简便，但由于微流控装置通道尺寸有限且结构封闭，若使用会凝固的液体则容易完全堵塞通道，因而难以实施。
为解决这一问题，我们将逐层沉积技术8与天然胶原蛋白溶液的化学修饰相结合，在微流控装置中培养的细胞表面构建超薄胶原组装层。这些胶原层能够像胶原凝胶一样稳定细胞形态和功能，并可在不堵塞微流控通道的情况下将胶原基质沉积到细胞上。该方法的目标是对天然胶原蛋白进行修饰，制备出带正电和带负电的胶原蛋白溶液，并通过在细胞表面沉积薄层胶原基质来稳定微流控培养中的细胞。该技术已成功用于稳定原代肝细胞在微流控装置中的形态与功能....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 天然可溶性胶原蛋白溶液的制备
- 采用标准分离方案（如 Piez et al.15 报道的方法），制备或购买 200 mg 来自大鼠尾部的酸化可溶性 I 型胶原，浓度为 1–3 mg/ml。
- 根据所需修饰胶原溶液的终体积，按比例调整起始材料的用量。使用 200 mg 可溶性天然胶原，分别制备约 25–30 ml 甲基化胶原溶液和 25–30 ml 琥珀酰化胶原溶液，浓度均为 3 mg/ml。
2. 胶原蛋白甲基化
- 将100 mg天然酸化（pH 2–3）的胶原蛋白溶液用冰冻无菌水稀释至浓度为0.5 mg/ml，并将溶液置于冰上以防止凝胶化。
- 用几滴1 N NaOH将胶原蛋白溶液的pH调整至9–10，并在室温下搅拌30分钟。观察胶原蛋白沉淀，溶液将变得浑浊。
- 在3,000 × g下离心沉淀的胶原蛋白溶液25分钟。管底应可见清晰的凝胶状沉淀。吸除并妥善处理上清液。
- 将沉淀的胶原蛋白重悬于含0.1 N HCl的200 ml甲醇中，在室温下持续搅拌进行甲基化反应，持续4天。胶原蛋白不会完全溶解，但应破碎成微小可见的颗粒，使溶液呈浑浊状。
- 甲基化反应完成后，在3,000 × g下离心25分钟，使甲基化胶原蛋白形成沉淀。吸除并丢弃酸化甲醇上清液。
- 用无菌PBS反复吹打，....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
天然胶原蛋白可通过甲基化和琥珀酰化修饰，制备出可用于逐层沉积的多阳离子和多阴离子胶原蛋白溶液。琥珀酰化修饰将天然胶原蛋白的ε-氨基与琥珀酰基团结合，而甲基化则将天然胶原蛋白的羧基与甲基团结合（图1A）。这些对胶原蛋白氨基酸侧链的修饰会改变溶液的pH滴定曲线。与天然胶原蛋白相比，琥珀酰化减少了氨基的数量并增加了羧基的数量，而甲基化对氨基数量无影响，但减少了羧基的数量（图1B）。这些修饰改变了胶原分子的电荷特性。琥珀酰化去除了带正电荷的基团，并将其替换为带负电荷的基团，而甲基化则去除了带负电荷的基团（图1C）。
逐层沉积甲基化和琥珀酰化胶原溶液（COL LBL）可在带电表面（如细胞）上形成超薄的胶原基质组装层（图 2A）。在微流控装置内，接种于纤连蛋白包被的玻璃表面的原代肝细胞（图 2B）可被这种纯胶原基质组装层包覆（图 2C）。在细胞上沉积10个双层可形成厚度约为140 nm的胶原层.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
通过逐层沉积修饰胶原蛋白，可在带电细胞或其他材料表面沉积超薄纯胶原蛋白组装层。本研究结果表明，对天然胶原蛋白进行甲基化和琥珀酰化修饰可分别制备出带正电和带负电的多聚胶原蛋白溶液（图1），此类溶液可结合逐层自组装技术，用于在细胞（图2）或其他带电材料表面沉积超薄胶原基质组装层。此类超薄基质层可在微流控装置中接种后，稳定细胞（如肝细胞）的形态、活性和极性（图3），并维持其功能（图4）。
为了成功沉积超薄胶原层，生成甲基化和琥珀酰化胶原的修饰反应至关重要。由于羧基的甲基化反应在热力学上不利，根据勒夏特列原理，胶原的甲基化反应必须在酸化甲醇中进行，以推动反应正向进行。因此，在pH沉淀后，必须彻底去除胶原中的过量水分，再将其溶解于酸化甲醇中，以提高反应效率。对于琥珀酰化反应，在加入丙酮中的琥珀酸酐时，维持溶液pH高于9至关重要。持续监测pH值，并缓慢加入琥珀酸酐的丙酮溶液，有助于确保反应高效进行。在逐层沉积过程中，必须尽量减少细胞脱离培养基的时间。沉积10个.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院的资助，包括美国国家转化科学促进中心的微生理系统联盟资助（UH2TR000503）、糖尿病与消化及肾脏疾病研究所的露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖博士后奖学金（F32DK098905，授予WJM）以及独立研究之路奖（DK095984，授予AB）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Life Technologies | A1048301 | 浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品 |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | 浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品 |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | EMD Millipore | 08-115 | 浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品 |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | R&D Systems | 3440-100-01 | 浓缩型大鼠尾部Ⅰ型胶原蛋白的可选产品 |
| 丁二酸酐 | Sigma-Aldrich | 239690-50G | 琥珀酰化试剂 |
| 无水甲醇 | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | 甲基化试剂 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881-500G | 用于pH沉淀的试剂 |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | 用于pH沉淀的试剂 |
| 大鼠Ⅰ型胶原蛋白ELISA试剂盒 | Chondrex | 6013 | 检测胶原蛋白含量的可选方法 |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK008-1KT | 检测胶原蛋白含量的可选方法 |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Quickzyme Biosciences | QZBtotcol1 | 检测胶原蛋白含量的可选方法 |
参考文献
- Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
- Vescio, R. A., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
