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方法文章

用于生物分子时序控制释放的界面聚电解质纤维复合支架

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DOI：

10.3791/53079

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2015年8月19日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

本文内容

摘要

组织工程支架需要重现细胞微环境复杂的生化和生物物理特性。本文展示了利用界面聚电解质复合纤维作为平台，构建具有持续生化释放能力的复合型多组分聚合物支架的方法。

摘要

组织工程中使用的各种支架需要可控的生化环境，以模拟生理条件下的细胞微环境。界面聚电解质复合（IPC）纤维可用于可控递送多种生物活性物质，如小分子药物、细胞、蛋白质和生长因子。制备IPC纤维的方法简便，使其在可控生物分子递送中的应用具有高度灵活性。本文介绍了一种将IPC纤维整合到两种不同聚合物支架——亲水性多糖和疏水性聚己内酯中的方法，以构建多组分复合支架。我们证明，IPC纤维可轻松嵌入这些聚合物结构中，从而增强生物分子的持续释放能力并改善其稳定性。此外，我们还构建了一种具有拓扑结构信号和持续生化释放特性的复合聚合物支架，可对细胞行为产生协同调控作用。含有IPC纤维的复合聚合物支架代表了一种新颖且简便的细胞微环境重建策略。

引言

细胞外基质具有内在的生化和生物物理信号，能够引导细胞行为。模拟这种生理性的三维（3D）微环境，是再生医学和组织工程领域广泛探索的一种策略。例如，天然来源和合成的基质均已通过引入拓扑结构信号来模拟细胞的生物物理环境1。例如，聚己内酯（PCL）支架可通过在图案化的PDMS基底上浇铸而轻松实现图案化2。然而，大多数合成支架无法充分再现体内受控的生化环境。in vivo。对合成材料进行整体或表面修饰仅能提供细胞附着的生化信号，但仍缺乏对生化因子递送的时间调控能力3。因此，亟需开发能够模拟细胞外基质中时间可控的生化递送系统的优化支架。

微球等生物化学递送系统由于多步合成过程的严苛性和复杂性，常面临生物活性丧失和包封效率低下的问题4-6。相比之下，采用一步法制造与包封的替代方法已被证明具有显著潜力，可在避免包封效率低下和生物活性损失的同时，构建有利的生物化学微环境。一种可行的解决方案是利用界面聚电解质复合（IPC）纤维来递送和保护生物活性物质。当两种带相反电荷的聚电解质水溶液接触时，可在界面处拉伸出IPC纤维。几乎所有类型的水溶性生物分子均可添加至带负电或带正电的聚电解质溶液中，从而在复合过程中实现有用生物分子向IPC纤维中的有效包封。此外，该过程仅需水相和常温条件，因而降低了生物活性丧失的风险。利用该方法，已成功递送了具有活性的生长因子2,7，甚至活细胞8,9。此外，IPC纤维的制备方法简单，可被塑造成任意形状或取向。此类纤维的稳定性使其可被整合入疏水2和亲水性聚合物7中，形成复合支架。含有IPC纤维的复合支架不仅有助于构建生理相关的生物化学环境，还可为细胞提供物理锚定位点。

本研究展示了一种将IPC纤维整合到具有拓扑结构的亲水性和疏水性支架中的方法，以实现活性生物分子的可控释放。作为概念验证，我们将由壳聚糖和海藻酸盐制成的IPC纤维整合到生物相容性良好、无免疫原性和无抗原性的普鲁兰-葡聚糖亲水性水凝胶中，或整合到生物相容性聚己内酯疏水性支架中。

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方案

1. 聚电解质溶液的制备

  1. 纯化壳聚糖，具体步骤参见 Liao et al.。简言之，将壳聚糖溶于2%（v/v）乙酸中，配制成1%（w/v）溶液，使用93号滤纸进行真空抽滤。用5 M NaOH中和滤液，直至pH稳定至7。将析出的壳聚糖在1,200 × g离心10分钟。弃去上清液，加入去离子水洗涤沉淀的壳聚糖。重复离心和洗涤步骤两次。将沉淀的壳聚糖在-80 °C下冷冻，并过夜冻干以获得纯化产物。将纯化后的壳聚糖储存于干燥柜中。
  2. 称取1 g纯化后的壳聚糖，置于无菌细胞培养皿中。将装有壳聚糖的培养皿尽可能靠近生物安全柜内的紫外灯，进行15分钟紫外照射灭菌。使用无菌镊子将灭菌后的壳聚糖转移至玻璃容器中。用过滤后的0.15 M乙酸溶解壳聚糖，最终浓度为0.5%至1%（w/v）。
  3. 称取0.1 g海藻酸钠，溶于10 ml蒸馏去离子水（DDI水）中，配制成1%（w/v）溶液。在旋涡混合器上混合至少2小时，确保完全溶解。使用0.2 µm注射器滤器过滤海藻酸溶液。将海藻酸溶液储存于4 °C环境中。
  4. 根据生产商推荐的方法，重悬人重组生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）或β-神经生长因子（NGF）。

2. IPC 纤维的制备

  1. 将蛋白质、生长因子或其他生物分子加入到10–20 µl具有相似净电荷的聚电解质溶液中。带有净负电荷的生物分子（例如牛血清白蛋白[BSA]）应与海藻酸钠溶液混合；带有净正电荷的生物分子（例如VEGF）应与壳聚糖溶液混合。
  2. 在覆盖有Parafilm的稳定平坦表面上分别放置小份（10–20 µl）的壳聚糖和海藻酸钠溶液。壳聚糖和海藻酸钠液滴应彼此靠近放置，但不得相互接触。
  3. 将一对镊子的尖端分别轻轻浸入壳聚糖和海藻酸钠液滴中。通过捏合镊子使两种聚电解质液滴接触并合并。当两液滴接触后，缓慢垂直向上提拉镊子，从两液滴界面处牵拉出IPC纤维（图1A）。
  4. 小心地将牵拉出的IPC纤维末端固定在收集装置（如安装在旋转芯轴上的平面聚合物支架）上（见第3和第4节）。以10 mm/sec的恒定速度旋转芯轴，以形成均匀且无珠状结构的IPC纤维。提高IPC纤维牵拉速度会导致珠状结构形成，从而引起包载生化物质的突释和纤维过早断裂。10
  5. 为测定包载效率，用500 µl 1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释残留在Parafilm上的所有剩余液体。通过BCA法（用于BSA）、ELISA法（用于VEGF和NGF）或适当的检测方法测定残留物中的蛋白质或生长因子含量。

3. 制备 复合材料 普鲁兰-葡聚糖（PD）多糖与IPC纤维的水凝胶支架

  1. 制备用于收集 IPC 纤维的牺牲性普鲁兰糖支架
    1. 称取普鲁兰多糖，与去离子蒸馏水（DDI）混合，配制成 20%（w/v）的水溶液。将普鲁兰糖溶液过夜搅拌，以确保均匀。
    2. 将 15 g 普鲁兰糖溶液倒入直径为 10 cm 的组织培养级聚苯乙烯（TCPS）培养皿中。在 37 °C 下过夜干燥，将普鲁兰糖薄膜切割成 7 mm × 7 mm 的方形框架。
  2. 制备普鲁兰糖-葡聚糖多糖溶液
    1. 在去离子蒸馏水中配制 30%（w/v）的普鲁兰多糖与葡聚糖（3:1 比例）多糖溶液。过夜搅拌以确保多糖溶液均匀。缓慢加入碳酸氢钠，使多糖溶液中终浓度达到 20%（w/v）。再次过夜搅拌以确保溶液均匀。将多糖溶液储存于 4 °C。
  3. 在普鲁兰糖支架上收集 IPC 纤维
    1. 使用鳄鱼夹固定牺牲性普鲁兰糖支架（第 3.1 节）。用塑料涂层胶带将鳄鱼夹和普鲁兰糖支架固定在旋转心轴末端。以恒定速度 10 mm/sec 旋转心轴。可根据需要调整普鲁兰糖支架在旋转心轴上的方向。 
  4. 使用镊子（第 1 节）牵拉 IPC 纤维，并将牵拉端固定在旋转的普鲁兰糖支架上。以恒定速度牵拉 IPC 纤维。当到达 IPC 纤维末端时，在室温下过夜干燥纤维-支架结构。
  5. 将 IPC 纤维嵌入 PD 水凝胶支架中
  6. 每交联 1 克普鲁兰糖-葡聚糖溶液，加入 100 µl 11%（w/v）的三聚磷酸钠水溶液和 100 µl 10 M 氢氧化钠。7 使用磁力搅拌器以 60 rpm 搅拌 1 至 2 分钟。加入三聚磷酸钠和氢氧化钠后，多糖溶液几乎立即发生交联。将黏稠的多糖溶液倾倒至纤维-支架结构上，完全包埋 IPC 纤维。将复合的普鲁兰糖-葡聚糖-IPC 纤维（PD-IPC）在 60 °C 下孵育 30 分钟 ，形成化学交联的复合支架（图 1B）。
  7. 注意：第 3.3.2 步应在通风橱中操作，并佩戴适当的防护装备，因为乙酸具有腐蚀性和易燃性。
  8. 为在 PD-IPC 支架中诱导孔隙形成，将整个支架浸入 20%（w/v）乙酸溶液中 20 分钟。
  9. 通过在 1× PBS 中振荡洗涤 PD-IPC 支架 5 分钟 （100 rpm）以去除未反应的试剂。重复此步骤 2 次。
  10. 去除多余的 PBS，并立即在 -80 °C 下过夜冷冻 PD-IPC 支架。在用于任何控释或生物活性检测前，至少冻干 24 小时。

4. PCL与IPC纤维复合支架的制备

警告：二氯甲烷为危险品。操作二氯甲烷时须使用通风橱并佩戴个人防护装备。 

  1. 制备纯净及图案化 PDMS 基底
    1. 使用所需尺寸的 TCPS 片材，通过软光刻工艺制备纯净的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基底。通过在具有所需形貌的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模板上采用标准软光刻方法制备图案化 PDMS 基底12。
  2. 制备用于 IPC 纤维收集的可牺牲 PCL 框架
    1. 称取 PCL 并溶于二氯甲烷中，配制 0.9%（w/v）的溶液。每 1 cm2 的 PDMS 基底面积滴加 500 µl 的 0.9% PCL 溶液。在通风橱中使所有二氯甲烷溶剂完全挥发。重复浇铸 0.9% PCL 溶液的过程，以增加薄膜至所需厚度。将干燥后的 PCL 薄膜从 PDMS 基底上剥离。使用合适尺寸的打孔器在 PCL 框架上打孔2。
  3. 在 PCL 框架上收集 IPC 纤维
    1. 将带有孔洞的可牺牲 PCL 框架（来自 4.2.1）固定在鳄鱼夹上。使用塑料涂层胶带将鳄鱼夹固定在旋转芯轴上。在以 10 mm/sec 的恒定速度开始旋转前，将拉出的 IPC 纤维末端固定在 PCL 框架上。IPC 纤维拉伸完成后，将带纤维的框架结构在 4 °C 下过夜干燥。
  4. 将带纤维的框架结构嵌入图案化 PCL 基底中
    1. 根据需要，在 PDMS 基底上滴加 500 µl 的 0.9% PCL 溶液，以形成纯净或图案化的 PCL 基底层。多次浇铸 0.9% PCL 溶液以获得所需厚度的支架。在通风橱中使所有二氯甲烷溶剂完全挥发。
    2. 将带纤维的框架结构（4.3.1 节）放置在 PCL 基底层之上。多次在带纤维的框架结构上添加 0.9% PCL 溶液，以达到所需厚度并完全包埋 IPC 纤维，从而制备 PCL-IPC 复合支架（图 1C）。

5. 复合型IPC支架中生物制剂释放量的测定

  1. 将复合型PD-IPC或PCL-IPC支架以及独立的IPC纤维分别放入24孔板中。
  2. 用500 µl的1X PBS浸没支架和独立的IPC纤维，将样品在37 °C下孵育。在不同时间点收集PBS（释放介质），并更换为500 µl的1X PBS。
  3. 使用BCA法（BSA）、ELISA（VEGF和NGF）或其他适当的方法测定释放介质中蛋白质或生长因子的含量，以计算所掺入生物分子的累积释放曲线。

6. 在复合型 IPC 支架上接种细胞以检测释放的生物活性物质的生物活性

  1. 在生物安全柜中使用紫外光对冻干的PD-IPC或PCL-IPC复合支架进行至少20分钟的灭菌处理。
  2. 采用标准细胞培养技术制备含有2 × 105个细胞的200 µl培养基细胞悬液。将浓缩的细胞悬液接种至复合支架上。20分钟后，补充培养基至完全浸没支架。
  3. 通过Alamar Blue代谢活性检测、PC12细胞 neurite outgrowth 检测或免疫荧光等标准技术测定细胞活性。

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结果

在本研究中，我们旨在制备含有 IPC 纤维的复合支架，以实现多种生物分子的持续释放。本研究所用生物分子的特性见表1。首先将 IPC 纤维嵌入亲水性 PD 水凝胶中，形成 PD-IPC 复合支架（图1B）。为验证复合支架用于可控释放生物分子的可行性，首先采用模型分子 BSA 进行测试。BSA 以 45 ± 0.97% 的效率被成功包载至 PD-IPC 支架中。PD-IPC 支架中 BSA 的释放呈现近似线性的动力学特征，初始阶段为减弱的突释，随后进入持续稳定的释放阶段（图2）。2 个月后，BSA 的总释放量达到 97%。相比之下，单独的 IPC 纤维在 4 小时内即快速释放了 80% 的 BSA。

接下来，我们利用PD-IPC支架检测了VEGF的释放曲线及其生物活性。VEGF的包封效率为75.5 ± 2.7%，并表现出持续释放至少1周（图3A）。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于PD-IPC支架上，以评估VEGF的生物活性。在接种第1天，PD-...

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讨论

IPC 纤维由两种带相反电荷的聚电解质相互作用形成。该过程利用从聚电解质界面提取复合物的方法，促进自组装过程，从而形成稳定的纤维。IPC 纤维形成的机制确保了任何被加入到带相同电荷聚电解质中的生物分子，均可在复合过程中被整合进去10,11。相反，若将生物分子加入带相反电荷的聚电解质中，则会导致其立即沉淀。IPC 纤维简单的制备方法使其能够灵活地整合多种生物材料，如细胞、生长因子和小分子。这一 IPC 纤维的关键特性在 PD-IPC 和 PCL-IPC 复合支架中均被观察到，其中具有不同物理和生物分子特性的生长因子（电荷和分子量）均实现了高效整合。相比之下，采用微球法制备 VEGF 和 NGF 的包封效率分别可低至 16%6 和 8%13。

PD-IPC 和 PCL-IPC 支架均表现出对生物分子释放的时间控制能力。PD-IPC 支架中的 VEGF 在至少 7 天内呈现线性释放。相比之下，已有报道显示，来自聚合物微球的 VEGF 释放曲线在 24 小时内出现初始突释，释放总量至少达 60%5,14,15

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由新加坡国家研究基金会资助，该基金会由其卓越研究中心之一——新加坡机械生物学研究所管理。MFAC 获得新加坡科技研究局和法国国家科研署联合项目（项目编号：1122703037）的支持。BKKT 由机械生物学研究所资助。我们感谢 Daniel HC Wong 先生对手稿的校对，以及 Dawn JH Neo 女士在视频制作方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
普鲁兰多糖 Hayashibara Inc Okayama Japan分子量（MW）200 kDa。该材料为药用级普鲁兰多糖，用于制备普鲁兰多糖支架和PD-IPC支架。
葡聚糖Sigma AldrichD1037MW 500 kDa。该材料已不再由Sigma Aldrich生产。建议替代产品为目录号31392（Sigma Aldrich）。该材料用于制备PD-IPC支架。
碳酸氢钠 Sigma AldrichS5761碳酸氢钠必须缓慢加入普鲁兰多糖-葡聚糖多糖溶液中。快速加入碳酸氢钠将导致沉淀。 
三聚磷酸钠Sigma AldrichT5508该化学品具有吸湿性，必须储存在除湿柜中。三聚磷酸钠的水溶液必须现配现用。
氢氧化钠Sigma AldrichS5881该材料具有危险性，操作时必须佩戴适当的防护装备，如腈类手套。
壳聚糖Sigma Aldrich448877MW 190–310 kDa，乙酰化度为75%至85%。壳聚糖需经纯化以制备稳定的IPC纤维。
乙酸Merck可替换为其他品牌。该材料具有腐蚀性和易燃性。在通风橱中操作该化学品时，必须佩戴面罩、腈类手套、实验服和鞋套等防护装备。 
来自褐藻的低黏度海藻酸钠盐Sigma AldrichA2158溶于水后过夜。使用前经无菌0.2 µm注射器滤器过滤。4 °C保存。
牛血清白蛋白国药集团化学试剂有限公司溶于无菌PBS中，使用前经0.2 µm注射器滤器过滤。 
BCA检测试剂盒Pierce23225该试剂盒用于测定PD-IPC支架中BSA的释放量。 
人重组血管内皮生长因子R&D systems293-VE将生长因子溶于0.2%肝素溶液中，终浓度为5 mg/ml。
猪源肝素钠盐Sigma AldrichH3393可替换为其他品牌。将肝素盐溶于无菌水中，终浓度为1%，使用前经0.2 µm注射器滤器过滤。 
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）LonzaC2517A该原代细胞类型用于检测PD-IPC支架释放VEGF后的生物活性。 
刃天青（Alamar blue）Life TechnologiesDAL1025用于测定细胞代谢活性。将刃天青与细胞共孵育，并在标准细胞培养条件下维持2至4小时。在570 nm处测定吸光度，以确定刃天青的还原百分比，该值与细胞活性相关。 
ScanVac Coolsafe冷冻干燥机Labogene7.001.200.060该设备为非程序化冷冻干燥机，工作温度为-105至-110 °C。可替换为其他标准实验室冷冻干燥机。
聚己内酯（PCL）Sigma Aldrich181609MW 65 kDa。该产品已不再由Sigma Aldrich生产。可替换为Sigma Aldrich目录号704105。
二氯甲烷Sigma AldrichV800151可替换为其他品牌。该材料具有危险性，必须在通风橱中操作。操作该化学品时必须始终佩戴防护装备。
聚二甲基硅氧烷（PDMS；184硅橡胶试剂盒）Dow Corning(240)4019862该弹性体试剂盒包含聚合物基质和交联剂。以不同比例混合聚合物基质和交联剂将得到不同硬度的PDMS。
人重组β-神经生长因子（NGF）R&D systems256-GF用无菌去离子水重悬至终浓度为100 µg⁠/⁠ml。分装后于-20 °C保存，直至使用。
人骨髓间充质干细胞（hMSC）Cambrex该细胞类型用于检测NGF与纳米拓扑结构的协同效应。
大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞 ATCC该细胞类型用于神经突生长实验，以测定NGF的生物活性。暴露于含NGF的释放培养基后，计数具有神经突延伸的细胞数量，并归一化至总细胞数。
93号滤纸WhatmanZ699675用于壳聚糖在pH 7条件下经氢氧化钠沉淀后的纯化。
水平转子离心机Eppendorf5810R用于壳聚糖纯化过程中以1,200 × g转速离心。
带恒速旋转夹头的电机RhymebusRM5E该电机用于在普鲁兰多糖或PCL支架上制备IPC纤维。
磷酸盐缓冲液FirstBase通过过滤（0.2 µm滤器）灭菌并高压灭菌。 
直径10 mm组织培养级聚苯乙烯培养皿（TCPS）Greiner该TCPS培养皿用于普鲁兰多糖支架的浇铸。 
人VEGF ELISA试剂盒R&D systemsDVE00该ELISA试剂盒用于检测释放培养基中的VEGF。
人NGF ELISA试剂盒R&D systemsDY256该ELISA试剂盒用于检测释放培养基中的NGF。
塑料涂层胶带Bel-Art9040336该胶带用于将鳄鱼夹牢固地粘附在旋转夹头上。

参考文献

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