用于生物分子时序控制释放的界面聚电解质纤维复合支架

摘要

组织工程支架需要重现细胞微环境复杂的生化和生物物理特性。本文展示了利用界面聚电解质复合纤维作为平台，构建具有持续生化释放能力的复合型多组分聚合物支架的方法。

摘要

组织工程中使用的各种支架需要可控的生化环境，以模拟生理条件下的细胞微环境。界面聚电解质复合（IPC）纤维可用于可控递送多种生物活性物质，如小分子药物、细胞、蛋白质和生长因子。制备IPC纤维的方法简便，使其在可控生物分子递送中的应用具有高度灵活性。本文介绍了一种将IPC纤维整合到两种不同聚合物支架——亲水性多糖和疏水性聚己内酯中的方法，以构建多组分复合支架。我们证明，IPC纤维可轻松嵌入这些聚合物结构中，从而增强生物分子的持续释放能力并改善其稳定性。此外，我们还构建了一种具有拓扑结构信号和持续生化释放特性的复合聚合物支架，可对细胞行为产生协同调控作用。含有IPC纤维的复合聚合物支架代表了一种新颖且简便的细胞微环境重建策略。

引言

细胞外基质具有内在的生化和生物物理信号，能够引导细胞行为。模拟这种生理性的三维（3D）微环境，是再生医学和组织工程领域广泛探索的一种策略。例如，天然来源和合成的基质均已通过引入拓扑结构信号来模拟细胞的生物物理环境¹。例如，聚己内酯（PCL）支架可通过在图案化的PDMS基底上浇铸而轻松实现图案化²。然而，大多数合成支架无法充分再现体内受控的生化环境。in vivo。对合成材料进行整体或表面修饰仅能提供细胞附着的生化信号，但仍缺乏对生化因子递送的时间调控能力³。因此，亟需开发能够模拟细胞外基质中时间可控的生化递送系统的优化支架。

微球等生物化学递送系统由于多步合成过程的严苛性和复杂性，常面临生物活性丧失和包封效率低下的问题^4-6。相比之下，采用一步法制造与包封的替代方法已被证明具有显著潜力，可在避免包封效率低下和生物活性损失的同时，构建有利的生物化学微环境。一种可行的解决方案是利用界面聚电解质复合（IPC）纤维来递送和保护生物活性物质。当两种带相反电荷的聚电解质水溶液接触时，可在界面处拉伸出IPC纤维。几乎所有类型的水溶性生物分子均可添加至带负电或带正电的聚电解质溶液中，从而在复合过程中实现有用生物分子向IPC纤维中的有效包封。此外，该过程仅需水相和常温条件，因而降低了生物活性丧失的风险。利用该方法，已成功递送了具有活性的生长因子^2,7，甚至活细胞

方案

1. 聚电解质溶液的制备

1. 纯化壳聚糖，具体步骤参见 Liao et al.。简言之，将壳聚糖溶于2%（v/v）乙酸中，配制成1%（w/v）溶液，使用93号滤纸进行真空抽滤。用5 M NaOH中和滤液，直至pH稳定至7。将析出的壳聚糖在1,200 × g离心10分钟。弃去上清液，加入去离子水洗涤沉淀的壳聚糖。重复离心和洗涤步骤两次。将沉淀的壳聚糖在-80 °C下冷冻，并过夜冻干以获得纯化产物。将纯化后的壳聚糖储存于干燥柜中。
2. 称取1 g纯化后的壳聚糖，置于无菌细胞培养皿中。将装有壳聚糖的培养皿尽可能靠近生物安全柜内的紫外灯，进行15分钟紫外照射灭菌。使用无菌镊子将灭菌后的壳聚糖转移至玻璃容器中。用过滤后的0.15 M乙酸溶解壳聚糖，最终浓度为0.5%至1%（w/v）。
3. 称取0.1 g海藻酸钠，溶于10 ml蒸馏去离子水（DDI水）中，配制成1%（w/v）溶液。在旋涡混合器上混合至少2小时，确保完全溶解。使用0.2 µm注射器滤器过滤海藻酸溶液。将海藻酸溶液储存于4 °C环境中。
4. 根据生产商推荐的方法，重悬人重组生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）或β-神经生长因子（NGF）。

2. IPC 纤维的制备

1. 将蛋白质、生长因子或其他生物分子加入到10–20 µl具有相似净电荷的聚电解质溶液中。带有净负电荷的生物分子（例如牛血清白蛋白[BSA]....

结果

在本研究中，我们旨在制备含有 IPC 纤维的复合支架，以实现多种生物分子的持续释放。本研究所用生物分子的特性见表1。首先将 IPC 纤维嵌入亲水性 PD 水凝胶中，形成 PD-IPC 复合支架（图1B）。为验证复合支架用于可控释放生物分子的可行性，首先采用模型分子 BSA 进行测试。BSA 以 45 ± 0.97% 的效率被成功包载至 PD-IPC 支架中。PD-IPC 支架中 BSA 的释放呈现近似线性的动力学特征，初始阶段为减弱的突释，随后进入持续稳定的释放阶段（图2）。2 个月后，BSA 的总释放量达到 97%。相比之下，单独的 IPC 纤维在 4 小时内即快速释放了 80% 的 BSA。

接下来，我们利用PD-IPC支架检测了VEGF的释放曲线及其生物活性。VEGF的包封效率为75.5 ± 2.7%，并表现出持续释放至少1周（图3A）。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于PD-IPC支架上，以评估VEGF的生物活性。在接种第1天，PD-.......

讨论

IPC 纤维由两种带相反电荷的聚电解质相互作用形成。该过程利用从聚电解质界面提取复合物的方法，促进自组装过程，从而形成稳定的纤维。IPC 纤维形成的机制确保了任何被加入到带相同电荷聚电解质中的生物分子，均可在复合过程中被整合进去^10,11。相反，若将生物分子加入带相反电荷的聚电解质中，则会导致其立即沉淀。IPC 纤维简单的制备方法使其能够灵活地整合多种生物材料，如细胞、生长因子和小分子。这一 IPC 纤维的关键特性在 PD-IPC 和 PCL-IPC 复合支架中均被观察到，其中具有不同物理和生物分子特性的生长因子（电荷和分子量）均实现了高效整合。相比之下，采用微球法制备 VEGF 和 NGF 的包封效率分别可低至 16%⁶ 和 8%¹³。

PD-IPC 和 PCL-IPC 支架均表现出对生物分子释放的时间控制能力。PD-IPC 支架中的 VEGF 在至少 7 天内呈现线性释放。相比之下，已有报道显示，来自聚合物微球的 VEGF 释放曲线在 24 小时内出现初始突释，释放总量至少达 60%^5,14,15

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
普鲁兰多糖	Hayashibara Inc Okayama Japan		分子量（MW）200 kDa。该材料为药用级普鲁兰多糖，用于制备普鲁兰多糖支架和PD-IPC支架。
葡聚糖	Sigma Aldrich	D1037	MW 500 kDa。该材料已不再由Sigma Aldrich生产。建议替代产品为目录号31392（Sigma Aldrich）。该材料用于制备PD-IPC支架。
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761	碳酸氢钠必须缓慢加入普鲁兰多糖-葡聚糖多糖溶液中。快速加入碳酸氢钠将导致沉淀。
三聚磷酸钠	Sigma Aldrich	T5508	该化学品具有吸湿性，必须储存在除湿柜中。三聚磷酸钠的水溶液必须现配现用。
氢氧化钠	Sigma Aldrich	S5881	该材料具有危险性，操作时必须佩戴适当的防护装备，如腈类手套。
壳聚糖	Sigma Aldrich	448877	MW 190–310 kDa，乙酰化度为75%至85%。壳聚糖需经纯化以制备稳定的IPC纤维。
乙酸	Merck		可替换为其他品牌。该材料具有腐蚀性和易燃性。在通风橱中操作该化学品时，必须佩戴面罩、腈类手套、实验服和鞋套等防护装备。
来自褐藻的低黏度海藻酸钠盐	Sigma Aldrich	A2158	溶于水后过夜。使用前经无菌0.2 µm注射器滤器过滤。4 °C保存。
牛血清白蛋白	国药集团化学试剂有限公司		溶于无菌PBS中，使用前经0.2 µm注射器滤器过滤。
BCA检测试剂盒	Pierce	23225	该试剂盒用于测定PD-IPC支架中BSA的释放量。
人重组血管内皮生长因子	R&D systems	293-VE	将生长因子溶于0.2%肝素溶液中，终浓度为5 mg/ml。
猪源肝素钠盐	Sigma Aldrich	H3393	可替换为其他品牌。将肝素盐溶于无菌水中，终浓度为1%，使用前经0.2 µm注射器滤器过滤。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	Lonza	C2517A	该原代细胞类型用于检测PD-IPC支架释放VEGF后的生物活性。
刃天青（Alamar blue）	Life Technologies	DAL1025	用于测定细胞代谢活性。将刃天青与细胞共孵育，并在标准细胞培养条件下维持2至4小时。在570 nm处测定吸光度，以确定刃天青的还原百分比，该值与细胞活性相关。
ScanVac Coolsafe冷冻干燥机	Labogene	7.001.200.060	该设备为非程序化冷冻干燥机，工作温度为-105至-110 °C。可替换为其他标准实验室冷冻干燥机。
聚己内酯（PCL）	Sigma Aldrich	181609	MW 65 kDa。该产品已不再由Sigma Aldrich生产。可替换为Sigma Aldrich目录号704105。
二氯甲烷	Sigma Aldrich	V800151	可替换为其他品牌。该材料具有危险性，必须在通风橱中操作。操作该化学品时必须始终佩戴防护装备。
聚二甲基硅氧烷（PDMS；184硅橡胶试剂盒）	Dow Corning	(240)4019862	该弹性体试剂盒包含聚合物基质和交联剂。以不同比例混合聚合物基质和交联剂将得到不同硬度的PDMS。
人重组β-神经生长因子（NGF）	R&D systems	256-GF	用无菌去离子水重悬至终浓度为100 µg⁠/⁠ml。分装后于-20 °C保存，直至使用。
人骨髓间充质干细胞（hMSC）	Cambrex		该细胞类型用于检测NGF与纳米拓扑结构的协同效应。
大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞	ATCC		该细胞类型用于神经突生长实验，以测定NGF的生物活性。暴露于含NGF的释放培养基后，计数具有神经突延伸的细胞数量，并归一化至总细胞数。
93号滤纸	Whatman	Z699675	用于壳聚糖在pH 7条件下经氢氧化钠沉淀后的纯化。
水平转子离心机	Eppendorf	5810R	用于壳聚糖纯化过程中以1,200 × g转速离心。
带恒速旋转夹头的电机	Rhymebus	RM5E	该电机用于在普鲁兰多糖或PCL支架上制备IPC纤维。
磷酸盐缓冲液	FirstBase		通过过滤（0.2 µm滤器）灭菌并高压灭菌。
直径10 mm组织培养级聚苯乙烯培养皿（TCPS）	Greiner		该TCPS培养皿用于普鲁兰多糖支架的浇铸。
人VEGF ELISA试剂盒	R&D systems	DVE00	该ELISA试剂盒用于检测释放培养基中的VEGF。
人NGF ELISA试剂盒	R&D systems	DY256	该ELISA试剂盒用于检测释放培养基中的NGF。
塑料涂层胶带	Bel-Art	9040336	该胶带用于将鳄鱼夹牢固地粘附在旋转夹头上。