将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

摘要

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。

摘要

目前，大规模网络由解离的神经元在生长和发育过程中形成 体外 细胞外微传感器装置是研究神经元细胞群形成与维持过程中所涉基本神经生理学机制的金标准实验模型。然而 体外 以往的研究局限于记录由二维（2D）神经网络产生的电生理活动。然而，鉴于结构与动力学之间复杂的相互关系，有必要进行显著改进，以深入研究三维（3D）神经网络的形成过程及其动态发展。本文介绍了一种新颖的实验平台，该平台将3D海马体或皮层神经网络与平面微电极阵列（MEAs）相耦合。3D神经网络通过在由玻璃微珠（直径30-40 µm）构成的支架上接种神经元而构建，神经元可在其上生长并形成复杂的相互连接的3D结构。通过该方法，可构建由5-8层组成的工程化3D神经网络，并达到预期的最终细胞密度。3D结构在形态组织上的复杂性增加，导致此类网络所呈现的电生理活动模式显著增强。与标准2D神经网络中出现的高度刻板化的簇状放电活动相比，3D结构在放电活动的持续时间与频率方面均发生改变，同时还能观察到更为随机的单个动作电位活动。因此，所构建的3D模型在功能特性上更接近于 体内 神经网络

引言

体外二维（2D）神经网络与微电极阵列（MEAs）耦合，是研究神经元动力学与底层连接性之间相互作用的标准实验模型。^1,2（即，簇发放电、网络簇发放电、随机放电活动）。MEAs 可从多个位点（从数十到数千个微电极）记录电生理活动，从而在网络水平上对所表现出的动力学进行详细研究。此外，使用离体培养的细胞可实现工程化网络的设计。通过这种方式，更容易理解所记录的电生理活动与网络结构参数（如细胞密度³、模块化程度^4,5、异质性神经元群体的存在⁶等）之间的功能关系。然而，所有关于离体培养细胞的体外研究均基于二维神经网络。该方法相对于体内（本质上为三维，3D）系统存在过度简化的问题：（i）在二维模型中，胞体和生长锥被压平，轴突和树突的生长无法在所有方向上自由延伸⁷；（ii）二维体外网络表现出以簇发放电为主导的刻板电生理动力学特征，涉及网络中大多数神经元⁸。

最近，已开发出不同的解决方案，以实现构建 体外 三维解离神经网络。其基本思路是构建一种支架，使神经元能够在三维环境中生长。这种支架可通过聚合物凝胶和固体多孔基质来实现。^9-13利用聚合物的机械特性，可通过定义神经球的三维培养均匀块状结构，将细胞包埋于这些结构内部。¹¹该方法的主要特征是神经球具有刚性的机械性能^9,12然而，这些材料的孔隙率有限，且无法保证细胞在基质内部的迁移。为克服这一缺点，一种可能的解决方案是将基质切割成“单元”模块。遗憾的是，颗粒在大小和形状上的差异可能阻碍其形成规则的层状结构。在⁷，Cullen 及其同事设计了一种三维神经元结构，该结构由神经元和/或星形胶质细胞嵌入基于生物活性细胞外基质的支架中构成。这种工程化神经组织使得 体外 在三维微环境中研究和调控神经生物学反应的实验模型。该模型由均匀分布于细胞外基质（ECM）和/或水凝胶支架（厚度为500–600 µm）中的神经元和胶质细胞构成。在此条件下，当细胞接种终密度约为3,750–5,000个细胞/mm²时，细胞存活率可达最佳状态（高于90%）。³必须指出，该密度值远低于 体内 条件，小鼠脑皮层的细胞密度约为 90,000 个细胞/mm³¹⁴为克服这一局限性，Pautot 及其同事¹⁵ 实现了三维 体外 细胞密度和网络连接性被控制以模拟的系统 体内 在实现网络实时成像的同时提供稳定的培养条件。该方法的原理基于解离培养的神经元能够在 二氧化硅 微珠。这些微珠提供了足够大的生长表面，使神经元胞体能够附着，并使其树突和轴突生长、成熟、延伸，以及与其他神经元建立突触连接。该方法利用单一分散微珠自发组装的特性，形成三维分层的六边形阵列，不同层上分布着不同的神经元亚群，并限制了不同微珠上神经元之间的连接性。采用该方法实现的细胞密度约为 75,000 个细胞/mm²。³.

最近，我们已将 Pautot 的方法改进并应用于多电极阵列（MEAs）¹⁶获得的结果表明，三维电生理活动展现出比二维网络更丰富的活动模式。 3D 成熟培养物表现出增强的动态特性，其中网络簇状放电与随机尖峰活动共存。类似地，Tang-Schomer 及其同事¹⁷ 实现了一种基于丝蛋白的多孔支架，可维持原代皮层培养 体外 数月后，通过钨电极记录电生理活动。

本研究将介绍构建与微电极阵列（MEA）耦合的三维神经网络的实验步骤。

方案

本实验方案已获欧洲动物护理立法（2010/63/EU）、意大利卫生部依据 D.L. 116/1992 法令以及热那亚大学指南（编号 13130，2011 年 5 月）的批准。本项目已尽一切努力减少动物使用数量，并最大限度减轻其痛苦。

1. 材料与载体的准备

1. 使用数控（CNC）铣床构建用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）约束结构的模具。该模具由聚碳酸酯制成，中心圆柱部分采用聚四氟乙烯（PTFE）。该材料有助于在PDMS固化后更轻松地取出掩模。
   注意：模具的设计通过计算机辅助设计（CAD）完成，随后导入数控铣床进行加工。
2. 配制PDMS弹性体。PDMS是一种有机聚合物，由两种组分构成：固化剂和聚合物。按1:10的体积比混合，即1份固化剂与9份聚合物。将两种组分放入培养皿中，振荡混匀后置于真空腔中抽气10分钟 以去除气泡。每制作一个约束结构需使用3 g PDMS即可。
3. 制备PDMS约束结构。将PDMS材料注入模具中，放入烘箱于120 °C加热30分钟 。所得PDMS约束结构呈理想圆柱形，外径为22.0 mm，内径为3.0 mm，高度为650 µm。
4. 在细胞接种前一天，在体视显微镜下使用镊子将掩模精确对准微电极阵列（MEAs）的活性区域，并将PDMS掩模置于120 °C烘箱中灭菌。
5. 将玻璃微珠（标称直径为40±2 µm；认证平均直径为42.3±1.1 µm）置于锥形小瓶中，加入70%乙醇灭菌2小时 ，每隔30分钟 轻轻旋转一次，确保所有微珠均被充分暴露。 
6. 从瓶中移除乙醇溶液，并用无菌水冲洗微珠两次。
7. 用24 µl浓度为0.05 μg/ml的聚-D-赖氨酸与层粘连蛋白混合溶液，对PDMS掩模限定的MEA中央区域（直径为3.0 mm）进行预处理。
8. 将玻璃微珠用0.05 µg/ml的层粘连蛋白和聚-D-赖氨酸进行蛋白包被处理，并在37 °C培养箱中孵育过夜，以形成稳定且持久的神经元网络。
9. 去除MEA玻璃表面及玻璃微珠上的黏附因子。用移液器吸除约95%的包被液，在MEA表面加入少量无菌水（24 µl），再次吸除超过95%的水分，随后将MEA置于超净工作台中干燥1小时 ，再进行细胞接种。
   注意：对于微珠，则需吸除包被液后，先用无菌水清洗一次，再用基础培养基及其补充物（如B27）清洗一次，以完成微珠表面的预处理。切勿让微珠干燥，应使其保持悬浮于小瓶内的培养基中。
10. 使用移液器（200 µl）将处理后的微珠悬液（约32,000个）均匀分布于带有膜插件的多孔板中（膜孔径为0.4 µm），使其自组装形成均匀单层结构。
11. 向膜插件的每个孔中加入0.5 ml培养基，并置于培养箱中（温度 = 37.0 ^oC，CO₂ = 5%），直至神经元准备接种（步骤3.2）。

2. 胚胎解剖与组织解离

1. 将成年雌性大鼠（200–250 g）饲养在动物房中，保持恒定温度（22 ± 1 °C）和相对湿度（50%），并维持规律的明暗周期（光照时间为上午7点至晚上7点）。确保食物和水自由获取。
2. 使用3%异氟烷对发育18天后（E18）的妊娠雌性大鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死动物。
3. 从每只大鼠胚胎中取出海马体，并将其置于冰冷的不含Ca²⁺和Mg²⁺的Hank’s平衡盐溶液中。在发育第18天时，海马体和皮层组织非常柔软，无需切成小块。更多细节可参见文献^18,19。
4. 在含有0.05% DNA酶的0.125%胰蛋白酶/Hank’s溶液中，于37 °C条件下消化组织18–20分钟。
5. 用巴斯德吸管移除上清液，并加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基孵育5分钟，以终止酶消化反应。
6. 移除含FBS的培养基，用含补充剂（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的培养基洗涤一次。再次用巴斯德吸管移除培养基，并重新加入少量（500 µl）含补充剂（1% L-谷氨酰胺、10 µg/ml庆大霉素）的生长培养基。
7. 使用细口巴斯德吸管机械吹打组织沉淀，直至形成乳白色细胞悬液。细胞悬液无需离心。
8. 用生长培养基稀释少量细胞悬液，使终体积为2.0 ml。使用血细胞计数板测定所得细胞浓度。将该细胞悬液按1:5比例稀释，以获得目标细胞浓度600–700个细胞/µl。

3. 细胞铺板

1. 将细胞以约 2,000 个细胞/mm² 的密度接种到 MEA 的活性区域，该区域由 PDMS 限制界定，以形成二维神经元网络。
   注意：每个海马体约含 5 × 10⁵ 个细胞（单个胚胎约为 1 × 10⁶ 个）。解剖 6 个胚胎，总共获得 2 ml 体积中约 6 × 10⁶ 个细胞，细胞浓度约为 3,000 个细胞/µl。将此浓度按 1:5 稀释，以获得目标细胞浓度，即约 600–700 个细胞/µl，并接种约 600–700 个细胞/µl。若 PDMS 限制所界定的 MEA 区域约为 7.065 mm²，且接种的总细胞数为 600 个细胞/µl × 24 µl = 14,400 个细胞，则最终密度为 2,038 个细胞/mm²。
2. 将 MEA 器件置于 37 °C、含加湿 CO₂ 气氛（5%）的培养箱中。
3. 取细胞浓度为 600–700 个细胞/µl 的细胞悬液 160 µl（约含 100,000 个细胞），均匀分布于置于多孔板内的微珠单层表面，以完成三维培养构建的初步步骤。将多孔板放入 37 °C、含加湿 CO₂ 气氛（5%）的培养箱中。

4. 三维神经网络构建

1. 铺板后6-8小时 ，使用移液器吸取约30-40 µl体积，将悬浮液（含神经元的微珠）小心转移至PDMS约束区域内的指定范围。每次转移后，等待约半分钟，使微珠自发组装成六边形紧密结构。
2. 当所有层均已沉积并自发组装完成后，在PDMS约束区域顶部补充一大滴约300 µl的培养基。
3. 将与MEA结合的3D结构置于培养箱中（温度 = 37.0 ^oC，CO₂ = 5%），培养48小时 后再加入终体积（约1 ml）的含补充剂的生长培养基。
   注意：考虑带膜插件的多孔板上的微珠总数（30,000个）以及MEA器件上单层微珠数量（6,000个），所形成的3D结构由5层微珠和细胞组成。由于3D神经网络并非几何上完全规则，实际形成的3D结构可能包含5-8层。
4. 铺板次日，小心地向MEA环内加入终体积的培养基（约900 µl）。将3D培养物维持在37 °C、5% CO₂的湿化环境中培养4-5周，每周更换一半培养基。

5. 共聚焦显微镜图像采集

1. 将生物样本固定在显微镜载物台的样品 holder 上。设置激光器（氩离子激光器，496-555 nm）、扫描速度（400 Hz）以用于图像采集，以及每个图像的光电倍增管（PMT）增益和偏移（-0.3%），以匹配正确的带宽发射滤光片，并避免信号饱和，同时提高信噪比。结果部分报告了用于采集图4图像所使用的具体参数值。
2. 在采集z轴层析序列时，首先选择样本最顶层和最底层的z位置值，然后设定步进尺寸以进行图像采集。

结果

在此实验流程中，微珠在构建三维神经网络的机械支架方面发挥着重要作用。图1A和B展示了微珠在平面上的排列情况（标称直径为40±2 µm；认证平均直径为42.3±1.1 µm）。此类结构的特点在于微珠能够自发地自组装形成致密的六边形几何结构（图1B和C）。由此形成的支架为神经突提供了稳定的生长表面，同时为细胞体的代谢交换保留了足够大的间隙空间。该微珠尺寸在间隙大小与最终神经元密度之间实现了合理平衡。考虑到PDMS结构模拟了一个“理想”圆柱体，且致密六边形结构的填充因子（HPF）为0.74，因此在PDMS限定空间内最多可容纳约100,000个微珠（直径40 µm），相当于每层约含6,000个微珠。如“实验方案”部分所述，这些微珠预先用黏附因子（即，层粘连蛋白和多聚-D-赖氨酸）进行预处理，以确保神经元能够牢固地附着于微珠表面。图1D展示了一个实例，其中三个神经元连接在一个直径为40 µm的微珠上。

讨论

在此研究中，一种新颖的实验方法 体外 由3D工程化神经元培养物与微电极阵列（MEA）耦合构成的用于神经网络电生理学研究的平台已被提出。利用微珠作为支架，可促进神经突沿其结构生长 z-轴已针对平面MEA进行了定制化设计，从而使得所获得的微系统具有良好的有效性和可靠性 体外 用于研究涌现性电生理动力学的三维模型¹⁶.

MEA 记录装置

MEA 器件由一个培养室组成，其内集成了嵌入基底的微电极阵列，能够记录来自电活性组织的细胞外信号。典型的记录信号包括峰电位（spikes）即， 单个超阈值电压变化，代表一个或多个神经元的电活动）和簇发（burst）即， 高度密集的尖峰序列，常在多个通道上同时出现）。基于MEA系统的神经元网络活动记录会产生海量数据（例如， 4 小时的实验使用 60 通道的 MEA 会产生约 15 GB 的记录数据。这意味着需要高效的工具来处理和分析数据，尤其是在需要长时间记录的研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
多聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
胰蛋白酶	Gibco	25050-014	0.125%，用不含 Ca++ 和 Mg++ 的 HBSS 按 1:2 稀释
脱氧核糖核酸酶	Sigma-Aldrich	D5025	0.05%，用汉克斯溶液稀释
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	培养基
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% 培养基添加剂
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Corning Sigma	481939	固化剂和聚合物
微电极阵列	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA 参数：电极网格 8×8；电极间距和直径分别为 200 和 30 µm；无螺纹塑料环
微珠	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 克 玻璃微粒标准品，粒径 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	带膜插件的多孔板（孔径 6.5 mm，孔隙 0.4 µm）
不含 Ca++ 和 Mg++ 的 HBSS	Gibco Invitrogen	14175-052
汉克斯缓冲液	Sigma	H8264
特氟龙	Sigma	430935-5G	聚四氟乙烯
大鼠	Sprague Dawley	Wistar 大鼠
直立式共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0×0.50 WATER 物镜	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0×0.80 WATER 物镜	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0×0.95 WATER 物镜	Leica	HCX IRAPO L