三明治样微环境用于调控细胞/材料相互作用

摘要

以下方案描述了用于构建三明治样培养物的步骤，该培养物可作为二维（2D）与三维（3D）细胞环境之间的中间阶段。这种人工构建的系统可应用于显微镜观察、生物力学、生物化学以及细胞生物学检测。

摘要

细胞培养传统上是在二维（2D）基质上进行的，细胞通过腹侧受体黏附于生物材料表面。然而 体内大多数细胞完全被细胞外基质（ECM）包围, 导致受体的三维（3D）分布。这可能引发细胞外向内信号通路的差异，从而影响细胞行为。

本文表明，通过在已贴附于二维基底的细胞上覆盖一种新材料薄膜（即类三明治培养），刺激细胞的背侧受体，可引发相较于标准二维培养的重要变化。此外，同时激活细胞的腹侧与背侧受体，可使细胞行为更接近于三维环境中的状态。同时，由于该系统的特性，类三明治培养是一种多功能工具，可用于研究细胞与材料相互作用中的多种参数。 例如，拓扑结构、刚度以及腹侧和背侧不同的蛋白质包被。最后，由于类三明治培养基于二维基底，因此可直接使用为标准二维培养开发的多种分析方法，从而避免了三维系统所需的更复杂操作流程。

引言

传统上，细胞培养是在二维（2D）基底上进行的，尽管大多数 体内 细胞微环境具有三维（3D）特性。这种非自然的二维（2D）环境会引发细胞行为的改变，作为细胞对平坦环境的一种自我适应方式，从而直接影响细胞命运^1,2因此，二维细胞培养获得的结果并不总是可重复的 体内这促进了新型相关培养系统的发展，旨在提供更接近生理条件的环境，以深入探究任何与尺寸依赖性相关的生物学机制^3,4.

二维培养与三维体内环境之间的一个主要差异在于锚定于细胞外基质（ECM）上的细胞受体分布：在二维基质上，细胞仅从腹侧黏附；而在体内，大多数细胞被ECM完全包围，因此细胞黏附通过三维分布的受体实现。这会激活不同的细胞黏附信号通路，从而调控细胞生长、细胞分化和基因表达等重要过程。在过去几十年中，已建立了多种不同的三维培养系统^5-8，但其多样性和复杂性阻碍了这些系统在常规细胞培养操作中的标准化。此外，三维系统通常不易操作，现有的二维基质实验方案难以直接应用于三维培养。另外，文献中很少将三维培养与相应的二维条件或其他三维系统进行比较，这限制了对这些模型中细胞行为的准确理解。

当细胞在二维基质上贴附后，通过覆盖一层新材料薄膜（即夹心式培养），可激活细胞背侧受体，从而引发类似于三维环境中的细胞响应。其原因是背侧和腹侧受体在夹心培养环....

方案

1. 背部基质的制备

1. 通过溶剂浇铸法制备聚左旋乳酸（PLLA）薄膜
   1. 在通风橱中操作，通过室温（RT）搅拌约3小时，将2 g PLLA溶于100 ml氯仿中，配制2%（w/v）的PLLA氯仿溶液，直至完全溶解。
   2. 将垫圈放置在玻璃培养皿中。
      注意：使用内径为10.5 mm的不锈钢垫圈（略小于腹侧样品直径），以便将垫圈置于腹侧基底上方。也可使用其他材料的垫圈，如聚四氟乙烯（PTFE）或玻璃垫圈。
   3. 在培养皿中加入200 µl PLLA溶液，于室温下缓慢蒸发30分钟。为促进溶剂缓慢蒸发，用带有若干小孔的铝箔封住培养皿。
   4. 将样品在 120 °C 下加热 5 分钟，以蒸发残留溶剂。
   5. 让样品在室温下冷却。
   6. 待样品冷却后（约30分钟），用18.2 MΩ·cm的水覆盖培养皿中的样品，并在室温下孵育8分钟。
      注意：如果样品未完全冷却，可能会吸收18.2 MΩ·cm的水而呈现橡胶状。此外，在18.2 MΩ·cm的水中孵育时间少于8分钟可能导致脱落不完全，而超过8分钟则可能导致样品从清洗仪上脱落。
   7. 用剃须刀片撬动培养皿上的垫圈，将其剥离。
   8. 用镊子去除垫圈边缘的任何瑕疵，并让样品自然晾干。
   9. 将样品储存于真空干燥器（80 mbar）中，直至实验当天，因为聚左旋乳酸（PLLA）可发生水解降解。 

结果

类三明治培养中背侧受体的刺激可引发细胞形态、细胞黏附及细胞内信号通路的变化（例如 黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）^10-12例如，位于三明治样系统中培养的成纤维细胞过表达了α₅ 与二维培养相比，整合素亚基的表达情况如其他三维培养中所观察到的那样^15,16.

细胞命运高度依赖于背侧受体被刺激的时间以及背侧相互作用的特性，这与其他三维系统（如水凝胶）中的情况类似。例如，蛋白质紧密结合的水凝胶通常表现出较小且呈圆形的细胞，其肌动蛋白细胞骨架发育不全，黏着斑呈弥散状。这种情形可通过使用能紧密吸附蛋白质的基底材料，在类似“三明治”结构的培养体系中进行模拟，从而使细胞无法通过力学作用重组该蛋白质层，抑制细胞铺展。类似地，对于细胞能够重塑细胞外基质（ECM）的水凝胶，可通过在“三明治”体系中使用吸附蛋白质较松散的基底材料来模拟¹⁰。

已发现背侧受体的刺激能够调节C2C12细胞的命运。当聚-L-乳酸（PL.......

讨论

如今，三维培养是制药和生物技术行业以及细胞生物学研究（包括癌症和干细胞研究）的重要课题。因此，已开发出多种三维培养系统。然而，不同三维系统之间的差异通常会导致细胞行为不同，从而阻碍对细胞命运的理解。此外，实验操作通常不如二维培养系统那样简便。因此，开发新的培养系统以克服这些缺点中的一部分显得尤为重要。

三明治样培养已被证明能显著影响细胞的关键生命过程，如细胞分化、细胞形态、细胞信号传导和细胞迁移。此外，该培养方式下的细胞与三维培养系统中的细胞具有相似性，这支持了三明治样培养可作为二维与三维培养系统之间桥梁的观点。生理组织中的孔径范围为3至14 µm，这些孔隙对细胞形成空间限制，从而影响细胞迁移等生物学过程。三明治样培养系统在一定程度上重现了这一特征，其背侧与腹侧刺激即模拟了此类空间约束环境。 本身 一种受限的环境，会限制细胞形态，并且无论蛋白包被如何，都必然会影响细胞迁移。

由于能够同时刺激背侧和腹侧受体，类三明治培养是一种研究维度对细胞行为影响的可靠技术。此外，由于该培养系统基于二维基底，因此具有高度的灵活.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乳酸	NatureWorks	4042D	试剂
盖玻片（12 mmØ)	Marienfeld	631-0666	仪器设备
氯仿	Scharlab	CL0200	试剂
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）	Sigma	105228	试剂
1 ml 注射器	Henke Sass Wolf	4010-200V0	仪器设备
注射泵	New Era泵系统	NE1000	仪器设备
高压直流电源	Glassman 高压电源	系列 FC	仪器设备
培养箱	Hucoa-Herlös	3111	仪器设备
层流  通风橱	Telstar	AV30/70	仪器设备
人纤维连接蛋白	Sigma	F2006	试剂
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	试剂
倒置显微镜	Leica Microsystems	DMI 6000	仪器设备
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	试剂
白蛋白	Sigma-Aldrich	A7409	试剂
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	试剂