以下方案描述了用于构建三明治样培养物的步骤，该培养物可作为二维（2D）与三维（3D）细胞环境之间的中间阶段。这种人工构建的系统可应用于显微镜观察、生物力学、生物化学以及细胞生物学检测。
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摘要
摘要
细胞培养传统上是在二维（2D）基质上进行的，细胞通过腹侧受体黏附于生物材料表面。然而 体内大多数细胞完全被细胞外基质（ECM）包围, 导致受体的三维（3D）分布。这可能引发细胞外向内信号通路的差异，从而影响细胞行为。
本文表明，通过在已贴附于二维基底的细胞上覆盖一种新材料薄膜（即类三明治培养），刺激细胞的背侧受体，可引发相较于标准二维培养的重要变化。此外，同时激活细胞的腹侧与背侧受体，可使细胞行为更接近于三维环境中的状态。同时，由于该系统的特性，类三明治培养是一种多功能工具，可用于研究细胞与材料相互作用中的多种参数。 例如，拓扑结构、刚度以及腹侧和背侧不同的蛋白质包被。最后，由于类三明治培养基于二维基底，因此可直接使用为标准二维培养开发的多种分析方法，从而避免了三维系统所需的更复杂操作流程。
引言
传统上，细胞培养是在二维（2D）基底上进行的，尽管大多数 体内 细胞微环境具有三维（3D）特性。这种非自然的二维（2D）环境会引发细胞行为的改变，作为细胞对平坦环境的一种自我适应方式，从而直接影响细胞命运1,2因此，二维细胞培养获得的结果并不总是可重复的 体内这促进了新型相关培养系统的发展，旨在提供更接近生理条件的环境，以深入探究任何与尺寸依赖性相关的生物学机制3,4.
二维培养与三维体内环境之间的一个主要差异在于锚定于细胞外基质（ECM）上的细胞受体分布：在二维基质上，细胞仅从腹侧黏附；而在体内，大多数细胞被ECM完全包围，因此细胞黏附通过三维分布的受体实现。这会激活不同的细胞黏附信号通路，从而调控细胞生长、细胞分化和基因表达等重要过程。在过去几十年中，已建立了多种不同的三维培养系统5-8，但其多样性和复杂性阻碍了这些系统在常规细胞培养操作中的标准化。此外，三维系统通常不易操作，现有的二维基质实验方案难以直接应用于三维培养。另外，文献中很少将三维培养与相应的二维条件或其他三维系统进行比较，这限制了对这些模型中细胞行为的准确理解。
当细胞在二维基质上贴附后，通过覆盖一层新材料薄膜（即夹心式培养），可激活细胞背侧受体，从而引发类似于三维环境中的细胞响应。其原因是背侧和腹侧受体在夹心培养环境中同时被激活，促使细胞贴附并铺展（图1）9,10。因此，与传统的二维培养相比，细胞会发生显著的变化11,12。由此可见，细胞命运在夹心结构形成过程中即已被决定，因为背侧刺激会触发关键细胞通路的改变。因此，夹心式培养构建的时间点对细胞命运具有高度决定性11。
由于该系统的特性，三明治样培养是一种简单且多功能的工具，可同时在细胞的腹侧和背侧研究细胞/材料相互作用中的多种参数，例如化学性质、形貌、刚度以及蛋白质包被等。与其它三维培养系统相比，该方法具有更高的灵活性（图2），因为它能够独立地组合背侧和腹侧多种不同的表面条件。此外，还可研究不同细胞系以及不同的三明治样培养构建时间，进一步拓展了其应用的广泛可能性。
以下详细说明一种三明治样培养的标准方案，该方案使用聚-L-乳酸（PLLA）电纺纤维或薄膜作为背侧基底，玻璃盖玻片作为腹侧基底，纤连蛋白作为蛋白包被层。三明治样培养体系可在细胞接种后立即组装，或在二维培养3小时后组装。但需注意，也可使用其他材料体系和蛋白质；同样，三明治样培养体系可在不同时间点进行组装。
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方案
1. 背部基质的制备
- 通过溶剂浇铸法制备聚左旋乳酸（PLLA）薄膜
- 在通风橱中操作，通过室温（RT）搅拌约3小时，将2 g PLLA溶于100 ml氯仿中，配制2%（w/v）的PLLA氯仿溶液，直至完全溶解。
- 将垫圈放置在玻璃培养皿中。
注意：使用内径为10.5 mm的不锈钢垫圈（略小于腹侧样品直径），以便将垫圈置于腹侧基底上方。也可使用其他材料的垫圈，如聚四氟乙烯（PTFE）或玻璃垫圈。 - 在培养皿中加入200 µl PLLA溶液，于室温下缓慢蒸发30分钟。为促进溶剂缓慢蒸发，用带有若干小孔的铝箔封住培养皿。
- 将样品在 120 °C 下加热 5 分钟，以蒸发残留溶剂。
- 让样品在室温下冷却。
- 待样品冷却后（约30分钟），用18.2 MΩ·cm的水覆盖培养皿中的样品，并在室温下孵育8分钟。
注意：如果样品未完全冷却，可能会吸收18.2 MΩ·cm的水而呈现橡胶状。此外，在18.2 MΩ·cm的水中孵育时间少于8分钟可能导致脱落不完全，而超过8分钟则可能导致样品从清洗仪上脱落。 - 用剃须刀片撬动培养皿上的垫圈，将其剥离。
- 用镊子去除垫圈边缘的任何瑕疵，并让样品自然晾干。
- 将样品储存于真空干燥器（80 mbar）中，直至实验当天，因为聚左旋乳酸（PLLA）可发生水解降解。
- 通过静电纺丝法制备PLLA纤维。
- 在通风橱中操作，将8 g PLLA溶于100 ml六氟异丙醇中，配制成8%（w/v）的PLLA溶液，室温下搅拌至完全溶解（约3小时）。
- 将聚四氟乙烯（PTFE）垫片置于铝箔或滚筒上进行静电纺丝，以分别获得随机取向或取向排列的纤维。
注意：使用内径为10.5 mm（略小于腹侧样品直径）的聚四氟乙烯（PTFE）垫圈，使垫圈置于腹侧基底上方。也可使用其他材料的垫圈，如不锈钢或玻璃垫圈。鼓轮应以160.7 sec的角速度旋转-1 （半径 = 7 cm）以获得取向排列的纤维。转速过慢可能无法诱导纤维取向，而转速过快则会导致纤维断裂。 - 将聚合物溶液装入注射器，并将注射器置于注射泵上。
- 使用30 kV电压、12 cm接收距离和0.9 ml/hr的流速对PLLA溶液进行电纺。
- 在获得良好的纤维密度后（因为细胞需要同时与多根纤维相互作用），停止静电纺丝过程，持续时间为20–30分钟。
- 将样品在 120 °C 下加热 5 分钟，以蒸发残留溶剂。
- 将样品储存于真空干燥器（80 mbar）中，直至实验当天，因为聚左旋乳酸（PLLA）可被水解降解。
2. 三明治培养法
- 当细胞贴附于腹侧二维基质后，组装类三明治结构的培养体系。
- 在细胞培养罩内操作以确保无菌条件，并对所有材料（玻璃盖玻片、背侧基质、镊子）进行灭菌处理 等等。通过紫外线照射30分钟。
- 用纤连蛋白包被腹侧和背侧基质，以引导特定的细胞-蛋白质黏附。为此，将样品在含有钙离子的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中溶解的20 µg/ml纤连蛋白溶液中孵育2+ 和 Mg2+ （每样本 200 µl）孵育 1 小时。
注意：由于制备工艺的原因，背侧基质具有指定的上表面和下表面，因为溶剂浇铸膜和电纺纤维附着在垫圈的一侧。因此，该侧为面向细胞的一侧图3).- 蛋白包被后，用 DPBS 洗涤样品两次，以去除多余的蛋白。随后将样品孵育在 DPBS 中直至使用，防止样品干燥，因为干燥会导致蛋白变性。使用含有 Ca 的 DPBS2+ 和 Mg2+ 因为二价阳离子可调控蛋白质折叠。
- 将种子细胞接种于玻璃盖玻片上13.
注意：由于三明治样培养基于二维基底，细胞接种方式与二维样品上的接种方法类似。例如，C2C12成肌细胞以每平方厘米17,500个细胞的密度接种-1 用于分化实验时，NIH3T3成纤维细胞以每平方厘米7,000个细胞的密度接种-1 用于分离培养以研究细胞形态和黏附性。 - 将样品置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 让细胞在腹侧基质上贴附3小时。
- 将带有腹侧种子的基质放入一个新的12孔板孔中（孔内可容纳垫圈）。
注意：将类三明治结构的培养物转移至新孔中进行组装，是去除接种后贴壁于孔底细胞的一种方法，因为这些贴壁细胞会消耗营养物质，并分泌影响类三明治培养体系内细胞生长的生长因子和代谢废物。此外，在进行细胞提取时，此步骤也是必需的，以确保仅裂解在类三明治结构培养环境中生长的细胞。 - 使用镊子小心地将背侧基质覆盖在细胞上。加入培养基（1 ml）并置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2.
注意：垫圈的重量可防止背侧基质上浮。 - 每周更换培养基两次，如同标准的二维培养。不要移动背侧基质，因为这可能导致细胞损伤。
- 在细胞接种后立即组装三明治样培养结构。
- 在细胞培养罩内操作，以确保无菌条件，并对所有材料（玻璃盖玻片、背侧基质、镊子）进行灭菌处理 等等。通过紫外线照射30分钟。
- 用纤维连接蛋白包被腹侧和背侧基质，以引导特定的细胞-蛋白质黏附。为此，将样品在含有 Ca²⁺ 的 DPBS 中加入浓度为 20 µg/ml 的纤维连接蛋白溶液孵育2+ 和 Mg2+ （每样本 200 µl）孵育 1 小时。
- 蛋白包被后，用DPBS洗涤样品两次，以去除多余的蛋白。随后将样品孵育在DPBS中直至使用，防止样品干燥，以免引起蛋白变性。使用含有Ca的DPBS2+ 和 Mg2+ 因为二价阳离子可调控蛋白质折叠。
- 将细胞悬液接种于12孔板中适配垫圈的孔内玻璃盖玻片上。操作时应使用高浓度的细胞悬液，以避免背侧基质铺设后细胞丢失。
- 使用镊子小心地将背侧基质覆盖在细胞上。加入培养基（1 ml）并置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2.
注意：垫圈的重量可防止背侧基质上浮。 - 每周更换培养基两次，与标准的二维培养相同。
注意：不要移动背侧基质，因为这可能导致细胞损伤。
3. 分析
注意：类三明治培养基于二维基底，因此可采用已为标准二维培养开发的常规分析方法进行分析。例如，由于聚-L-乳酸（PLLA）具有透明性，且细胞被限制在x-y平面内运动，显微观察可如同在二维基底上进行。因此，细胞迁移可按照二维培养的方式进行分析，无需像三维培养那样追踪z轴方向的细胞运动，从而简化了实验操作和图像分析过程。若要通过划痕实验研究伤口愈合实验，请遵循以下方案：
- 在类三明治结构的培养环境中研究细胞迁移（伤口愈合实验）。
- 在细胞培养罩内操作，以确保无菌条件，并对所有材料（玻璃盖玻片、背侧基质、镊子）进行灭菌处理 等等。通过紫外线照射30分钟。
- 用纤连蛋白包被腹侧和背侧基质，以引导特定的细胞-蛋白质黏附。为此，将样品在含有钙离子的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中溶解的20 µg/ml纤连蛋白溶液中孵育2+ 和 Mg2+ 1小时。
- 蛋白包被后，用 DPBS 洗涤样品两次，以去除多余的蛋白。随后将样品孵育在 DPBS 中直至使用，防止样品干燥，因为干燥可能导致蛋白变性。使用含有 Ca 的 DPBS2+ 和 Mg2+ 因为二价阳离子可调节蛋白质折叠。
- 在玻璃盖玻片上以高密度接种细胞13.
- 将样本置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 并让细胞达到汇合状态。
- 使用移液器吸头刮擦细胞单层，以获得被间隙分隔的两个细胞群体。
- 将带有腹侧种子的基质放入一个新的培养孔中，该孔需适合延时成像采集，且能够容纳背侧基质即 12 孔板
- 使用镊子小心地将背侧基质覆盖在细胞上，然后重新加入培养基（12 孔板每孔 1 ml）。
注意：垫圈的重量可防止背侧基质上浮。 - 将样品置于延时显微镜中（设置为37 °C和5% CO₂）2）并每20分钟拍摄一次间隙闭合的图像。
- 使用 ImageJ 的插件 MiToBo 等特定软件分析间隙闭合情况。14
注意：蛋白质和核酸的提取方法与在二维基质上的操作类似。唯一的额外步骤是拆开类似三明治结构的培养体系，将裂解缓冲液直接加入细胞中，以提高提取效率。例如，对于 mRNA 的提取：
- 从类三明治培养物中提取 mRNA
- 根据商用试剂盒的说明书配制所有缓冲液。
- 将类三明治培养物从培养箱中取出。
- 移除样品中的培养基。
- 用含有 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS 洗涤样品一次（1 ml），并吸去全部溶液。
- 借助镊子取下背侧基质，向腹侧基质中加入裂解缓冲液（350 µl）。随后将背侧基质重新覆盖在腹侧基质上，以裂解附着于背侧基质上的细胞。
- 取下背侧基质，以分离裂解液。
- 按照试剂盒说明书操作，提取 mRNA。
注意：蛋白质的免疫检测也可在二维基质上进行。由于夹心样培养可能阻碍抗体和缓冲液的充分扩散，因此应延长孵育时间。此外，也可在开始染色方案前将夹心结构拆开，但在后一种情况下，部分细胞将保留在背侧基质上，而另一部分则保留在腹侧基质上。
- 在类三明治结构的培养物中进行蛋白质免疫检测
- 用 DPBS 清洗样品一次，然后在 4 °C 条件下用含 4% 甲醛的 PBS 固定 20 分钟。
注意：可在固定过程中移除背侧基底，以避免扩散问题。 - 用 DPBS（1 ml）冲洗一次，随后在室温下用含 0.5% Triton X-100 的 DPBS（1 ml）透化处理 5 分钟。
- 在室温下用含 1% 牛血清白蛋白的 DPBS（1 ml）封闭非特异性结合位点，持续 30 分钟。
- 在封闭液中加入一抗（2 µg/ml；1 ml），室温孵育 3 小时。
- 用含 0.5% Tween 20 的 DPBS（1 ml）洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 在封闭液（1 ml）中加入二抗（2 µg/ml）和 1 µg/ml DAPI，室温孵育 2 小时。
- 用含 0.5% Tween 20 的 DPBS（1 ml）洗涤 3 次，每次 10 分钟。
- 用 DPBS 洗涤一次。
注意：若在免疫检测前已移除背侧基底，可将样品用 Vectashield 封片并用指甲油密封。 - 在荧光显微镜下观察，方法同标准二维基底样品。
- 用 DPBS 清洗样品一次，然后在 4 °C 条件下用含 4% 甲醛的 PBS 固定 20 分钟。
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结果
类三明治培养中背侧受体的刺激可引发细胞形态、细胞黏附及细胞内信号通路的变化例如 黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）10-12例如，在类似三明治系统中培养的成纤维细胞过表达了α5 与二维培养相比，整合素亚基的表达情况如其他三维培养中所观察到的那样15,16.
细胞命运高度依赖于背侧受体被刺激的时间以及背侧相互作用的特性，这与其他三维系统（如水凝胶）中的情况类似。例如，蛋白质紧密结合的水凝胶通常表现出较小且呈圆形的细胞，其肌动蛋白细胞骨架发育不全，局灶性黏附呈弥散分布。这种特性可通过使用能紧密吸附蛋白质的基底材料在类似三明治结构的培养体系中进行模拟，使细胞无法对蛋白质层进行力学重排，从而抑制细胞铺展。类似地，细胞能够重塑细胞外基质（ECM）的水凝胶，也可通过在三明治体系中使用对蛋白质吸附较松散的基底材料进行模拟10。
已发现背侧受体的刺激能够调节C2C12细胞的命运。当聚-L-乳酸（PLLA）静...
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讨论
如今，三维培养是制药和生物技术行业以及细胞生物学研究（包括癌症和干细胞研究）的重要课题。因此，已开发出多种三维培养系统。然而，不同三维系统之间的差异通常会导致细胞行为不同，从而阻碍对细胞命运的理解。此外，实验操作通常不如二维培养系统那样简便。因此，开发新的培养系统以克服这些缺点中的一部分显得尤为重要。
三明治样培养已被证明能显著影响细胞的关键生命过程，如细胞分化、细胞形态、细胞信号传导和细胞迁移。此外，该培养方式下的细胞与三维培养系统中的细胞具有相似性，这支持了三明治样培养可作为二维与三维培养系统之间桥梁的观点。生理组织中的孔径范围为3至14 µm，这些孔隙对细胞形成空间限制，从而影响细胞迁移等生物学过程。三明治样培养系统在一定程度上重现了这一特征，其背侧与腹侧刺激即模拟了此类空间约束环境。 本身 一种受限的环境，会限制细胞形态，并且无论蛋白包被如何，都必然会影响细胞迁移。
由于能够同时刺激背侧和腹侧受体，类三明治培养是一种研究维度对细胞行为影响的可靠技术。此外，由于该培养系统基于二维基底，因此具有高度的灵活...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢欧洲研究理事会（ERC）通过HealInSynergy（306990）项目以及FPU项目AP2009-3626提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乳酸 | NatureWorks | 4042D | 试剂 |
| 盖玻片（12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | 仪器设备 |
| 氯仿 | Scharlab | CL0200 | 试剂 |
| 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP） | Sigma | 105228 | 试剂 |
| 1 ml 注射器 | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | 仪器设备 |
| 注射泵 | New Era泵系统 | NE1000 | 仪器设备 |
| 高压直流电源 | Glassman 高压电源 | 系列 FC | 仪器设备 |
| 培养箱 | Hucoa-Herlös | 3111 | 仪器设备 |
| 层流 通风橱 | Telstar | AV30/70 | 仪器设备 |
| 人纤维连接蛋白 | Sigma | F2006 | 试剂 |
| RNeasy Micro 试剂盒 | Qiagen | 74004 | 试剂 |
| 倒置显微镜 | Leica Microsystems | DMI 6000 | 仪器设备 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 试剂 |
| 白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7409 | 试剂 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 试剂 |
参考文献
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