一种激素响应性的人类乳腺上皮三维培养模型

摘要

我们描述了一种适用于研究激素作用的人类乳腺上皮三维培养模型。

摘要

乳腺上皮形态发生过程受激素影响。利用二维培养研究激素对乳腺上皮的作用，仅限于细胞增殖和基因表达终点的分析。然而，在生物体内，乳腺形态发生是在三维环境中进行的。三维培养系统有助于弥合单层细胞培养（二维）与生物体复杂性之间的差距。本文描述了一种适用于研究激素作用的人乳腺上皮三维培养模型。该模型采用 commercially available 的激素响应性人乳腺上皮细胞系 T47D，并以大鼠尾部胶原蛋白 I 型作为基质。该三维培养模型可响应主要的哺乳动物激素：雌二醇、孕激素和催乳素。根据不同的检测终点，经过 1 周或 2 周的激素处理后，即可观察这些激素对上皮形态发生的影响。三维培养物可用于上皮形态发生、细胞增殖及基因表达的分析。

引言

与标准的二维培养不同，三维细胞培养替代模型能够在更接近组织生理环境的条件下研究上皮细胞的行为。乳腺的三维培养已帮助阐明了乳腺发育和肿瘤发生过程中的诸多方面。然而，目前大多数可用的三维培养模型并不适合研究激素作用，因为用于此类研究的人体上皮细胞系缺乏激素受体的表达^6,7,9。

本文介绍一种适用于研究激素作用的人类乳腺上皮三维培养模型¹²。该模型采用 commercially available 的激素响应性人类乳腺上皮细胞系 T47D^3,11,13，该细胞系最初来源于一名54岁女性乳腺浸润性导管癌患者的胸腔积液。我们使用大鼠尾部I型胶原作为基质。该三维培养模型适用于研究三种主要哺乳动物激素（雌二醇、醋酸甲羟孕酮（黄体酮类似物）和催乳素）对人类乳腺上皮细胞的作用。通过形态计量学分析，可对激素诱导的上皮形态随时间的变化进行定量评估¹²。

适当的接种密度可使这些三维培养物维持培养达2周。在此期间，结构发育已足够充分，能够对激素对上皮形态的影响进行可靠的定量评估。凝胶也可在更早的时间点收获，用于细胞增殖和基因表达分析。此外，该模型适用于测试序贯激素处理的效果；例如，第一周用雌二醇处理，第二周更换为其他激素或激素组合。使用该三维培养模型还可研究雌激素类化合物及抗雌激素（如ICI 182,780）的作用¹²。

方案

1. 试剂的准备

1. 将合成孕激素醋酸甲孕酮（R5020）和17-β-雌二醇（E2）溶于乙醇中，配制成10^-3 M的储备液。将催乳素溶于重蒸去离子水中，配制成1 mg/ml的储备液。将抗雌激素ICI 182,780溶于DMSO中，配制成10^-2M的储备液。将这些溶液于-20 °C保存，最长可保存6个月。
2. 炭吸附右旋糖酐（CD）处理的血清及CDFBS培养基：
   1. 将胎牛血清（FBS）置于57 °C水浴中加热灭活30分钟。
      注意：本实验后续步骤中仅可使用酸洗过的玻璃器皿。
   2. 计算所需活性炭的用量。为补偿活性炭所占体积，使用比血清体积多10%的容积，称取5% wt/vol的活化粉末状活性炭。
   3. 用与血清等体积的冷重蒸去离子水洗涤活性炭两次。每次洗涤后以50 × g离心2分钟使活性炭沉淀。两次洗涤之间弃去上清液。向最后一次得到的活性炭沉淀中加入0.5% wt/vol的右旋糖酐T-70。用重蒸去离子水重悬后，以100 × g离心5分钟。吸弃上清液。
   4. 向沉淀中加入适量血清，并将炭吸附右旋糖酐沉淀充分重悬于血清中。于37 ºC缓慢滚动（6 RPM）孵育60分钟。以2,000 × g离心20分钟。若上清液浑浊，需重复离心；但此时血清可能尚未完全澄清，将在后续过滤步骤中进一步澄清。
   5. 先通过0.80微米滤膜过滤，再通过0.45微米滤膜过滤，以去除较大颗粒物质。最后使用0.20微米滤膜进行过滤除菌。将过滤后的CDFBS储存于玻璃管或T-25培养瓶中，于-20 ºC保存。
   6. 含炭吸附右旋糖酐处理胎牛血清的培养基（CDFBS培养基）：取375 ml无酚红DMEM与125 ml DMEM/F-12混合。移除37.5 ml混合液，并加入等体积的炭吸附右旋糖酐处理胎牛血清。加入青霉素至终浓度为10⁶ U/ml，并加入L-谷氨酰胺至终浓度为2 mM。所得培养基组成为：75% DMEM、25% DMEM/F-12、7.5% 炭吸附右旋糖酐处理FBS、2 mM L-谷氨酰胺和10⁶ U/ml青霉素。
3. 配制10X PBS、1N NaOH及重蒸去离子水。根据所需胶原溶液的体积配制足够量的上述溶液。所有溶液均需经滤膜除菌。10X PBS和无菌重蒸去离子水可在4 °C保存最多一个月。1N NaOH溶液不可储存，需现配现用。
4. 根据生产商提供的“大鼠尾I型胶原替代凝胶化操作步骤”（"Alternate Gelation Procedure for Collagen I, Rat tail"）配制终浓度为1 mg/ml的胶原溶液。每块凝胶使用1.5 ml胶原溶液。例如，为制备12块凝胶，需配制18.5 ml胶原溶液（额外0.5 ml以补偿移液过程中的损耗）。胶原溶液应立即使用，或置于冰上保存最多2–3小时。
5. 明矾卡红染液：
   1. 将1 g卡红与2.5 g硫酸铝钾溶于500 ml重蒸水中，边搅拌边煮沸20分钟。密切观察以防暴沸。用额外的重蒸水补足最终体积至500 ml。
   2. 加入一粒硫柳汞晶体以发挥抗菌作用，并用铝箔包裹瓶体以避光。每次使用前需经实验室级滤纸过滤。该卡红溶液可重复使用，最长不超过三个月。室温保存，避光。
6. 胶原酶溶液：将胶原酶以0.125% w/v的浓度溶于DMEM/F12培养基中。该溶液不可储存，需现配现用。

2. T47D 细胞在大鼠尾部 I 型胶原凝胶中的三维培养及激素处理

注意：将无菌移液管和移液器吸头保存在 4 °C。

1. 制备单细胞悬液并进行细胞计数。在T47D细胞培养物达到70%融合度之前进行传代。离心所需数量的细胞悬液。注意每个凝胶中应含有约75,000个T47D细胞。
2. 使用预冷的移液器，将细胞沉淀重悬于适当体积的胶原蛋白溶液中。每个凝胶由1.5 ml胶原蛋白组成。轻柔混匀细胞与胶原蛋白，避免产生气泡。
3. 为防止静电对细胞分布的影响，在打开12孔板后，使用抗静电刷轻轻刷拭其边缘、顶部和底部。为避免在超净台工作面上操作时产生静电积聚，将该12孔板放置在另一个同样经抗静电刷处理过的空白12孔板上。然后，轻柔地将1.5 ml混合液倒入12孔板的每个孔中。
4. 将12孔板放入37 °C培养箱中孵育30分钟。从培养箱中取出后，放回超净台内。
5. 使用p200无菌吸头，以轻柔的环形动作小心将凝胶从孔壁边缘剥离。凝胶也应从孔底脱离。
6. 将激素溶于CDFBS培养基中用于添加至各孔。雌二醇（E2）和R5020的终浓度为10^-10 M，催乳素（prolactin）的终浓度为10^-7 M。对照组使用不含激素但含有与激素储备液等体积DMSO的CDFBS培养基。确保每孔含有1.5 ml培养基。将3D培养物置于37 °C、5% CO₂、100% 湿度的组织培养箱中培养1至2周，每隔2天更换一次培养基。

3. 整体样本的凝胶处理

1. 移除培养基，向每个孔中加入 1.5 ml PBS。
2. 将凝胶转移至载玻片，使用弯头手术刀将凝胶切成两半。取其中一半继续处理，另一半保存用于组织学分析。
3. 将用于整体封片的一半凝胶转移至载玻片，让凝胶干燥 5 分钟，然后将载玻片放入含有 10% 甲醛的考普林罐中。
   注意：所有孵育步骤均应在室温下进行。
4. 在摇床上将凝胶于考普林罐中固定过夜（O/N）。
5. 在摇床上用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 10 分钟。将载玻片转移至 70% 乙醇中，在摇床上孵育 1 小时。再将载玻片转移至胭脂红铝溶液中过夜（O/N）。
6. 次日，在摇床上依次用 70% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇对载玻片进行脱水，每步各 1 小时。随后将载玻片转移至二甲苯中两次，每次 1 小时，并持续置于摇床上。使用以甲苯为基质的封片介质对凝胶进行封片，并使用厚度为 1.5 mm 的盖玻片。
7. 在普通光镜（显微镜或体视显微镜）下观察整体封片样本。如需对形态和管腔进行更详细的分析，可使用共聚焦显微镜，并采用 HeNE 633 nm 激光检测胭脂红染料信号。

4. 用于组织学分析的凝胶处理

1. 将凝胶的剩余一半转移至含有10%福尔马林的20 ml玻璃小瓶中，在摇床上固定过夜（O/N）。
2. 在摇床上用PBS洗涤凝胶两次，每次10分钟。将凝胶放入包埋盒中，用于石蜡包埋。
3. 将凝胶转移至70%乙醇中孵育1小时，随后依次转移至95%乙醇中1小时，更换新鲜95%乙醇再孵育1小时，再转移至100%乙醇中1小时，最后更换新鲜100%乙醇再孵育1小时。此时，凝胶可在室温下于100%乙醇中过夜保存，或转移至二甲苯中孵育1小时，再更换新鲜二甲苯孵育1小时。
4. 将包埋盒置于60 °C的真空孵育器中，浸入石蜡中1小时，再更换新鲜石蜡重复处理两次。
5. 用干净的石蜡填充塑料模具。打开包埋盒，取出凝胶并将其放入含有石蜡的塑料模具中。加满石蜡后，将带有标签的包埋盒盖放在顶部，使组织块冷却固化。
6. 取下塑料模具，使用切片机对组织块进行切片。切取5 µm厚的切片用于苏木精-伊红（H-E）染色和免疫细胞化学分析。

5. 使用胶原酶处理从凝胶中提取细胞

1. 从孔中取出凝胶，转移至含有 PBS 的培养皿中，短暂冲洗凝胶。
2. 将凝胶转移至含有 2 ml 0.125% 胶原酶的 15 ml 离心管中，上下吹打 4–5 次，使凝胶破碎成小块。
3. 在 37 °C 下孵育 25 分钟（直至凝胶完全溶解，细胞呈悬浮状态）。
4. 加入 2 ml 含血清的培养基，通过离心（1,000 × g，5 分钟）收集细胞，弃去上清液，重悬细胞并计数。

结果

图1总结了制备激素敏感型三维培养物的流程。在仅添加E2或E2与其他激素联合添加的条件下，培养2周后可在凝胶的整体装片中观察到上皮结构。当培养基（CDFBS培养基）中未添加任何激素时，仅可见单个细胞或2-3个细胞组成的小细胞团（图2）。该条件作为阴性对照。

三维培养中的细胞会形成在形态、大小和管腔存在方面各不相同的结构。凝胶中结构的分布通常具有异质性。如先前所示，凝胶边缘区域的结构数量通常多于中心区域⁴。由于这种空间异质性，样本间的比较应仅限于各样本中对应的区域。

I型胶原蛋白的来源物种会影响所形成的上皮结构的表型和质量⁵。本实验选用大鼠尾部来源的I型胶原蛋白，因为在牛源I型胶原蛋白中接种细胞会导致形成无序的细胞团（图3）。

利用共聚焦显微镜可对上皮结构进行详细分析（图4）。E2处理导致形成圆形和...

讨论

本文介绍了一种激素敏感的三维培养模型，用于检测激素对乳腺上皮的作用。可在组织形态学、细胞增殖和基因表达水平上评估组织对激素的反应¹²。该技术的一个局限性在于，由于培养物生长在塑料底板中，培养期间的观察仅限于光学显微镜。该三维培养系统可改造为使用玻璃底板，从而实现对培养物的活细胞成像¹。

细胞的培养方式似乎对维持其激素响应表型至关重要。在这些细胞中，定期检测其对雌二醇（E2）的响应性非常重要。我们建议在冻存管解冻后的第4代进行一次E2剂量-反应曲线实验，并在此后每传代10次后常规重复该检测。在二维（2D）培养条件下，与在CDFBS培养基中培养1周的对照组相比，通常10^-10 M的E2浓度可使细胞数量达到对照组的3倍；在三维（3D）培养中则可达2倍¹²。由于酚红已被证实具有雌激素活性²，因此所有涉及激素响应性的实验均应使用不含酚红的培养基。此外，本实验方案中列出的品牌均为目前确认无激素活性的产品。如果在二维或三维培养中观察到雌激素响应发生变化，应评估组织培养所用的塑料材料是否浸...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔组织培养板（Falcon）	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml 聚苯乙烯圆锥形试管	Fisher Scientific	14-959-49D
活性炭	Sigma	C-5510
胭脂红明矾	Sigma	C1022-100G
胶原酶，III型	Worthington	S0C11784
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM510	配备 HeNe 633nm 激光器
葡聚糖 T-70	Abersham/Pharmacia	17-0280-01
DMEM/F-12，含 HEPES，无酚红	Life Technologies	11339-021	用于激素实验的无酚红培养基
DMEM，低糖，含丙酮酸，无谷氨酰胺，无酚红	Life Technologies	11054-020	用于激素实验的无酚红培养基
17-β-雌二醇	EMD Millipore	3301	溶于乙醇
乙醇	Koptec	V1001
胎牛血清	Hyclone	SH30070.03	用于激素实验时，必须经活性炭-葡聚糖处理去除激素
滤器（115 ml）	Nalgene	380-0080, 245-0045, 120-0020	孔径分别为 0.88、0.45、0.20 微米
10% 福尔马林	Fisher Scientific	SF93-20
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030-081
ICI 182,780（氟维司群）	Sigma Aldrich	I4409-25MG	溶于 DMSO
切片机	Leica	RM2155
组织包埋介质	McCormick Scientific	39502004
青霉素	Sigma	7794-10MU	溶于 10 ml 去离子蒸馏水中
Permount 封片剂	Fisher Scientific	SP15-500
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Sigma Aldrich	P3813-10PAK
催乳素	Sigma Aldrich	L4021-50UG	溶于去离子蒸馏水中
醋酸甲羟孕酮	Perkin Elmer	NLP004005MG	溶于乙醇
大鼠尾胶原	Corning	354236	不同批次浓度可能不同，请注意标注
手术刀	Miltex	4311
半封闭式台式组织处理仪	Leica	TP1020
氢氧化钠	Sigma Aldrich	S5881	配制 1N NaOH 储存液
StaticMaster 防静电刷	Amstat	C3500
Stripette 血清移液管	Corning	4101
T-25 培养瓶	Corning	430168
组织包埋盒	Fisher Scientific	15-200-403E
Wheaton 玻璃小瓶，20 ml	Fisher Scientific	03-341-25D
二甲苯	VWR	95057-822