抑制细菌脓黑色素生成的方法及相应氧化应激敏感性增加的测定

摘要

细菌产黑素会导致其对氧化应激的抗性增强以及毒力提高。本文介绍可用于检测细菌黑素生成抑制情况、测定氧化应激敏感性增加程度，以及确定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的技术方法。

摘要

脓黑色素是一种由多种细菌和真菌产生的胞外红褐色色素。该色素来源于酪氨酸分解代谢途径，有助于增强氧化应激抗性。Pseudomonas aeruginosa中脓黑色素的生成可通过2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）以剂量依赖的方式减少。本文描述了一种使用多种浓度NTBC的滴定方法，用于确定能够减少或完全抑制细菌脓黑色素生成的药物浓度。该滴定方法具有易于量化的结果，即随着药物浓度增加，色素生成出现可见的减少。我们还介绍了一种利用微量滴定板测定细菌抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法。该方法资源消耗最少，且易于扩展，可在同一块微量滴定板中对一种细菌菌株同时检测多种抗生素。MIC测定法可进行调整，用于评估非抗生素化合物在特定浓度下对细菌生长的影响。最后，我们描述了一种通过将H₂O₂加入琼脂平板并点样不同稀释度的细菌来检测细菌对氧化应激敏感性的方法。与不含H₂O₂的对照平板相比，含H₂O₂平板上各稀释度细菌的菌落数量和大小减少，表明其对氧化应激敏感。该氧化应激点板法资源消耗少，仅需低浓度H₂O₂，且具有良好的可重复性。此点板法可通过将不同化合物掺入琼脂平板并观察细菌生长情况，进一步用于检测细菌对多种化合物的敏感性。

引言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性细菌，可产生多种色素，其中包括红褐色色素吡咯黑素（pyomelanin），该色素有助于抵抗氧化应激^1-4，并能结合多种化合物，包括氨基糖苷类抗生素^5-7。吡咯黑素的产生源于酪氨酸分解代谢途径中的缺陷^4,8，这种缺陷可由编码均草酸双加氧酶（homogentisate 1,2-dioxygenase, HmgA）的基因发生缺失或突变引起^1,9，也可由该代谢途径中多种酶的失衡所致¹⁰。当HmgA失活后，均草酸（homogentisate）在细胞内积累，并被分泌至胞外氧化形成吡咯黑素¹¹。通过使用除草剂2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）处理，可剂量依赖性地抑制或消除吡咯黑素的生成¹²，该除草剂可抑制酪氨酸分解代谢途径中的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, Hpd）¹³。由于Hpd是均草酸及后续吡咯黑素生成所必需的酶，因此其抑制可阻断该色素的合成¹¹。

我们详细描述了在研究NTBC治疗产绿脓素的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株过程中所采用的三种关键技术。这些技术包括：对....

方案

1. 培养基、抗生素和2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）的制备

1. 制备LB肉汤（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.25% NaCl溶于H₂O中），分装至适当体积。通过高压灭菌法灭菌，室温保存。
2. 在250 ml三角瓶中制备100 ml LB琼脂（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.25% NaCl、1.5%琼脂溶于H₂O中）。高压灭菌后室温保存。倾注平板前确保琼脂完全融化。
   注意：每瓶100 ml LB琼脂可制备4个平板。可根据实验所需平板数量调整LB琼脂的制备量。
3. 制备PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄）¹⁶。通过高压灭菌或过滤灭菌，室温保存。
4. 制备庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的抗生素储备液。
   1. 为含有P. aeruginosa菌株制备适当浓度的抗生素储备液：100 mg/ml庆大霉素、30 mg/ml卡那霉素和10 mg/ml妥布霉素。将抗生素溶于水中，过滤灭菌（0.2 µm），4 °C保存。根据所研究的细菌种类调整抗生素种类及其浓度。
5. 制备NTBC储备液。将10 mg NTBC溶解于4....

结果

NTBC 滴定

通过NTBC滴定实验，确定NTBC是否能够减少铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中吡咯黑素的产生，并鉴定出可消除或减少吡咯黑素产生的NTBC浓度，以便用于后续其他检测。不同重复实验中吡咯黑素的产量可能存在差异，但总体趋势保持一致。NTBC滴定实验也可进行调整，用于测试其他可能影响细菌色素生成的化合物。但该方法仅适用于存在可被肉眼观察或定量测定的表型变化的情况。

用NTBC处理产吡咯黑色素的 P. aeruginosa菌株后，色素产量呈剂量依赖性降低¹²。图2显示，不同P. aeruginosa菌株对NTBC的敏感性存在差异，这通过吡咯黑色素的产量水平得以体现。与实验室菌株hmgA::tn¹⁸（来自华盛顿大学PAO1转座子突变体文库）相比，临床分离株PA1111¹⁷（由Dara Frank提供）需要更高浓度的NTBC才能抑制其吡咯黑色素.......

讨论

本方案中所述的NTBC滴定方法可使使用者确定NTBC是否能够减少或消除细菌中脓黑色素（pyomelanin）的产生，并确定所需NTBC的浓度。NTBC滴定实验中最关键的步骤是确定实验中所用NTBC浓度的范围。P. aeruginosa的不同菌株对NTBC的敏感性存在差异，实验室菌株可能比临床分离株对NTBC更敏感¹²（图2）。因此，有必要针对每一种待测菌株测试一系列NTBC浓度。建议从较低浓度开始，根据需要逐步提高浓度，因为使用者通常希望确定能够抑制特定菌株产生脓黑色素的最低NTBC浓度。本滴定实验描述了一种定性方法用于判断色素生成是否受到抑制。根据研究目的的不同，可能需要定量测定脓黑色素水平，这可通过高效液相色谱法（HPLC）³或电子顺磁共振（EPR）波谱法¹⁹实现，以检测样品中是否存在脓黑色素。黑色素具有特征性的EPR谱图，而不含黑色素的样品则不应产生该谱图²⁰。

可通过使用添加酪氨酸的最低培养基替代LB培养基对滴定实验进行改进。如果使用最.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮（NTBC）	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	也称为尼替西农。  可溶于DMSO。
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % 溶于 H2O。  已稳定化。
庆大霉素	Gold Bio	G-400-100	可溶于 H2O。  过滤除菌。
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906-5	可溶于 H2O。  过滤除菌。
妥布霉素	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	可溶于 H2O。  过滤除菌。