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方法文章

抑制细菌脓黑色素生成的方法及相应氧化应激敏感性增加的测定

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DOI：

10.3791/53105

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2015年8月31日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Wisconsin Milwaukee

本文内容

摘要

细菌产黑素会导致其对氧化应激的抗性增强以及毒力提高。本文介绍可用于检测细菌黑素生成抑制情况、测定氧化应激敏感性增加程度，以及确定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的技术方法。

摘要

脓黑色素是一种由多种细菌和真菌产生的胞外红褐色色素。该色素来源于酪氨酸分解代谢途径，有助于增强氧化应激抗性。Pseudomonas aeruginosa中脓黑色素的生成可通过2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）以剂量依赖的方式减少。本文描述了一种使用多种浓度NTBC的滴定方法，用于确定能够减少或完全抑制细菌脓黑色素生成的药物浓度。该滴定方法具有易于量化的结果，即随着药物浓度增加，色素生成出现可见的减少。我们还介绍了一种利用微量滴定板测定细菌抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法。该方法资源消耗最少，且易于扩展，可在同一块微量滴定板中对一种细菌菌株同时检测多种抗生素。MIC测定法可进行调整，用于评估非抗生素化合物在特定浓度下对细菌生长的影响。最后，我们描述了一种通过将H2O2加入琼脂平板并点样不同稀释度的细菌来检测细菌对氧化应激敏感性的方法。与不含H2O2的对照平板相比，含H2O2平板上各稀释度细菌的菌落数量和大小减少，表明其对氧化应激敏感。该氧化应激点板法资源消耗少，仅需低浓度H2O2，且具有良好的可重复性。此点板法可通过将不同化合物掺入琼脂平板并观察细菌生长情况，进一步用于检测细菌对多种化合物的敏感性。

引言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性细菌，可产生多种色素，其中包括红褐色色素吡咯黑素（pyomelanin），该色素有助于抵抗氧化应激1-4，并能结合多种化合物，包括氨基糖苷类抗生素5-7。吡咯黑素的产生源于酪氨酸分解代谢途径中的缺陷4,8，这种缺陷可由编码均草酸双加氧酶（homogentisate 1,2-dioxygenase, HmgA）的基因发生缺失或突变引起1,9，也可由该代谢途径中多种酶的失衡所致10。当HmgA失活后，均草酸（homogentisate）在细胞内积累，并被分泌至胞外氧化形成吡咯黑素11。通过使用除草剂2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）处理，可剂量依赖性地抑制或消除吡咯黑素的生成12，该除草剂可抑制酪氨酸分解代谢途径中的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, Hpd）13。由于Hpd是均草酸及后续吡咯黑素生成所必需的酶，因此其抑制可阻断该色素的合成11。

我们详细描述了在研究NTBC治疗产绿脓素的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株过程中所采用的三种关键技术。这些技术包括：对NTBC进行滴定，以确定其在实验室和临床来源的产绿脓素菌株中抑制或减少绿脓素产生的浓度；测定细菌经NTBC处理后对抗生素的最小抑菌浓度（MIC）；以及评估NTBC处理后细菌对氧化应激的敏感性变化。

我们开发的滴定实验具有两个目的。首先，该实验可使使用者确定NTBC是否能够消除或减少所研究细菌中吡咯黑素的产生，以及在哪些浓度下产生该效果。这将使使用者能够确定细菌对NTBC的敏感性，因为不同菌株对该化合物的敏感性可能不同，这一点已在P. aeruginosa12中观察到。其次，NTBC滴定实验可帮助使用者确定在后续实验（如抗生素最小抑菌浓度（MIC）测定和氧化应激反应实验）中应使用的NTBC适当浓度，前提是实验目标为消除或减少吡咯黑素的产生，并评估色素减少所带来的影响。

滴定实验的原理在于，经NTBC处理的菌株在色素杆菌素的产生量上表现出可见的差异，且该色素产生量的差异具有剂量依赖性12。此外，该技术还可应用于研究其他可能抑制或增强细菌色素生成的化合物。

抗生素最低抑菌浓度（MIC）用于测定细菌对抗生素的敏感性。测定MIC的方法有多种，包括琼脂稀释平板法和肉汤稀释法14。肉汤稀释可在小型试管中进行，也可在96孔微量滴定板中进行。本文所述的MIC测定微量滴定板方法可使用户以最少的资源测试多种抗生素。该检测方法具有良好的可重复性，并在所测试抗生素种类和菌株数量方面具有灵活性。此外，通过在实验中加入NTBC，用户可确定在产生吡咯黑色素的细菌中，抑制或减少吡咯黑色素的生成是否会影响其对抗生素的敏感性。

细菌对氧化应激的反应可通过多种方法进行检测。常见的方法包括：将细菌暴露于氧化应激条件下一段时间后进行活菌计数1，或采用氧化应激纸片扩散法15。这些方法通常使用较高浓度的氧化应激剂来观察其对细菌的影响，但生物学重复之间的结果往往存在较大变异。活菌计数法通常比其他方法需要使用更多的琼脂平板。本文所述的点种平板法采用低浓度的H2O2，使研究者能够在最少数量的平板上同时检测多个菌株的氧化应激反应。该方法在技术重复和生物学重复之间均具有良好的可重复性。由于脓黑色素（pyomelanin）参与了细菌对氧化应激的耐受，因此在实验中加入NTBC可帮助研究者评估阻断脓黑色素合成对氧化应激耐受能力的影响。

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方案

1. 培养基、抗生素和2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）的制备

  1. 制备LB肉汤（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.25% NaCl溶于H2O中），分装至适当体积。通过高压灭菌法灭菌，室温保存。
  2. 在250 ml三角瓶中制备100 ml LB琼脂（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.25% NaCl、1.5%琼脂溶于H2O中）。高压灭菌后室温保存。倾注平板前确保琼脂完全融化。
    注意：每瓶100 ml LB琼脂可制备4个平板。可根据实验所需平板数量调整LB琼脂的制备量。
  3. 制备PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4）16。通过高压灭菌或过滤灭菌，室温保存。
  4. 制备庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的抗生素储备液。
    1. 为含有P. aeruginosa菌株制备适当浓度的抗生素储备液：100 mg/ml庆大霉素、30 mg/ml卡那霉素和10 mg/ml妥布霉素。将抗生素溶于水中，过滤灭菌（0.2 µm），4 °C保存。根据所研究的细菌种类调整抗生素种类及其浓度。
  5. 制备NTBC储备液。将10 mg NTBC溶解于400 µl DMSO中，得到75.9 mM NTBC溶液。NTBC储备液于-20 °C保存，按需在室温下解冻。
    注意：不同来源的NTBC在溶解度上存在差异。应根据生产商的建议确定合适的溶解溶剂，并相应调整步骤1.5。

2. 细菌菌株的NTBC滴定

  1. 准备待测菌株的过夜培养物。向16 x 150 mm试管（每株一管）中各加入2 ml LB肉汤，并分别接种各菌株的单个孤立菌落。在37 °C条件下，于空气培养箱中使用组织培养旋转仪进行有氧培养过夜。
  2. 次日，配制LB肉汤中的NTBC梯度溶液。由于不同菌株对NTBC的敏感性存在差异，初始浓度范围建议设为0至900 µM NTBC。
    1. 每株菌分别向4至5个试管（16 x 150 mm）中各加入1 ml LB肉汤。
    2. 将NTBC储备液（75.9 mM）以不同浓度加入试管（16 x 150 mm）中。NTBC浓度及其对应加入1 ml LB肉汤中的体积参见表1。
  3. 测定过夜培养物的OD600值。在测定OD600前需对培养物进行洗涤，以去除培养基中残留的类吡咯黑色素。
    1. 取1 ml培养物在微量离心机中以16,000 x g离心2分钟进行洗涤。用移液器吸除上清液及松散沉淀的细胞，将紧实的细胞沉淀重悬于1 ml LB肉汤中。
  4. 以OD600 0.05接种梯度培养试管。计算接种所需洗涤后培养物的体积。
    注意：应使用洗涤后的培养物进行接种，以确保不含类吡咯黑色素。
  5. 将梯度培养试管在37 °C条件下，使用组织培养旋转仪于空气培养箱中进行有氧培养约24小时 。
  6. 拍摄梯度培养试管的照片，比较菌株内及菌株间的色素生成情况，以确定用于MIC及氧化应激实验的NTBC用量。通过OD600测定值评估无细胞培养上清液中的类吡咯黑色素含量，并确定细胞密度。
    注意：可通过计算培养上清液中类吡咯黑色素与细胞的OD600比值，量化经NTBC处理后类吡咯黑色素生成的差异。

3. 96孔板中抗生素最低抑菌浓度（MIC）测定

  1. 在含有和不含 NTBC 的 LB 培养基中分别设置待测菌株的过夜培养物。
    注意：本方案以 300 µM NTBC 作为代表性浓度进行描述。合适的 NTBC 使用浓度由第 2.6 步确定。
    1. 向 2 ml LB 培养基中加入 300 µM NTBC。对于不含 NTBC 的条件，向 2 ml LB 培养基中加入等体积的溶剂（DMSO）。
    2. 使用无菌牙签，将单个分离的细菌菌落接种至试管中。每种菌株分别设置一个含 NTBC 和一个不含 NTBC 的培养物。在 37 °C 条件下，使用组织培养旋转仪在空气培养箱中振荡培养过夜。
  2. 次日，配制用于 MIC 测定的 LB + NTBC 和 LB + DMSO 主溶液。NTBC 的加入浓度为 600 µM，因为当加入接种物后该浓度将被两倍稀释，最终浓度为 300 µM。
    1. 为测试一种抗生素对一种菌株的作用，向 2 ml LB 培养基中加入 600 µM NTBC 并混匀，制成 NTBC 主溶液；向 2 ml LB 培养基中加入等体积的溶剂（DMSO）并混匀，制成不含 NTBC 的主溶液。这些溶液可用于配制抗生素储备液，以及在 96 孔板中建立稀释系列。
      注意：主溶液的配制量略多，以补偿移液误差。可根据所测试抗生素和菌株的数量按需放大或缩小主溶液的体积。
  3. 在 LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中配制抗生素溶液。
    注意：这些溶液中的抗生素浓度应为最终所需浓度的两倍。需配制足够的溶液，以便向 96 孔板中的四个孔各转移 100 µl。
    1. 配制浓度为 64 µg/ml 的庆大霉素 +/- NTBC 储备液。配制方法：将 0.288 µl 庆大霉素储备液（100 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中。
      注意：P. aeruginosa PAO1 的庆大霉素最高浓度为 32 µg/ml。
    2. 配制浓度为 256 µg/ml 的卡那霉素 +/- NTBC 储备液。配制方法：将 3.84 µl 卡那霉素储备液（30 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中。
      注意：P. aeruginosa PAO1 的卡那霉素最高浓度为 128 µg/ml。
    3. 配制浓度为 8 µg/ml 的妥布霉素 +/- NTBC 储备液。配制方法：将 0.36 µl 妥布霉素储备液（10 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中。
      注意：P. aeruginosa PAO1 的妥布霉素最高浓度为 4 µg/ml。
      注意：可根据待测细菌调整抗生素种类及其浓度。
  4. 将每种 2 倍浓度的抗生素溶液各取 100 µl 加入 96 孔板中的四个孔内，置于 A 行。例如，庆大霉素应置于 A1 至 A4，卡那霉素置于 A5 至 A8，妥布霉素置于 A9 至 A12。参见图 1A 中 96 孔板设置示意图。
    注意：可在同一块板上测试多种抗生素，但每块板只能测试一种菌株，以避免其他菌株可能造成的交叉污染。
  5. 向 96 孔板的 B 至 H 行各孔中加入 50 µl 的 LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液。确保一块板使用 LB + NTBC，另一块板使用 LB + DMSO。参见图 1A。
    1. LB + NTBC 用于含 NTBC 的抗生素体系；LB + DMSO 用于含 DMSO 的抗生素体系。
  6. 使用微量移液器进行抗生素的两倍系列稀释：从 A 行取 50 µl 溶液转移至 B 行，混匀后更换吸头，再从 B 行取 50 µl 转移至 C 行，依此类推，直至完成所有行的稀释。稀释至 G 行后，从中取出 50 µl 溶液弃去。H 行作为空白对照，用于检测细菌生长情况。参见图 1B。
    注意：A 至 G 行各孔中现含有 50 µl 在 LB + NTBC 或 LB + DMSO 中浓度为最终所需浓度两倍的抗生素溶液。H 行仅含 LB + NTBC 或 LB + DMSO，不含抗生素。
  7. 测定过夜培养物的 OD600。在测定 OD600 前需对所有培养物进行洗涤，以去除培养基中存在的绿脓菌素。
    1. 取 1 ml 培养物在微量离心机中以 16,000 × g 离心 2 分钟进行洗涤。用微量移液器吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 ml LB 培养基中。
  8. 将过夜培养物用 LB 培养基稀释至 2.75×105 CFU/ml。
    注意：假设 P. aeruginosa 的 1 个 OD600 单位相当于 1×109 CFU/ml。其他细菌的 OD 与 CFU/ml 转换关系可能不同。
  9. 向相应孔中加入 50 µl 稀释后的细菌培养物。
    注意：在 NTBC 中培养的菌液应加入含 NTBC 的孔中，在 DMSO 中培养的菌液应加入含 DMSO 的孔中。参见图 1B。
    1. 每种菌株和抗生素浓度对应三个孔加入细菌，第四个孔加入 50 µl LB 作为空白对照，用于检测细菌污染情况。参见图 1B。
    2. 使用多通道微量移液器接种各孔。加样时确保吸头靠近孔底，以防止污染相邻孔。
      注意：加入细菌培养物后，抗生素和 NTBC 的浓度将被两倍稀释。
  10. 用封口膜覆盖 96 孔板，并在 37 °C 静置培养约 24 小时 。将 96 孔板置于空气培养箱中静置培养。
  11. 观察各孔中细菌的生长情况。MIC（最低抑菌浓度）是指每种菌株的三个重复孔中均未观察到细菌生长的最低抗生素浓度。
    1. 通过肉眼观察或使用酶标仪在 OD600 下读数判断细菌生长情况。

4. 氧化应激反应的斑点平板实验

  1. 在LB培养基中分别接种待测菌株，设置含NTBC与不含NTBC的过夜培养，具体操作如步骤3.1所述。
  2. 第二天，制备含有 H 的 LB 琼脂平板2O2 作为一种氧化应激物。一系列 H2O2 从 0 到 1 mM 的浓度是一个良好的起点。
    1. 融化 LB 琼脂烧瓶。将培养基在室温下冷却至约 50 °C。
    2. 加入 H2O2 直接加入至冷却的培养基中，达到所需浓度。轻轻摇晃锥形瓶以混匀。参见 表2 H 的浓度2O2 浓缩 H 的体积2O2 添加。这些数值基于 100 ml 的 LB 琼脂。
    3. 加入 H 后立即倒平板2O2 并用火焰灼烧表面以去除气泡。每100 ml LB琼脂可制备4块平板。用H标记平板2O2 浓度
    4. 将平板置于生物安全柜中，风扇开启，敞口放置30分钟，以去除平板表面多余水分。
      注意：请在制备当天使用这些培养板。未遵循此操作可能导致数据不一致。
      注意：可使用百草枯等氧化应激剂替代 H2O2 在此检测中，其他氧化应激剂的使用浓度可能与H所用浓度不同2O2.
  3. 洗涤并测定OD600 步骤3.7中所述的过夜培养物
  4. 标准化OD600 将所有过夜培养物调整至被测菌株组中的最低值。 P. aeruginosa 通常具有 OD600 在LB + NTBC或LB + DMSO中过夜培养后，菌液密度约为2.5。
    1. 确定将培养物稀释至最低OD所需的培养液体积600 在总体积为1 ml的条件下。例如，若某培养物的OD600 3 和最低的 OD600 对于该菌株组合，其数值为2.5，进行如下计算：(2.5)(1 ml) = (3)(x)。解得 x = 0.833 ml。将取 0.833 ml 培养液置于微量离心管中。
    2. 计算所需 LB + NTBC（300 µM）或 LB + DMSO 的体积，以将培养液体积补至 1 ml。以步骤 4.4.1 中的示例为例，加入培养液中的 LB + NTBC 或 LB + DMSO 体积为 0.167 ml（总体积 1 ml – 培养液 0.833 ml）。根据所有菌株稀释所需的总体积，配制用于这些稀释的 LB + NTBC 和 LB + DMSO 储存液。
    3. 将培养物与 LB + NTBC 或 LB + DMSO 通过涡旋混合。
  5. 为了在恒定浓度的NTBC或DMSO中维持培养物，用PBS + NTBC或PBS + DMSO对归一化的过夜培养物进行10倍系列稀释。
    1. 配制含NTBC的PBS和含DMSO的PBS储备液。针对一个菌株的一组稀释液，将300 µM NTBC或等体积的DMSO与PBS混合，总体积为720 µl。根据所测试菌株的数量，相应放大或缩小这些储备液的配制量。
    2. 为10个微量离心管贴标签-1 通过 10-7 梯度稀释。向相应的试管中加入90 µl PBS + NTBC或PBS + DMSO。对于在LB + NTBC中培养的菌株，使用PBS + NTBC；对于在LB + DMSO中培养的菌株，使用PBS + DMSO。
    3. 加入10 µl培养物至相应的10-1 稀释管。涡旋混匀，取10 µl的10-1 稀释至10-2 稀释管。重复操作直至完成所有稀释步骤。每次稀释之间更换移液器吸头。
  6. 点样 5 µl 的 10-3 通过 10-7 LB + H 稀释液2O2 每种菌株设两个重复孔。若从最稀释到最不稀释（10⁻⁶）的顺序点样，则可使用同一枪头-7 至 10-3不要在液体干燥前倾斜或翻转平板。
  7. 将培养板孵育 24–48 小时 在37 °C（空气培养箱）中，具体条件取决于菌株。
    注意： P. aeruginosa PAO1 在 LB 培养基上培养 24 小时后将形成大小良好的菌落 孵育。将菌株孵育至其菌落大小与PAO1大致相同。
  8. 使用CCD相机在透射光照明仪上方拍摄平板照片。可选地，调整照片对比度并裁剪至相同尺寸。统计每个点中的菌落数量，以确定对氧化应激敏感性的变化。

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结果

NTBC 滴定

通过NTBC滴定实验，确定NTBC是否能够减少铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中吡咯黑素的产生，并鉴定出可消除或减少吡咯黑素产生的NTBC浓度，以便用于后续其他检测。不同重复实验中吡咯黑素的产量可能存在差异，但总体趋势保持一致。NTBC滴定实验也可进行调整，用于测试其他可能影响细菌色素生成的化合物。但该方法仅适用于存在可被肉眼观察或定量测定的表型变化的情况。

用NTBC处理产吡咯黑色素的 P. aeruginosa菌株后，色素产量呈剂量依赖性降低12。图2显示，不同P. aeruginosa菌株对NTBC的敏感性存在差异，这通过吡咯黑色素的产量水平得以体现。与实验室菌株hmgA::tn18（来自华盛顿大学PAO1转座子突变体文库）相比，临床分离株PA111117（由Dara Frank提供）需要更高浓度的NTBC才能抑制其吡咯黑色素...

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讨论

本方案中所述的NTBC滴定方法可使使用者确定NTBC是否能够减少或消除细菌中脓黑色素（pyomelanin）的产生，并确定所需NTBC的浓度。NTBC滴定实验中最关键的步骤是确定实验中所用NTBC浓度的范围。P. aeruginosa的不同菌株对NTBC的敏感性存在差异，实验室菌株可能比临床分离株对NTBC更敏感12（图2）。因此，有必要针对每一种待测菌株测试一系列NTBC浓度。建议从较低浓度开始，根据需要逐步提高浓度，因为使用者通常希望确定能够抑制特定菌株产生脓黑色素的最低NTBC浓度。本滴定实验描述了一种定性方法用于判断色素生成是否受到抑制。根据研究目的的不同，可能需要定量测定脓黑色素水平，这可通过高效液相色谱法（HPLC）3或电子顺磁共振（EPR）波谱法19实现，以检测样品中是否存在脓黑色素。黑色素具有特征性的EPR谱图，而不含黑色素的样品则不应产生该谱图20。

可通过使用添加酪氨酸的最低培养基替代LB培养基对滴定实验进行改进。如果使用最...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Dara Frank 和 Carrie Harwood 慷慨提供菌株。威斯康星大学密尔沃基分校研究基金会持有专利号 8,354,451；该专利广泛涉及通过给予患者 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂化合物（例如 2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC））来治疗或抑制微生物感染进展的方法。发明人为 Graham Moran 和 Pang He。本研究由美国国立卫生研究院（R00-GM083147）资助。华盛顿大学P. aeruginosa转座子突变体文库由 NIH P30 DK089507 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮（NTBC）Sigma-AldrichSML0269-50mg也称为尼替西农。  可溶于DMSO。
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. % 溶于 H2O。  已稳定化。
庆大霉素Gold BioG-400-100可溶于 H2O。  过滤除菌。
卡那霉素Fisher ScientificBP906-5可溶于 H2O。  过滤除菌。
妥布霉素Sigma-AldrichT4014-100MG可溶于 H2O。  过滤除菌。

参考文献

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抑制细菌脓黑色素生成的方法及相应氧化应激敏感性增加的测定
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