小鼠可卡因诱导的行为敏化与条件性位置偏爱评估

摘要

本方案旨在使研究人员能够开展实验，利用条件性位置偏好和运动行为敏感化检测来研究成瘾的这些方面。

摘要

人们认为，药物带来的奖赏性体验会形成强烈的环境关联，并促使个体反复用药。反复接触滥用药物会使易感个体的脑功能发生持久性改变，而这些持续性的改变很可能维持了成瘾/依赖所特有的适应不良的觅药和用药行为²。在啮齿类动物中，通常采用条件化位置偏爱实验（conditioned place preference assay，CPP）来测量奖赏体验及其与环境的关联，该方法通过检测动物对先前与药物配对环境的偏好程度来实现。另一方面，行为敏化是指随着反复暴露于药物，药物诱导的行为反应逐渐增强的现象。由于敏化行为在停药数月后仍可被检测到（具体取决于初始暴露的剂量和持续时间），因此被视为药物诱导的持久性神经可塑性的可观测指标。研究人员发现，这些实验方法有助于确定介导成瘾某些方面的神经生物学基础，并可用于评估不同干预措施对这些行为的阻断潜力。本文描述了小鼠对可卡因产生条件化位置偏爱及运动行为敏化的基础且有效的实验方案。

引言

利用动物模型研究药物成瘾机制时，必须采用多种方法来应对阻碍治疗成功的各种因素，包括奖赏/强化/动机、戒断与复吸，以及进一步加剧成瘾问题的持续性行为。由于与滥用药物相关的奖赏性体验被认为会驱动后续的药物使用行为，因此聚焦于药物与环境关联的研究可能特别有助于理解参与药物使用和觅药行为的脑机制。其中一种检测方法——条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）——是一种高通量的方法，可用于比较不同组别在奖赏敏感性方面的差异。该任务的传统解释基于经典（即巴甫洛夫式）条件反射原理：将一个条件刺激（CS）与一个非条件刺激（UCS）配对呈现，经过多次配对后，条件刺激本身即可引发与非条件刺激相同的行为反应（但参见^39,40）。理论上，动物会学习将某种内感受状态（奖赏或厌恶）与环境线索相关联，随后通过测定动物对这些环境线索的偏好程度，来评估该内感受状态的相对厌恶或趋近强度。使用位置条件化来测量药物奖赏关联的方法最早可追溯至1957年的一项研究，该研究在Y迷宫中对大鼠使用吗啡进行实验^3,4。在过去的几十年中，该方法的多种变体已被广泛用于研究啮齿类动物对各种刺激产生的位置偏爱或位置厌恶，至今仍在研究滥用药物所诱导的关联效应方面具有重要价值。在药物成瘾研究中，该检测方法已被用于评估多种药物的奖赏特性，以及不同脑系统和蛋白质在药物奖赏中的作用（综述见^5-7,44）。尽管存在更优的评估药物成瘾相关因素的方法，例如药物自给药（drug self-administration），但CPP方法更为简便且易于实施，是测量奖赏功能的一种实用手段。

目前大多数条件性位置偏好与厌恶（CPA）实验方案使用一种装置，允许啮齿类动物通过门洞或较小的连接腔进入两个不同的房间。两个房间之间的区别通常至少基于视觉和触觉线索，包括墙壁颜色和地面质地，有时还包括其他因素，如嗅觉线索。“有偏”设计通常试图逆转动物对某一房间已存在的先天偏好，例如啮齿类动物通常对黑色房间的偏好高于白色房间。“无偏”设计则旨在通过在组内随机分配动物进入任一房间，使原本吸引力相等的两个房间产生偏好。“平衡”设计适用于动物表现出轻微偏好但整体上并未一致倾向于同一房间的情况。该设计的目标是实现以下两点：1）在实验组之间，与（最终）可卡因配对房间相关的测试前偏好评分无显著差异；2）在测试前，对与可卡因配对的房间的偏好极小，无论为正向或负向⁸。对于本文所述的实验装置而言，平衡设计尤为理想，因为该装置在墙壁颜色（黑色优于白色）和地面材质（金属丝网优于条状地面）方面引入了相互矛盾的偏好倾向，导致不同动物对黑色侧和白色侧的轻微偏好大致均等分布。平衡计算的详细方法将在下文进一步说明。

在条件化过程中，动物会被给予药物，然后迅速放入两个环境中的其中一个，并在该环境中停留一段有限的时间。给药方式通常采用腹腔内注射（i.p.），有时也采用皮下注射（s.c.）；此外，已有研究建立了在条件位置偏好装置中进行静脉内自我给药（i.v.）⁹ 和颅内灌注³⁸ 的实验范式。这些药物配对过程需辅以等长的无药物（溶剂）配对过程，后者在另一侧的实验舱内进行，可在与药物配对同一天或不同日期完成。通常情况下，在完成条件化后允许动物自由探索整个装置时，动物会在其曾接受奖赏性药物（i.e.，人类和动物会自愿自我给药的药物）的环境中停留更长时间；而若某药物引起不适（e.g.，氯化锂），动物则会回避曾接受该药物的环境。已有大量研究致力于优化不同滥用药物的条件位置偏好的实验条件（综述见⁷）。小鼠腹腔注射可卡因的剂量通常在1至20 mg/kg之间，其中低于5 mg/kg的剂量常用于检测某一组动物的高敏感性。成年小鼠通常需要进行两次或更多次的药物配对¹⁰，且每次配对的持续时间是实验设计中的重要考量因素。极低剂量的可卡因需要立即且短暂的条件化处理，这可能是因为该方法能够捕捉到药物作用中最具有奖赏效应的时间段。延迟或过长的条件化处理可能导致无偏好反应，甚至引发厌恶反应^11,12。本文介绍了一种在成年小鼠中建立可卡因条件位置偏好的基本方法。

虽然条件性位置偏爱（CPP）实验是评估药物-环境关联的奖赏相关学习与记忆的理想方法，但行为敏化实验相对更易于操作，并且能够评估反复给药过程中逐渐发生的行为变化。行为敏化也被称为反向耐受，其特征是在反复接触某种滥用药物（尤其是精神兴奋剂）后，相关行为反应逐步增强，某些（但并非全部）此类药物之间还存在交叉敏化现象。关于可卡因诱导的运动敏化现象，最早的一项研究特别针对啮齿类动物，发表于1976年¹³。多个实验室已证实，药物停用后很长时间内仍可检测到运动敏化现象，其持续时间取决于最初的给药时长、给药地点和剂量^14-17；目前的实验方案已在小鼠连续七天接受可卡因处理（30 mg/kg）后长达10个月时仍成功检测到敏化效应¹⁸。该实验可采用光电束系统或视频追踪技术，在不同大小和形状的装置中进行，因此许多实验室均可方便地实施。由于运动敏化具有显著性高、操作简便且持续时间长的特点，其评估成为研究药物诱导行为持久性改变基本机制的理想组成部分。

如讨论部分所述，在进行运动致敏试验时，一个重要的考虑因素是给药环境应选择在动物的饲养笼还是测试笼中进行。为了利用在非饲养笼环境中给药所引发的显著致敏效应，本方案采用了后一种方法。然而，已有观察发现，如果动物在接触药物前未能充分适应新环境，则在第1天会出现由新奇环境诱导的天花板效应，这可能部分甚至完全掩盖致敏反应的渐进性特征。这种现象很可能是药物与新奇环境在激活运动行为方面产生协同作用的结果；尽管此类效应背后的机制可能具有研究意义，但本方法的设计旨在降低新奇环境的影响，从而更独立地评估药物本身的作用。尽管预期该方法也可用于评估其他具有运动致敏作用的药物，但目前其有效性主要是在C57BL/6小鼠中使用可卡因而得到验证。

方案

所有实验程序均已获得麦克莱恩医院机构动物护理和使用委员会的批准。注：以下方案描述了一种条件性位置偏爱（CPP）和运动致敏化的实验方法，该方法在许多细节上与其他成功的方案有所不同（例如，光照期与黑暗期测试、连续给药与间歇给药等）。初学者可选择从这些方案开始，或仅将其作为参考，根据当前实验问题从文献中借鉴适当的修改。文中描述了自动化测量方法；然而，每种检测也可采用非自动化手段进行即，视频记录，手动评分

1. 条件性位置偏爱

1. 仪器与房间设置：
   1. 对实验小鼠进行1-3分钟的操作处理 每天一次，测试前至少连续3至5天。
      注意：从未经过处理的小鼠在从实验舱中移出时可能会感到应激，这可能干扰或改变条件化过程。
   2. 获取四个或更多三室条件性位置偏爱装置，最好配备光束系统以实现自动化数据采集¹⁸确保每个腔室包含两个较大且在视觉和触觉上可区分的腔室，这两个腔室通过可升降的门与一个较小的中性腔室相连，以控制进入。每个腔室应配有可开启的盖子，用于小鼠的放入和取出，盖子上应安装小型可单独控制（可调光）的灯（每个腔室一盏）。
      注意：CPP室的设计因研究需求而异，可从商业渠道购买，也可由研究人员自行构建。对于 "平衡的" 设计上，推荐的方案是一个较大的腔室配备白色墙壁和金属丝网地板，另一个腔室配备黑色墙壁和杆状地板。中间腔室应具有灰色墙壁和实心灰色有机玻璃地板。为便于说明，这些腔室将被称为 "白色，" "黑色" 和 "中间" 盖子应为透明的Plexiglass材质。其他隔室构型（单室或双室）也是可行的，详见 elsewhere（见讨论部分）。
   3. 将房间布置成测试时的状态：关闭或调至最暗的顶灯亮度，并关上门。使用照度计测量每个舱室内的光照强度，调节顶盖灯光，使中间舱室的光照略强（15–20 勒克斯），高于黑白舱室（6–10 勒克斯），以减少小鼠在中间舱室停留的倾向。
      注意：如果动物在中间区域的平均停留时间与在黑色或白色区域相当或更长，请进一步增加步骤1.1.3中所述的照明对比度。或者，可改用对动物吸引力较低的中间区域地板材料。例如，约220个直径0.5 cm的孔，均匀分布在6 x 3.5 x ¼英寸的有机玻璃板上），但应避免使该装置产生厌恶刺激。任何修改均需进行预实验，以确保中间区域停留时间的减少并非由于总穿越次数减少所致。
   4. 程序化自动数据采集（"实验步骤," 图1A）或根据以下参数手动采集数据。将试验设置为在任一条件箱中首次发生光束中断时开始。设置 "测试" 每次会话持续20分钟，记录在每个腔室中停留的时间及光束中断次数。设置 "条件化" 将每节实验时长设为30分钟，并（可选）记录每个腔室的光束中断次数。设置所有腔室的灯光在实验期间保持点亮。
   5. 根据实验所需，配制足量的可卡因溶液。将盐酸可卡因溶解于0.9% NaCl（生理盐水）中，最终浓度以每10 g体重注射0.1 ml为基准进行计算。例如，剂量为5 mg/kg时，溶液浓度为0.5 mg/ml。涡旋混合30–45秒，经无菌过滤（0.2 μm注射器滤器），室温保存。
2. 测试：
   注意：条件性位置偏爱（CPP）实验的一般时间安排为前测、条件化和后测。前测与条件化阶段可间隔1-3天；但条件化阶段与后测应在连续两天内进行图2A该时间点在同一次实验的所有组别中应保持一致。
   1. 在动物的光照期进行测试，每天使用相同的装置对每只动物进行实验。
   2. 每次试验日（即，测试和适应日），将小鼠转移至行为学准备室，使其在实验开始前于其饲养笼中静置1-1.5小时，期间避免干扰。选择一个便于在实验开始时迅速、平稳地将小鼠从笼中转移至实验装置的位置。开启所有设备，使与测试相关的任何噪音在实验开始前即已存在例如，设备风扇）存在。
   3. 在每次小鼠实验前后，使用温和的含酒精、乙二醇醚或氨的消毒湿巾彻底清洁每件设备（包括内壁、地板及托盘）（整个实验过程中使用同一种清洁剂）。勿遗漏地板底面。
   4. 每天开始时检查房间灯光是否已调节至适当状态（关闭或调暗）。
   5. 根据具体情况，按以下步骤进行 "测试" 或 "预处理" 天：
      1. 在试验第1天和第6天即，前测和后测），将隔室间的门置于打开位置（图2B).
      2. 加载 "测试" 计算机程序并输入动物编号（图1A），然后发出启动命令（图 1B（如适用）。
      3. 将每只小鼠轻轻放入指定装置的中间腔室，使其面向后壁，并轻柔地关闭盖子。所有腔室均放置小鼠后，离开测试房间并尽量减少噪音。
      4. 将小鼠保留在各装置内，直至所有小鼠的实验均结束图1C导出试验数据。
   6. 在前测前或前测后立即称量动物体重，并利用这些体重数据进行条件化过程中的剂量计算。
   7. 为准备条件化试验，需计算每只小鼠在测试前的基线值 "偏好" 通过从另一侧时间中减去黑白箱中每侧所花费的时间来计算即, "黑色减去白色" & "白减黑"；参见 图3第9列 & 10).
   8. 由于初始偏好较强的实验小鼠会增加平衡难度，因此需为偏好评分设定一个可接受的阈值（例如， <总试验时间的33%）并从计算中排除超过该限值的小鼠。采用宽松的限值（<66% 的总试验时间）以在测试结束后可能发生受试者流失时最大化纳入率例如，由于手术操作偏离目标区域所致。
      注意：超出限制的小鼠仍可进行测试，应尽量保持其测试前偏好平衡。后续可根据需要将这些小鼠从分析中剔除，以平衡测试前得分。若测试前存在极端偏好（即, >800 秒）对某一组产生不成比例的影响时，应考虑改变预处理环境和/或使用其他检测方法。
   9. 为每只小鼠选择黑色或白色隔室作为药物配对隔室，同时在每组内汇总相应的预测试偏好分数，并考虑以下优先顺序：
      注意：需注意在各组之间平衡评分 在……之内 每个队列以及 跨越 任何先前的队列。
      1. 尽可能使各组的总和相等。
      2. 使总和尽可能接近零（即，为部分小鼠选择偏好侧，为其他小鼠选择非偏好侧）。若某一特定组别无法实现接近零的总和，则重新调整所有其他组，使其尽可能接近该限制组所能获得的最佳分数，优先使组总和略偏负值而非正值。
      3. 尽可能在每个组内保持黑色与白色、偏好与非偏好区域在药物配对中的分配一致。
      4. 由于上述目标并非总能实现，可通过在后续队列中进行相反的平衡调整来纠正任何偏差；但应尽量避免产生平均前测偏好差异过大的队列。
   10. 在条件化第2-5天，将隔室间的门置于关闭位置（图2C).
   11. 准备含有可卡因的单支注射器（第2天 & 4) 或生理盐水（第3天 & 5）溶液，具体操作如步骤 1.1.5 所述，并根据预实验时测得的体重进行配制。
       注意：剂量的选择应结合实验预期、引言中提到的相关因素，以及可能存在的下限和上限效应。通常最好使用至少两种不同剂量进行独立的实验。
   12. 加载 "条件化" 计算机程序并输入动物编号（图1A），然后发出启动命令（图1B），如适用。
   13. 抓起每只小鼠并进行腹腔注射，立即将其放入指定装置的相应黑色或白色腔室中，使其面向后壁，然后轻柔地关闭盖子。所有腔室加载完毕后，离开测试房间并尽量减少噪音。
   14. 尽可能在恰好30分钟时将小鼠从其饲养箱中取出（即，当其他小鼠仍在进行条件化时，先将第一批小鼠从其环境中移出。移出动物时应尽可能保持安静，避免引入噪音。
3. 统计分析：
   1. 选择一种分析方法。可以计算在测试后阶段，动物在可卡因配对侧停留的时间减去在生理盐水配对侧停留的时间（可卡因－生理盐水，秒）；或者计算在测试后阶段动物在药物配对 chamber 中停留的时间减去测试前阶段在该 chamber 中停留的时间。
      注意：如果采用第一种方法，还需绘制各组在前测和后测期间在中央区域、生理盐水配对室和药物配对室中平均停留时间的折线图。与前测相比，后测应显示在药物配对侧停留时间增加，而在生理盐水配对侧停留时间减少（参见 图6，底部，以及讨论部分以获取详细解释）。
   2. 根据所比较组别的性质和数量，选择使用t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA），必要时结合事后检验，对上述任一减法得分进行分析。
      注意：可卡因偏好分数往往存在变异性，且可能为负值即，表示对药物配对侧的厌恶）。不应剔除表现出厌恶的小鼠（除非其为统计学离群值），因为该结果属于正常现象，且可能对确定组间差异具有重要意义。根据处理效应的大小，每组通常需要12至30只动物。

2. 运动敏感化

1. 设备与房间设置
   1. 获取一个 4 x 8（X x Y）的光束阵列（外部尺寸 11.5" × 20"）。用黑色有机玻璃制作一个无顶盖的腔室（内径尺寸为22 1/6" x 13¾ 英寸 x 9⅜ 英寸"）以容纳该阵列（图 4A).
   2. 准备测试房间，确保可在测试期间使用红光（天花板或墙壁安装）。
   3. 为每日适应性训练和注射试验分别准备独立的实验程序。
      1. 将适应期实验设定为30-60分钟，注射期实验设定为60-120分钟（图5B）。建议每次时长为60分钟。在同一实验的不同队列间应保持试验时长一致。
      2. 将试验设置为在启动信号发出后，首次光束中断时开始记录（图 5B）。对于注射实验，应设置启动信号，以便各个盒子可以单独启动（而非同时启动），如果可能的话。
      3. 将光束中断设置为按用户定义进行记录 "分段，区间" 最好每次5分钟（图5B).
   4. 根据实验所需，配制足量的可卡因溶液。将盐酸可卡因溶解于0.9% NaCl（生理盐水）中，最终浓度以每10 g体重注射0.1 ml为基准进行计算。例如，剂量为5 mg/kg时，溶液浓度为0.5 mg/ml。涡旋混合30-45秒，经无菌过滤（0.2 μm注射器滤器）后，室温保存。
2. 测试
   注意：测试的初始阶段持续进行10至11个连续天。小鼠每天接受两次试验：适应期（不注射）和注射期。前3至4天给予生理盐水（参见讨论部分了解生理盐水适应的重要性），随后七天使用相同剂量的可卡因例如，15 mg/kg/天）
   1. 每天将小鼠连同其饲养笼一起移至行为学实验前室，适应环境30分钟至1小时。
   2. 准备干净的标准小鼠尺寸透明亚克力饲养笼，铺上极薄层的新鲜垫料（例如，松木屑），以免遮挡光束（如适用）图 4C & D).
   3. 将笼子放置在靠近一端的光束阵列的 Y 轴上，使五条光束沿其长度方向均匀分布。本实验不使用 X 轴光束。图4C & D).
   4. 随机顺序从小鼠饲养笼中取出小鼠，抓住颈背部皮肤并称重。用一只手支撑尾根部，将每只小鼠从小称量舟中取出，直接放入指定的运动活动笼中。每个笼子加盖标准滤膜盖。
   5. 根据当日的体重，按照步骤 2.1.7 所述方法，分别准备含有生理盐水或可卡因溶液的注射器。起始剂量为 15 或 20 mg/kg，可考虑开展第二次实验时使用更高或更低的剂量（相关影响因素参见讨论部分）。
   6. 所有笼子的适应性试验结束后，加载注射程序。
   7. 逐一将小鼠从测试笼中取出，抓住颈背部皮肤并进行腹腔注射（i.p.）。在将小鼠放回测试笼前，迅速启动该笼的开始信号图5C，底部）。
   8. 所有注射实验结束后，将小鼠放回其原有饲养笼并送回饲养室。
   9. 如需，可让小鼠经历一系列戒断期和药物激发，例如以下方案：相同剂量、半剂量、双剂量，随后给予生理盐水；相同剂量激发前间隔七天，每次额外激发前间隔三至七天。无论选择何种激发方式，均应在同一实验的不同组间保持相似的戒断周期。
      注意：如果原始剂量较高（例如，30 mg/kg 或更高剂量时），应跳过双倍剂量或改用较低剂量。生理盐水激发试验可揭示仅由可卡因配对环境引起的条件性运动激活，并在此过程中揭示依赖于可卡因的敏化运动量（参见讨论部分）。
3. 统计学分析
   1. 选择每次试验中用于分析的部分。在注射可卡因后，啮齿类动物的运动活动大多发生在最初的约15-30分钟内。根据所涉及的变量，可考虑对多个时间段的累积运动活动进行分析例如，前15、30、60和/或120分钟）或关注试验的独立阶段。
   2. 根据选定的时间段，分别对适应期和注射实验期间每天每只动物的光束中断次数进行加总，然后计算各组的平均值。将所有天数的均值及平均值的标准误（S.E.M.）以折线图形式绘制。由于不同处理可能影响小鼠在每日实验早期和/或晚期对药物的反应，还需按每5分钟时间段，绘制各组每日实验过程中光束中断次数的平均值曲线图。
      注意：绘制适应期和注射试验期间每日活动量的平均值例如，前15分钟）会人为地造成生理盐水注射抑制了运动的假象，但需注意，活动量很可能在每天适应期结束时已自然下降至此水平。
   3. 分别对连续的生理盐水和药物处理日进行分析，采用重复测量（RM）方差分析（ANOVA），纳入受试者内因素“日/时间”，并根据实验设计适当包含受试者间因素。在可卡因处理第1天（急性暴露）使用t检验或单因素方差分析（One-Way ANOVA）考察组间差异，对挑战性测试采用多变量方差分析（Multivariate ANOVA）。如结果显著，根据需要进行事后检验或单变量方差分析（Univariate ANOVA）。

结果

CPP实验的代表性结果如下所示 图6 使用约九周龄的野生型 C57BL/6N 小鼠。研究设计为 2 × 3 混合因素析因设计，其中组内变量为测试阶段（前测与后测），组间变量为处理方式（生理盐水、可卡因 5 mg/kg 和可卡因 10 mg/kg）。重复测量方差分析显示测试阶段与处理方式之间存在显著交互作用（F_2,20=3.68，p<0.05），该结果被解释为 取而代之 观察到测试的显著主效应（F_1,20=9.86，p<0.01）和处理（F_1,20=4.37，p<0.05）。事后比较显示，前测阶段各组间无显著差异。在后测阶段，5 mg/kg 剂量组与 10 mg/kg 剂量组之间差异不显著；然而，这两个剂量组对可卡因配对箱室的偏好均显著高于仅给予生理盐水的对照组（Tukey 检验：5 mg/kg，p<0.5；10 mg/kg，p<0.01）。此外，Bonferroni 事后检验显示，5（p<0.05）和10（p<0.05) mg/kg 组在测试后对可卡因配对侧的偏好性较测试前显著增...

讨论

本方案展示了条件性位置偏好和运动致敏的实验方法，这两种方法均可被普通实验室用于评估药物诱导的行为可塑性。与大多数行为学测试一样，除了基本方案外，还有一些其他值得注意的考虑因素。首先，这些技术中的每一种都可以被认为具有两个阶段：诱导和表达。对于CPP，"诱导"指行为的发展过程，发生在条件化训练期间；而对于致敏，则是指最初的一段（通常是连续的）药物暴露期。"表达"在CPP中指的是测试后的阶段，而在致敏中，可将其定义为在戒断后给予的药物激发，或简单地作为最后一次连续的药物暴露。

值得考虑的是，将操作限制在其中一个阶段而非另一个阶段，以更清晰地解析其潜在效应。具有时效性限制作用的病毒（例如，HSV）或药物联合给药/预处理（例如，激动剂/拮抗剂）在此类研究中具有重要用途。采用该方法时，可能还需使用压缩的实验方案，以使特定阶段更好地与病毒表达时间相吻合。对于条件性位置偏好（CPP），可采用为期两天的条件化方法，正如我们此前所描述的那样。³⁷尤其对于运动致敏而言，将诱导期与表达期之间的戒断时间变化与这些方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸可卡因 USP	Mallinckrodt Pharmaceuticals	0406-1520	出于研究目的购买和使用（二类管制物质）需遵守州和联邦法律的相关规定并取得相应许可。
条件性位置偏好  带手动门和照明装置的小鼠三室实验箱	Med-Associates 公司	MED-CPP-MS && MED-CPP-3013	我们的实验室曾使用过这些盒子；然而，市面上还有许多其他可选的盒子 &且可接受。
PAS-笼内活动监测光束阵列	San Diego Instruments	2325-0223 & 7500-0221	我们的实验室将这些阵列置于文中所述的定制腔室内部。  有其他可选方案。
一次性消毒湿巾 Sani-Cloth	PDI	13872