利用等离激元纳米粒子实现可见光诱导的氧化石墨烯还原

摘要

介绍了一种利用可见光和等离子体纳米粒子制备还原氧化石墨烯的简单方案。

摘要

本研究展示了一种简单、无需化学试剂、快速且节能的方法，可在室温下通过可见光照射结合等离激元纳米粒子制备还原氧化石墨烯（r-GO）溶液。利用等离激元纳米粒子可提高氧化石墨烯（GO）的还原效率。在室温下仅需用氙灯照射30分钟 ，即可通过简单的离心步骤完全去除金纳米粒子，获得r-GO溶液。与其他纳米结构相比，球形金纳米粒子（AuNPs）是制备r-GO最合适的等离激元纳米结构。采用可见光与AuNPs制备的还原氧化石墨烯在质量上与化学还原法所得的还原氧化石墨烯相当，这一结论得到了紫外-可见光谱（UV-Vis）、拉曼光谱、粉末X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）等多种分析技术的支持。利用可见光制备的还原氧化石墨烯对修饰在单链DNA（ssDNA）上的荧光分子表现出优异的猝灭性能，并在目标DNA检测中展现出良好的荧光恢复能力。使用回收的AuNPs所制备的r-GO，其质量与化学还原法所得r-GO相同。可见光结合等离激元纳米粒子的使用为r-GO的合成提供了一种良好的替代方法。

引言

最早开发的基于胶带的方法¹和化学气相沉积法²是制备本征态石墨烯的优良方法，但这些方法在大面积表面实现石墨烯的大规模合成或成层生长一直被视为主要局限性³。对于大规模还原氧化石墨烯（r-GO）的合成，一种可能的解决方案是湿化学合成法，该方法首先需要使用强氧化剂进行反应，并通过超声处理等大量物理手段制备氧化石墨烯（GO）片层，最后必须还原GO中的含氧官能团（如羟基、环氧基和羰基），以恢复其原有的物理性质⁴。通常，GO的还原可通过使用肼或其衍生物的化学还原法⁵，或在惰性或还原性气氛中进行热处理（550–1,100 °C）来实现⁶。

这些过程需要使用有毒化学品，且反应时间长、温度高，从而增加了还原氧化石墨烯（r-GO）合成的总能耗。⁷ 此外，已有报道采用光辐照还原方法制备r-GO，例如紫外光诱导还原⁸、利用脉冲氙灯闪光的光热过程⁹、脉冲激光辅助还原¹⁰以及使用相机闪光灯进行光热加热的方法¹¹。通常情况下，光诱导方法的转化效率较低，因此需要采用紫外光或脉冲激光辐照，以提供高光子能量。可见光的光子能量较低，限制了其在r-GO合成中的应用，因而未受到广泛关注。等离激元纳米粒子在可见光和/或近红外区域具有优异的光吸收特性，可显著改善当前可见光用于r-GO合成时存在的不足。^12,13 温和的反应条件、较短的反应时间以及对有毒化学品的使用较少，使得可见光诱导的等离激元辅助光催化还原氧化石墨烯成为一种有前景的替代方法。

在本方法中，我们描述了一种利用等离激元纳米粒子和可见光高效、简便地合成还原氧化石墨烯（r-GO）的方法。反应进程显著依赖于等离激元纳米粒子的结构，例如球形金纳米粒子（AuNPs）、金纳米棒（AuNRs）和金纳米星（AuNSs）。使用AuNPs可实现对氧化石墨烯（GO）最高效的还原，且这些纳米粒子易于去除并可回收，用于重复使用（图1）。利用可见光和AuNPs合成的r-GO，其质量几乎与通过已知化学方法（肼还原法）制备的r-GO相当，这一结论通过多种分析测试以及基于荧光猝灭/恢复的DNA检测方法得到验证。

方案

1. 前体的制备

1. 氧化石墨烯（GO）的制备：
   1. 采用改进的Hummer法¹⁴制备GO
      1. 在室温下，将3.0 g石墨片加入浓H₂SO₄/H₃PO₄混合液（360:40 ml）中。（注意：使用强酸H₂SO₄和H₃PO₄时需特别小心。）
      2. 在冰浴中边搅拌边缓慢加入KMnO₄（18.0 g），并冷却以保持反应混合物温度低于< 35 °C。（随着反应时间延长，溶液会变得粘稠，需采用适当方法确保有效搅拌。）（注意：由于反应放热，加入KMnO₄时需特别小心。）
      3. 在50 °C下搅拌12小时，然后冷却至室温，并将反应混合物倒入含30% H₂O₂（3 ml）的400 ml冰中。
      4. 使用金属美国标准试验筛（300 µm）过滤反应混合物以去除未反应的石墨，然后将滤液离心（4,722 × g，2小时）以去除上清液。
      5. 依次用200 ml水、200 ml 30% HCl、200 ml乙醇及蒸馏水重复离心步骤，直至溶液pH达到5.0–6.0。
      6. 将最终溶液冻干，得到蓬松的GO粉末。
      7. 为制备纳米级GO溶液，将20 mg GO粉末溶于40 ml三蒸水（> 18 MΩ）中，随后进行长时间超声剥离（35%振幅，500 W，2小时），直至粒径分布全部低于150 nm，然后离心两次（10,625 × g，15分钟）以去除沉淀物（未剥离的大片GO）。  
2. 等离激元纳米粒子的制备
   1. AuNPs的制备
      1. 采用粒径为30 nm、O.D. = 1.0的柠檬酸钠稳定的球形金纳米粒子（AuNPs）用于r-GO的还原。
   2. AuNRs的制备¹⁵
      1. 通过将新配制的0.6 ml冰浴冷却的NaBH₄溶液（0.01 M）加入由0.25 ml HAuCl₄（0.01 M）和9.75 ml十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，0.1 M）组成的水相混合溶液中，制备种子溶液。
      2. 剧烈搅拌所得混合物0.5分钟，然后在28 °C下静置3小时。
      3. 通过混合475 ml CTAB（0.1 M）、3 ml AgNO₃（0.01 M）和20 ml HAuCl₄（0.01 M）制备生长溶液。
      4. 然后向该混合物中加入新配制的3.2 ml抗坏血酸（0.01 M）溶液，随后加入0.8 ml盐酸（1.0 M）水溶液。
      5. 最后一步，在28 °C下将3.2 ml种子溶液加入生长溶液中，并快速倒置混合数秒。最终将所得混合物静置至少6小时。
      6. 采用紫外-可见光谱法分析所制备的AuNRs的吸收峰（λ_max），并进行透射电子显微镜（TEM）分析（通常测得λ_max和长径比分别为730 nm和3.5）。
   3. AuNSs的制备¹⁶
      1. 配制浓度为100 mM的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）水溶液，并通过加入1.0 M NaOH溶液将pH在25 °C下调节至7.4。
      2. 将20 ml磷酸盐缓冲液（100 mM）与30 ml 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（100 mM）混合。
      3. 然后向上述混合物中加入500 µl三水合氯金酸（20 mM），并在水浴中于28.5 °C下保持30分钟。30分钟后可观察到溶液颜色由浅黄色变为蓝绿色。
      4. 在8,928 × g下离心30分钟，并将沉淀物重新分散于蒸馏水中。
      5. 最后，采用紫外-可见光谱法测定所制备AuNSs的吸收峰（λ_max），并通过TEM分析确认粒径，结果分别为740 nm和30 nm。  

2. 使用可见光和金纳米颗粒制备还原氧化石墨烯

1. 在配备循环水夹套的耐热玻璃反应器中，加入1 ml等离子体纳米颗粒（AuNPs在520 nm处吸光度为1.0，AuNRs在750 nm处吸光度为1.0，AuNSs在730 nm处吸光度为1.0）、100 µl氨水（28%，w/v%）和10 ml氧化石墨烯溶液（在230 nm处光密度为1.0，浓度为0.125 mg ml^-1）。
2. 将混合物用氙灯（功率密度为1.56 W cm^-2）照射30分钟，同时通过循环水夹套保持温度在25 °C；随后在10,625 ×g离心15分钟，以去除金纳米颗粒。
3. 取上清液（含有制备好的还原氧化石墨烯r-GO），使用紫外-可见分光光度计在200–900 nm范围内进行分析（r-GO应在270 nm处显示出特征吸收峰）。

3. 使用 r-GO 溶液检测靶 DNA¹⁷

1. 用于荧光淬灭，加入 20 µl 的 10^-6 将 25 µl 的氧化石墨烯（GO，0.125 mg ml）或还原型氧化石墨烯（r-GO）溶液中加入 Cy3 标记的单链 DNA（5'-ATC CTT ATC AAT ATT TAA CAA TAA TCC CTC-Cy3-3'）^-1）或 r-GO（0.125 mg/ml）^-1) 加入1,955 µl的0.3 M PBS溶液（10 mM磷酸盐缓冲液，0.3 M NaCl）中，室温孵育10分钟。
2. 使用荧光分光光度计测量这些样品的荧光强度（λ_ex= 529 nm
3. 用于靶标检测，将200 µl靶标寡核苷酸溶液（5'- GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT- 3'）以三种不同浓度加入^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M）加入到含有 20 µl 10^-6 M ssDNA-Cy3，25 µl GO 或 r-GO（0.125 mg ml^-1，并为荧光恢复实验加入1,755 µl的0.3 M PBS。¹⁷
   注意事项：
   光源 & 反应器
   可见光（400–780 nm）光源。使用氙灯（1.56 W/cm²）通过含有氧化石墨烯（GO）溶液的Pyrex玻璃反应器（窗口直径 = 1.1 cm）进行可见光照射² 功率）。施加到反应器的光子能量计算为 4.8 × 10²¹ 每分钟光子数（photons per min）图2A-2C).
   近红外（NIR）激光器。功率密度为0.36 W/cm²的近红外激光器（窗口直径 = 13.2 cm）²，且以808 nm为工作波长的近红外光源已被用于氧化石墨烯（GO）的还原反应（图2E）。光子能量计算为 2.43 × 10²¹ 每分钟光子数
   反应器：使用带有循环水夹套的Pyrex玻璃反应器（窗口直径 = 1.1 cm；反应体积 = 10 ml）进行可见光和近红外光照射下的氧化石墨烯还原反应图 2F).

结果

图1展示了基于可见光和等离激元纳米粒子的还原氧化石墨烯（r-GO）反应的整体方案。图2展示了反应的仪器装置。反应完成后，需要进行离心步骤以去除所使用的光催化剂（AuNSs、AuNRs 或 AuNPs），如图3A所示。高分辨透射电子显微镜（HRTEM）分析显示上清液（r-GO）中纳米粒子已完全去除（图3B），这一点也可通过紫外-可见光谱分析进一步确认，如图3C所示：在离心后，r-GO与纳米粒子混合溶液中约500–800 nm处的吸收峰消失，表明r-GO产物中等离激元纳米粒子已被完全去除。r-GO的结构变化通过X射线衍射（XRD）技术进行了分析。GO在10.2°处特征峰的消失明确表明r-GO的形成，如图4A所示。通过拉曼分析测定了化学法或光诱导法（无或有纳米粒子，即AuNRs、AuNPs和AuNSs）制备的GO和r-GO的D带与G带强度比（I_D/I_G），结果如图4B

讨论

可见光照射氧化石墨烯溶液30分钟，同时加入金纳米颗粒（AuNPs，AuNSs） & AuNRs）呈现出从浅黄褐色到黑色的快速颜色变化（图1）。为了以高产率获得高纯度的还原氧化石墨烯（r-GO）产品，需遵循两个关键因素。其一是使用金纳米粒子（AuNPs）作为高效的等离激元催化剂，因为与其他结构相比，AuNPs 能强烈吸收可见光。即，AuNRs，AuNSs）。另一种方法是使用纳米级氧化石墨烯（GO）溶液，以获得无纳米颗粒的高纯度还原氧化石墨烯（r-GO）产物。所用的等离激元纳米粒子作为光催化剂必须完全去除，这可通过在10,625 × g转速下简单离心15分钟轻松实现。但在执行此操作时，r-GO的大片层尺寸（> 500 nm）可通过与金纳米颗粒共沉淀而造成产物（r-GO）大量损失。因此，应使用纳米级氧化石墨烯溶液（平均片层尺寸 < 150–200 nm）非常重要，因为在此常规离心条件下，无法将纳米级的还原氧化石墨烯（r-GO）沉淀下来即，10,625 × g 离心15分钟。

因此，使用金...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cy3修饰的ssDNA	IDT(美国爱荷华州)		由IDT进行HPLC纯化
金纳米颗粒（30 nm）	Ted Pella, Inc（美国加利福尼亚州雷丁）	15706-20	胶体溶液
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（99.5%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7365-45-9
三氯化金水合物（99.999%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	27988-77-8	强吸湿性
硼氢化钠（99.99%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	16940-66-2
十六烷基三甲基溴化铵（≥99%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	57-09-0
L-抗坏血酸（≥99.0%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	50-81-7
氯化钠（99.5%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7647-14-5
硝酸银 （≥99.0%）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7761-88-8
石墨	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7782-42-5
硫酸	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7664-93-9
磷酸	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7664-38-2
高锰酸钾	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	7722-64-7
过氧化氢	JUNSEI	23150-0350
氢氧化铵	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	1336-21-6
Xe灯	Cermax，美国沃尔瑟姆
近红外激光器	IV类，Sanctity Laser，中国上海		6 W（输出功率）
紫外-可见分光光度计	S-3100，SINCO，韩国
透射电子显微镜	H-7650，日立，日本
荧光分光光度计	Jasco FP-6500，日本东京
X射线光电子能谱仪	AXIS–NOVA，KRATOS公司，英国