中枢神经系统中的星形胶质细胞在受到有害刺激时会改变其功能和结构特性。本报告介绍了一种在疾病状态或治疗干预后评估星形胶质细胞三维形态的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
作为大脑中的胶质细胞，星形胶质细胞在中枢神经系统中具有多种功能作用。在有害刺激存在的情况下，星形胶质细胞会改变其功能和结构特性，这种状态称为反应性星形胶质细胞增生。本文介绍了一种评估星形胶质细胞形态学特性的实验方案。该方案包括对12种不同参数的定量分析 即 星形胶质细胞所覆盖组织的表面积和体积（星形胶质细胞支配区）、包含分支、胞体和细胞核在内的完整星形胶质细胞结构、分支的总长度和数量、用于星形胶质细胞检测的抗体荧光免疫反应强度，以及星形胶质细胞密度（数量/1,000 µm）2）。为此，采集了三维（3D）共聚焦显微镜图像，并使用Volocity 6.3等3D图像分析软件进行测量。暴露于淀粉样蛋白β的大鼠脑组织1-40 （Aβ1-40）有或无治疗药物 采用干预方法来展示该技术。本方案也可用于对其他来源的细胞进行三维形态计量分析。 体内 或 在 体外 条件。
引言
在健康的中枢神经系统（CNS）中，星形胶质细胞在调节血流、能量代谢、突触功能与可塑性以及细胞外离子和神经递质稳态方面发挥着重要作用1-3。此外，星形胶质细胞可通过反应性星形胶质增生对创伤、感染、缺血或神经退行性病变等不同有害刺激和异常状态作出响应，反应性星形胶质增生的特征是星形胶质细胞出现肥大、增殖以及功能重塑4,5。
反应性星形胶质细胞增生可调控组织中的炎症反应和修复过程，因此可能影响治疗干预的临床效果。近年来，星形胶质细胞作为多种影响中枢神经系统的疾病潜在治疗靶点，已受到神经科学家的广泛关注。
星形胶质细胞通常具有星状形态，其分支清晰，并向胞体周围延伸6。在脑部疾病状态下，星形胶质细胞的分支会变得扭曲，并出现肿胀的末端7，例如在存在β-淀粉样蛋白（Aβ）的情况下。
本文介绍了一种用于分析共聚焦显微镜获取的星形胶质细胞三维图像的实验方案。对每个星形胶质细胞测量了12种不同的定量参数：星形胶质细胞支配区域（星形胶质细胞所覆盖的组织区域）、完整细胞（包括突起）、细胞体和细胞核的表面积和体积；突起的总长度和数量；用于星形胶质细胞检测的抗体荧光强度；以及星形胶质细胞密度（每1,000 µm²内的细胞数量）2）。为此，我们采用了经海马内注射 Aβ 的大鼠脑组织切片1-40 使用或不使用染料木素（genistein）作为抗炎物质处理。所述方案可用于不同类型细胞的形态计量分析 体外 或 体内 在不同条件下
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方案
本研究严格遵循伊朗医科大学（伊朗德黑兰）伦理委员会批准的《实验动物护理与使用指南》（NIH）中规定的政策进行。
1. 动物、手术与标本制备
注意：准备脑组织以进行三维共聚焦显微镜分析。
- 将动物随机分为两组：Aβ1-40注射组（n = 8）和Aβ1-40注射联合染料木黄酮治疗组（n = 8）；在手术前1小时通过灌胃给予染料木黄酮（10 mg/kg，溶于聚氧乙烯化蓖麻油等溶剂中）。
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾后无回缩反射来确认麻醉效果。手术期间使用眼膏防止角膜干燥。
- 将动物固定于立体定位仪中，剃除头部毛发。切口前用碘溶液清洁头皮，并在手术过程中保持操作区域无菌，以降低感染风险。根据大鼠脑图谱8，在海马区立体定位注射Aβ1-40 （4 µl），注射位点为前囟后方−3.5 mm、中线左右± 2 mm、硬膜下−2.8 mm。有关立体定位方法，请参见先前的出版物9。
- 术后密切观察和护理动物，直至其完全清醒，以确保动物舒适。恢复期间保持动物体温，未完全恢复前不得将其放回与其他动物共用的笼具中。术后需注意观察动物是否有感染迹象。
- 术后三周，使用氯胺酮（150 mg/kg）对动物进行深度麻醉。通过心脏灌流进行经心灌注固定，先灌注0.9%生理盐水，随后灌注0.1 M PBS（pH = 7.4）中的4%多聚甲醛，然后按文献10所述方法取出并固定脑组织。
- 将脑组织在4%多聚甲醛中于4 ˚C下后固定2–3天。
- 使用组织包埋设备将组织包埋于石蜡块中，注意避免包埋盒填充不足或过满，以免影响正确对齐或切片。注意组织在石蜡块中的方向。
注：例如，大鼠海马靠近大脑半球的后部，因此应使切片从脑的后部开始。可参考Paxinos图谱8作为指导，以准确定位目标解剖结构。 - 将切片机放置在远离气流或门口的位置，因为空气流动会使切片操作变得困难。
- 使用厚度≥20 µm的切片，因为该厚度对于生成完整的星形胶质细胞Z-Stack图像是必要的。不要使用最初的几张切片，因其可能因热膨胀而导致厚度不均。
- 将切片置于温水（5 ± 2 ˚C，低于石蜡熔点）表面，仅停留足够时间使其展平。
注：切片过度展开可能破坏结构形态。使用细小画笔小心转移切片。每张载玻片收集2–3张切片。 - 将载玻片垂直置于染色架中，于37 ˚C干燥数小时或过夜。
2. 免疫组织化学
- 用二甲苯脱蜡，2次，每次10分钟，然后通过梯度酒精（99.8%、95%和70%，各10分钟）水化，并转入PBS。
- 在含有0.25%牛血清白蛋白（BSA）、0.25% Triton X-100和3.5%正常血清的PBS中，按1:1,500稀释抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体，4 °C过夜孵育 ˚C）。
- 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
- 孵育碱性磷酸酶偶联的二抗1小时（1:100，21 ˚C，用PBS稀释。
- 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
注意：在使用二抗后，必须充分洗涤切片，以尽量减少背景染色。 - 在避光条件下将切片与液态永久红发色剂孵育（15–20 分钟）。注意：该溶液应在使用前30分钟内配制。
- 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
- 最后，在盖片前用4-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1:500，用PBS稀释）对细胞核进行染色。染色后将载玻片置于冰箱中保存24–48小时，再进行显微镜观察。
3. 共聚焦显微镜
注意：进行定量评估时（见下文），应选择具有清晰可见的经 DAPI 染色细胞核且分支重叠最少的星形胶质细胞，以降低误差风险。生成 Z-层扫描图像耗时较长，请耐心操作，并在处理过程中不要中断。使用直立式共聚焦激光扫描显微镜对星形胶质细胞进行三维成像。
- 将载玻片置于显微镜载物台上，选择63倍物镜。
- 打开成像软件，点击“启动系统”。点击“定位”选项卡，进入“分配”界面，选择GFP以调节合适的光源。
- 打开快门以反射光线。在快门外侧右侧找到反射镜转盘，并选择星形胶质细胞应反射的颜色（绿色、红色或紫色）；此处使用红色（FSet20 wf）。
注意：切勿忘记直接在显微镜的目镜中对图像进行调焦。 - 为找到最佳焦距，点击“全部关闭”，将显微镜针置于屏幕模式，然后点击“采集”选项卡。
- 在采集选项卡下点击智能设置，将打开一个窗口。选择合适的荧光染料（即 从列表中移除当前项目中的 DAPI 和 Alexa Fluor 555。颜色将自动选定。
- 单击“最佳信号”，然后单击“应用”，再单击“设置曝光”；计算机将自动设置曝光参数。
- 为优化图像，请进入通道窗口。取消选中Track2，选中Track1，然后点击Live。如有需要，调整图像焦距。
- 在通道窗口中调整以下参数；点击 1AU，以自动优化针孔。此步骤非常关键，否则共聚焦图像将无法达到最佳效果。调节增益以获得最佳强度（为降低额外噪声，建议将该设置保持在800以下）。最后，将数字增益设置在2至3之间。
- 取消选中 Track1，点击 Track2，并对 Track2 重复步骤 3.8。 然后停止实时成像。
- 进入采集模式窗口。通过优化帧尺寸和平均次数来改善图像质量。要更改帧尺寸，请进入X*Y并选择1,024 × 1,024。选择较慢的扫描速度以获得更佳的图像。
- 转到平均设置，选择平均次数 ≥4。该平均值表示用于生成所获取图像的扫描次数。然后点击“抓取”按钮，保存捕获的二维图像。
- 对于三维成像，在智能设置中选择Z-栈项目，以打开Z-栈窗口。
- 设置Z轴层扫的第一个和最后一个位置， 即 细胞的深度。首先点击“Live”，然后使用显微镜的聚焦驱动装置，将焦平面聚焦至组织中星形胶质细胞的最上层位置，即Z-Stack扫描的起始位置，点击“Set First”。接着向下聚焦至组织中星形胶质细胞的最下层位置，即Z-Stack扫描的终止位置，点击“Set Last”。然后停止“Live”模式。
- 选择时间间隔；1.01 µ在本研究中使用了 m；可通过单击“Optimal”来选择间隔，以设置切片数量。
- 点击“开始实验”。扫描完成后保存图像。该图像将用于测量以下参数：星形胶质细胞区域的表面积和体积，包括分支、细胞体和细胞核在内的完整星形胶质细胞。
- 使用10倍或20倍物镜，按照步骤3.6–3.11所述获取二维图像。该图像可用于测量抗体荧光免疫反应强度以及星形胶质细胞密度（数量/1,000 µm2).
4. 星形胶质细胞密度和 GFAP+ 荧光强度
- 打开20倍二维图像。点击图像窗口左侧的Histo（直方图）。
- 为计算星形胶质细胞密度，在20倍物镜下选择三个连续的视野。计数视野中具有清晰胞体且分支重叠最少的星形胶质细胞数量。
- 为定量荧光强度，在图像窗口底部选择合适的工具（矩形或圆形），并选定测量区域。注意图像下方会自动显示平均值和标准差。在本研究中，选用纹状体与齿状回内侧 blade 之间面积为0.7 mm2的矩形区域。
5. 星形胶质细胞分支
- 为了定量分析分支长度和总分支数，使用图像分析软件中的3D图像（以20倍镜获取）。手动沿所选星形胶质细胞各分支的长度绘制线条。然后选择专用于测量线段长度的测量工具。为定量分支数量，选择计数工具以统计已标记项目的数量。
6. 体积与表面积
注意：在三维图像分析软件中手动标记结构需要专注力和训练。在开始实验前，请多次练习。
- 为定量分析星形胶质细胞核、胞体、细胞本体及支配区域的体积与表面积，将（步骤 3.1–3.16 中获取的）3D 图像转移至 3D 图像分析软件（如 Volocity 6.1）中。
- 打开软件并创建一个新的库。将所有图像拖至新库左侧的灰色列中。然后选择一幅 3D 图像。在右侧显示不同颜色的不同通道。开启感兴趣的某一通道；例如在测量细胞核时选择 DAPI 的蓝色通道。手动调节亮度以获得最佳对比度。
- 选择“工具”菜单，进入“生成体积”（Make Volume）功能，将 Z 轴层扫图像合成为单一的 3D 图像。点击“编辑”菜单中的“属性”（Properties），确保 X、Y 和 Z 属性均已正确显示；否则将无法进行 3D 分析。
- 点击工具栏中的“自由手绘 ROI 工具”（Freehand RIO tool）图标。为测量星形胶质细胞核的体积与表面积，在 DAPI 标记的细胞核周围绘制轮廓线。
- 为测量星形胶质细胞本体（胞体）的体积与表面积，在胞体周围绘制轮廓线，但排除所有分支。
- 为测量整个星形胶质细胞（包括胞体和所有分支）的体积与表面积，沿胞体并跟随所有分支的表面绘制轮廓线。
- 为评估星形胶质细胞支配区域的体积与表面积，在各分支末端之间绘制连线。
注意：按键盘上的 Delete 键可删除不需要的绘图。 - 点击图像窗口顶部的“测量”（Measurements）菜单以创建测量方案；此时将弹出一个包含多种工具的窗口。
- 将“Find objects”拖至窗口（窗格）顶部。为 Population 1 输入描述性名称，选择对应的色彩，然后点击“测量”（Measure）。另一个窗口将随之打开。
- 选择一个参数即，体积或表面积。点击“确定”（OK）。数据将显示在表格中。
- 为保存数据，请点击“测量”（Measurement）菜单并选择“生成测量项”（Make Measurement Item）。
- 在弹出的窗口中选择“新建测量项”（A new measurement item called）。随后为数据命名并点击“确定”（OK）。
- 最后，将数据导出至统计分析软件（如 GraphPad 或 Excel 程序）。使用 t 检验分析数据，然后绘制二维图表。
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结果
本部分展示了一些由三维形态测量分析产生的定性与定量观察结果。有关前文提到的全部12个参数的完整结果，请参见我们之前的出版物10。
定性观察
在注射Aβ1-40 的大鼠中，星形胶质细胞表现出细长或粗厚的突起，通常较长（图1）。在大脑皮层中观察到少量具有短突起的星形星形胶质细胞，而在胼胝体中则形成了致密的星形胶质细胞网络。
经Aβ1-40注射并接受染料木素处理的动物脑组织中的星形胶质细胞呈现星状形态，具有短而细的突起（图2）10。少数星形胶质细胞表现出萎缩样形态。
星形胶质细胞密度与 GFAP+ 荧光强度
与接受Aβ1-40注射并同时接受染料木素治疗的大鼠相比，仅接受A...
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讨论
在本实验方案中，我们采用三维共聚焦形态计量法评估了与星形胶质细胞形态相关的12个不同参数。为此，我们取用Aβ处理大鼠的海马组织1-40‒诱导星形胶质细胞增生，无论是否使用染料木素预处理作为抗炎剂，均被采用。通过使用三维图像和形态测量软件，我们能够展示染料木素对星形胶质细胞增生的影响 即 星形胶质细胞的形态学。
脑组织细胞内和细胞外环境的变化可导致细胞/组织的体积和（或）大小发生改变。这些改变被认为是多种脑损伤中的病理学特征3,11。为了定量分析这些变化，已采用多种技术手段。大多数研究依赖于通过光学显微镜或电子显微镜（EM）获取的二维低分辨率图像，此类图像仅能提供细胞局部的信息。为克服这一局限性，研究人员开发了基于高分辨率图像的三维共聚焦形态测量技术11。共聚焦显微镜的另一优势在于，通过Z轴层扫成像获得多个连续的二维图像，从而可对细胞的结构进行研究。此外，三维共聚焦显微镜还能够通过滤除背景噪声来提高图像质量11。
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披露
本工作得到了瑞典东约特兰郡议会以及伊朗医科大学（德黑兰，伊朗）细胞与分子研究中心资助项目的资助。
致谢
作者无任何利益冲突需要披露。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 淀粉样蛋白 beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | 保存于 -70 °C |
| 金雀异黄素 | Sigma Aldrich | 446-72-0 | 保存于 -20 °C |
| 兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体 | DAKO | Z0334 | |
| 碱性磷酸酶标记的猪抗兔IgG抗体 | DAKO | ||
| 液体永久性显色剂 | DAKO | K0640 | |
| 液体永久性红色底物缓冲液 | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | 聚氧乙基化蓖麻油 — 步骤 1.1 |
| LSM 700 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| 图像分析 2000 | Tekno Optic | ||
| 立体定位仪 | Stoelting | ||
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software Inc. |
参考文献
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