利用微流控共培养装置分析发育中牙胚的神经支配

摘要

共培养是研究神经与靶组织及器官之间相互作用的重要方法。微流控系统可在不同的培养基中实现神经节与完整发育中的器官或组织的共培养，因此成为一种研究该领域的有力工具。 体外 神经元与其靶细胞间串扰的研究

摘要

神经支配在器官和组织的发育、稳态维持及再生过程中起着关键作用。然而，这些现象背后的机制尚未被充分阐明。特别是神经支配在牙齿发育与再生中的作用常被忽视。

多项体内研究已提供了有关各种动物模型在发育和修复过程中牙体组织神经支配模式的重要信息。然而，这些方法大多数并不适合突出显示神经纤维与靶器官及组织之间相互作用的分子基础。

共培养是一种在受控且隔离的环境中研究和调控神经纤维与牙齿之间相互作用的有价值方法。在过去几十年中，传统的共培养通常使用相同的培养基进行，且培养时间极短（例如，两天）以研究发育中的口腔和牙体组织对感觉神经纤维的趋化性或排斥性影响。然而，要研究神经支配对牙形态发生和细胞分化的影响，则需要延长培养时间。

微流控系统能够在各自适宜的培养基中实现神经元与不同类型细胞的共培养。我们近期已证明，三叉神经节（TG）与牙齿在微流控装置中进行共培养时可长期存活，并且在这些条件下维持其原有的神经支配模式 体内.

基于此，我们描述了如何在微流控共培养系统中分离并共培养发育中的三叉神经节和牙胚。本方案介绍了一种简单且灵活的方法，用于在受控且隔离的环境中共培养神经节/神经与靶组织，并研究特定分子在这些相互作用中的作用。

引言

神经支配在器官和组织的发育、稳态维持及再生过程中发挥着关键作用^1,2。此外，神经支配还参与调控干细胞的增殖、迁移和分化过程^3–5。事实上，近期在口腔颌面复合体组织中开展的研究表明，副交感神经对于唾液腺发育和再生过程中上皮前体细胞的功能至关重要^6,7。同样，已有研究证实神经支配对味蕾的发育与维持必不可少^8–11。因此，深入分析神经支配在其他重要口腔颌面器官和组织（如牙齿）发育过程中尚未受到足够重视的作用具有重要意义。

尽管成年牙齿具有丰富的神经支配，但与体内所有其他器官和组织不同，发育中的牙齿最早在出生后的早期阶段才开始接受神经支配。牙齿的发育源于口腔外胚层与源自颅神经嵴的间充质之间的一系列连续且相互作用的过程。这些相互作用产生了上皮来源的成釉细胞和间充质来源的成牙本质细胞，分别负责釉质和牙本质的形成¹²。来自三叉神经节的感觉神经和来自颈上神经节的交感神经支配成年牙齿^13–15。在胚胎发生过程中，源自三叉神经节的神经纤维向发育中的牙胚延伸，并逐步将其包围，但并不侵入牙乳头间充质¹³。神经纤维进入牙髓间充质发生在更晚的发育阶段，这一时期与成牙本质细胞的分化及牙本质基质的沉积相一致¹⁶。牙齿萌出至口腔后不久，牙髓的神经支配即告完成¹³。先前的研究表明，在牙发生过程中，多种信号素（semaphorins）和神经营养因子参与调控神经支配^16–19。早期研究已明确证实，在鱼类中神经支配是牙齿形成的先决条件²⁰。近期的研究显示，感觉神经通过分泌音猬因子（shh）来调控小鼠门齿中牙间充质干细胞的稳态²¹。然而，在哺乳动物中，神经支配在牙齿起始、发育及再生过程中的作用仍存在很大争议^22–24。

大量体内研究已提供了有关各种动物模型在发育及修复过程中牙体组织神经支配模式的重要信息^13,25,26。然而，这些方法大多并不适合揭示神经纤维与靶器官及组织之间相互作用的分子基础。共培养是一种有价值的手段，可在受控且独立的环境中研究并调控神经纤维与牙组织之间的相互作用^26–29。同时，共培养也需进行多种技术上的调整。例如，神经与特定牙组织（如牙髓、牙囊、牙上皮）通常需要不同的培养基，以确保组织在较长时间内的存活^30–32。

近几十年来，传统的共培养通常使用相同的培养基进行非常短时间（例如，两天）的培养，以研究发育中的口腔和牙体组织对感觉神经纤维的趋化或排斥作用^27–29。然而，要研究神经支配对牙体形态发生和细胞分化的影响，以及神经纤维在靶器官内的分支动态，就需要延长培养时间。因此，非邻接式共培养将更适合用于神经-牙体组织相互作用的研究。

微流控系统可在其相应的培养基中实现神经元与不同类型细胞的共培养。在这些装置中，牙组织和神经元被分隔在不同的腔室中，同时允许轴突通过微通道从神经元胞体生长至含有靶组织的腔室³³。微流控装置已被用于研究神经元与小胶质细胞之间的相互作用^34,35，以及癌症和新生血管形成中的细胞间相互作用³⁵。此外，这些系统还被用于研究背根神经节与成骨细胞之间的相互作用³⁶。

我们最近证明，三叉神经节（TG）和牙齿在微流控装置中共同培养时能够长期存活。 ³⁷此外，我们已证明，不同发育阶段的牙齿在这些条件下保持完整 体外 条件对三叉神经支配产生与其所表现出的相同排斥性或吸引性效应 体内 ³⁷本方案介绍了一种简单、高效且灵活的方法，用于在受控且隔离的环境中共培养神经节/神经与靶组织，并研究特定分子在这些相互作用中的作用。

方案

所有小鼠的饲养和操作均依照瑞士动物福利法，并符合苏黎世州兽医办公室的 regulations。

1. 解剖材料、培养基和微流控装置的准备

1. 将显微解剖镊子和剪刀进行高压灭菌（121 °C，灭菌时间：20 min），并存放于无菌容器中。
2. 将玻璃盖玻片（24 mm × 24 mm）置于1 M HCl中，在37 °C下于摇床孵育24小时以灭菌。用无菌蒸馏水洗涤三次₂O 和 99% 乙醇各清洗三次。将盖玻片在 37 °C 下或无菌通风橱中干燥。最后，通过高压灭菌或紫外照射（30 分钟）完成灭菌。盖玻片可随后保存于 70% 乙醇中。
3. 使用无菌镊子小心地从包装中取出AXIS轴突分离装置，并将其放入无菌培养皿中。
4. 使用无菌活检打孔器（ø：1mm）为每个待培养的样本制备一个孔图1在培养室对应位置。
   注意：打孔时切勿过于靠近微沟槽，以免施加的压力对其造成损伤。
5. 将AXIS轴突分离装置浸入70%乙醇中进行灭菌。随后在无菌操作台内将AXIS轴突分离装置和盖玻片彻底干燥。至少等待3小时后再进行后续操作。
   注意：干燥不充分将导致微流控装置组装缺陷。
6. 将每张盖玻片放入一个35 mm的培养皿中，或置于6孔板的孔内。
7. 将AXIS轴突分离装置置于盖玻片上，用弯头镊子轻轻但牢固地按压，以确保分离装置与玻璃盖玻片之间完全贴合。
8. 在每个培养室中，用移液器加入150 µl多聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml，溶于无菌蒸馏水）₂O）将微流控装置置于真空环境中5分钟，以去除培养腔内的所有空气。
9. 如果腔室内仍可见气泡，需将聚-D-赖氨酸溶液重新移液至腔室内。
10. 将装置与多聚-D-赖氨酸孵育过夜 在 37 °C 下。
11. 用无菌蒸馏水清洗腔室三次₂O.
12. 用150 µl 层粘连蛋白工作液（Sigma-Aldrich，5 µg/ml，溶于PBS或无血清培养基中）填充培养室，37 °C过夜孵育。
13. 准备 50 ml 三叉神经节培养用培养基 ³⁷ ，组分如下：48 ml Neurobasal 培养基，1 ml B-27，100 U/ml 青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，5 ng/ml 神经生长因子（NGF），0.25 pM 阿糖胞苷。
14. 准备 50 ml 牙胚培养培养基 ³⁷，配制如下：40 ml DMEM-F12，10 ml 胎牛血清（FBS，终浓度：20%），100 U/ml 青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，150 µg/ml 抗坏血酸。

2. 小鼠胚胎的制备与解剖

1. 根据阴道栓确定胚胎发育天数（阴道栓出现日为胚胎发育0.5天，E0.5），并通过形态学标准加以确认。本实验方案通常使用E14.5至E17.5的小鼠胚胎。
2. 用70%乙醇清洁解剖区域和体视显微镜。
3. 通过颈椎脱位法处死怀孕母鼠。将母鼠颈部固定在网格上，用食指和中指夹紧，果断拉扯尾部。
4. 剪开下腹部周围的皮肤，用剪刀切开腹腔。找到子宫：在妊娠晚期，子宫充分占据腹腔。
5. 将子宫完整取出，放入盛有预冷PBS的离心管中，并置于冰上。组织在冰上可保存数小时。根据机构规定妥善处理母鼠尸体。
6. 从子宫中取出胚胎，并去除其胚外组织。将胚胎置于盛有预冷PBS的冰上保存。
7. 用剪刀切除胚胎头部，并使用显微解剖剪将下颌与头部分离（图2A）。精确移除下颌，避免损伤三叉神经节；由于三叉神经节紧邻下颌，操作时可能意外损伤。将下颌和剩余头部组织保存在盛有冷PBS的冰上。
8. 为分离三叉神经节，取头部置于已加入冷PBS的玻璃解剖培养皿中。使用镊子去除皮肤和颅骨。将镊子置于端脑下方并上提，使端脑与小脑一同翻起，从而暴露颅底。
9. 定位三叉神经节（见图2B）。用镊子将三叉神经节与三叉神经分离。使用解剖针作为刀具，清除三叉神经的残留投射纤维。将分离出的三叉神经节置于盛有冷PBS的培养皿中，并保持在冰上。
10. 为分离胚胎牙齿，将先前从颅骨分离的下颌置于盛有冷PBS的玻璃解剖培养皿中。使用解剖针作为刀具，去除舌头及下颌周围的皮肤组织。沿下颌中线切割，分离左右半侧下颌。牙胚清晰可见（见图1C）。使用解剖针分离牙胚，并去除多余的非牙源性组织。将分离后的牙胚置于盛有冷PBS的培养皿中，并保持在冰上。

3. 微流控共培养

1. 解剖后，从微流控装置中去除层粘连蛋白。用相应的培养基填充各室，每室200 µl。
2. 用镊子将解剖得到的三叉神经节（TG）和牙胚轻轻转移至打孔形成的孔洞中（图1D）。确保牙胚不会漂浮，并沉降至与盖玻片接触。
3. 将样品置于37 °C、5% CO₂的培养箱中进行培养。
4. 每48小时更换一次培养基。不要将室内的培养基完全吸出，也不要直接将移液管插入培养室。完全排空会导致室内产生气泡；直接向室内移液可能造成轴突损伤。为避免这些问题，移除旧培养基时应将移液管尖端指向孔的外侧；同样，加入新鲜培养基时也应将其加至与培养室相对的孔的另一侧。
5. 在培养期间，可通过延时显微成像轻松观察共培养样品。共培养体系可维持超过10天。
6. 培养结束后，通过向每个室的一个孔中加入150 µl PBS并使其流经各室三次，清洗培养室。
7. 吸除PBS，向每个室的一个孔中加入150 µl 4%多聚甲醛（溶于PBS），室温孵育15分钟以固定样品。
8. 按照步骤3.6所述方法，用PBS清洗培养室两次。
9. 继续进行后续分析。

结果

这些结果表明，分离的三叉神经节可以在微流控装置的一个腔室中生长，同时分离的牙胚在微流控装置的另一个腔室中能够长期维持发育。两个腔室使用不同的培养基，且腔室之间的微通道允许三叉神经节的轴突延伸至发育中的牙胚。 图3 通过免疫荧光技术对神经丝蛋白进行可视化展示 ³⁷在所述的微流控共培养系统中，小鼠胚胎三叉神经节与小鼠胚胎切牙的共培养。小鼠切牙在发育过程中无神经支配 体内 一致地，在培养中长达10天的时间内，三叉神经节的轴突被发育中的牙胚排斥。 图3A 展示了该共培养系统中轴突室的概览。 图3B 和 3C 显示轴突室和微沟槽内神经突的逐步放大图像。牙胚（或其他共培养的器官或组织）可轻松从微流控装置中取出，并进行独立分析 例如， 用于组织学染色或基因表达分析。

讨论

上一步 体外 牙齿神经支配的研究基于三叉神经节与牙源组织或细胞的传统共培养方法 ^26,28,29这些研究主要旨在探究这些细胞或组织对感觉轴突的趋化效应 ³⁸尽管在该领域取得了显著进展，但仍引发了一些技术问题。牙胚在培养数天后开始退化 ³⁷基于这些观察结果，在相同培养条件下共同培养神经元和牙齿会干扰对这两种组织间相互作用相关分子的任何后续分析。需要优化的培养条件以维持三叉神经节和牙体组织的生理分子特征。

微流控系统迄今为止已被用于在优化的培养基中共培养神经元和各种细胞类型 ^34,36该微流控系统能够更真实地模拟 体内 神经细胞胞体、轴突末端及靶组织通常暴露于不同的细胞与分子微环境，而微流控装置最近已被用于背根神经节与成骨细胞的共培养 ³⁶我们最近证明，三叉神经节和牙齿在微流控装置中共同培养时能够长期存活。 ³⁷此外，我们证明了处于不同发育阶段的牙齿在这些条件下能够保持 体外 与它们所表现出的对三叉神经...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AXIS 轴突分离装置	Millipore	AX15010-TC	提供不同长度的微通道
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
B27 添加剂	Gibco	17504
重组小鼠 β-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	人和大鼠 β-NGF（R&D Systems）具有等效性
DMEM-F12 培养基	Gibco	11320-033