微流控采用共培养开发设备牙胚支配分析

Summary

共培养物代表了研究神经与靶组织器官之间相互作用的有价值的方法。微流控系统允许在不同的培养基中共培养神经节和整个发育中的器官或组织，因此是体外研究神经元与其靶标之间串扰的宝贵工具。

Abstract

支配起着器官和组织的发育，稳态和再生的关键作用。然而，这些现象背后的机制尚未很好地理解爱好。特别是，在神经支配牙齿发育和再生的作用被忽略。

几个在体内的研究已经在多种动物模型的发展和修复过程提供了有关牙齿组织的神经支配的模式的重要信息。然而，大多数这些方法不是最优的，突出的神经纤维和靶器官和组织之间的相互作用的分子基础。

共培养物构成一个有价值的方法进行调查，并操纵一个受控和隔离的环境神经纤维和齿之间的相互作用。在过去的几十年中，使用相同的培养基中常规共培养物已进行很短的时间（ 例如 ，2天）研究制定对感觉神经纤维口腔和牙齿组织的吸引力和排斥力的影响。但是，延长培养期需要调查支配牙齿形态发生和细胞分化的影响。

微流体系统允许共培养的神经元和不同类型的细胞在它们的合适的培养基。我们最近证明，三叉神经节（TG）和牙齿能够存活的很长一段时间时，共培养在微流体装置，并且它们在这些条件下保持它们显示在体内同一神经支配模式。

在此基础上，我们将描述如何分离和共培养显影三叉神经节和牙胚在微流体的共培养system.This协议描述了一个简单而灵活的方式来共培养神经节/神经和靶组织，并研究的作用在对照这种相互作用的特定分子olled和孤立的环境。

Introduction

支配起着器官和组织^1,2的发育，稳态和再生的关键作用。此外，支配参与干细胞增殖，动员和分化³的调节^{- 5。}实际上，实现了在颜面部复杂的组织最近的研究已经表明，唾液的发育和再生腺体^6,7-期间副交感神经是必要的上皮的祖细胞的功能。类似地，已经证明，神经支配是必要的味蕾⁸的开发和维护^{- 11。}因此，为了分析如牙神经支配在其他重要的口面部的器官和组织的发展却忽视的作用是很重要的。

尽管成年齿的丰富的神经支配的，相反于主体，开发板的所有其它器官和组织平齿开始在最早产后阶段进行支配。牙齿作为发展的口腔外胚层和中颅神经嵴源性间充质顺序和相互交流的结果。这些相互作用产生的上皮衍生成釉细胞和间充质来源的牙本质细胞，它们负责牙釉质和牙本质，分别为¹²的形成。从颈上神经节三叉神经节和交感神经感觉神经支配牙齿的成人^{13 - 15。}在胚胎发生期间，神经纤维从向显影牙胚三叉神经节项目发出并逐步包围他们，但他们不渗透到牙乳头间质^13。神经纤维进入牙髓间充质在与成牙本质细胞分化和牙本质基质沉积¹⁶关联更先进的发展阶段。牙髓的神经支配是并发症eted不久后在口腔中¹³牙齿萌出。先前的研究已经表明，各种脑信号和神经营养蛋白牙胚¹⁶期间参与神经支配的调....

Protocol

所有的小鼠根据瑞士动物福利法和符合州兽医办公室，苏黎世的规定维护和处理。

1.准备材料解剖，文化传媒，微流体装置

1. 高压釜显微解剖镊子和剪刀（121℃，灭菌时间20分钟），并把它们存储在无菌容器中。
2. 通过将它们在1M HCl中24小时，在定轨摇床上，在37℃消毒盖玻片（24毫米×24毫米）。用无菌，蒸馏水用乙醇99％冲洗三次_，2 O和三次。干燥然后将盖玻片，在37℃或在无菌流罩。最后，高压灭菌或暴露的盖玻片于UV光（30分钟）以完成杀菌。盖玻片然后可被储存在70％乙醇。
3. 使用无菌镊子小心地从包中取出的AXIS轴突隔离设备，并将其放置在无菌培养皿。
4. 使用无菌活检穿孔（直径:仅1mm）中创建的培养腔室对应每采样1孔进行培养（ 图1）。
   注意:不要冲太靠近微槽，因为他们可能会被施加的压力而损坏。
5. 通过佛光普照他们70％乙醇消毒AXIS轴突隔离设备。干那么Axon公司AXIS分离设备和盖玻片完全在无菌流罩。等待至少3小时的，然后再继续。
   注:不完全的干燥，将导致在微流体器件的装配不良。
6. 放置每个盖玻片到35毫米的培养皿或成孔的6孔平板内。
7. 将AXIS轴突隔离装置上盖玻片，并轻轻按下但坚定地用钳子用弯曲的两端，以使隔离装置和玻璃盖玻片之间的完全粘连。
8. 在每个培养室....

Results

这些结果表明，分离的三叉神经节用的微流体装置的一个隔室生长，此外，所分离的牙胚的发展是持续的时间在微流体装置的另一个室长。不同的培养基中使用了两个室，两个室之间的微槽允许扩展从朝显影牙胚三叉神经节轴突的。 图3表示神经丝通过免疫荧光³⁷可视化，在鼠标的共培养胚胎三叉神经节和小鼠胚胎门齿中所描述的微流体的共培养系统。鼠标门牙发展体内期间不支配;一致，从三叉神经节轴突由显影牙胚中培养高达10天废除图3A示出了轴突室在此概述共培养体系。 图3B和3C示出内轴突腔和微园的神经突的渐进倍率。牙胚（或任何共培养的器官或组织）能够从微流体装置可以容易地除去，并分别如分析，处理以用于组织学染色或用于基因表达分析。

Discussion

上一页牙神经支配的体外研究都是基于传统的联合培养三叉神经节和牙齿的组织或细胞^26,28,29的。这些研究进行主要调查这些细胞或组织上的感觉轴突^38上的吸引力的影响。虽然引进外地显著的进步，几个技术问题被提出。牙胚开始培养后³⁷几天就变质。基于这些观察，生长的神经元和牙齿在相同的培养条件影响涉及这两个组织之间的串扰的分子的任何最终分析。需要最佳培养条件以保持三叉神经节和牙齿组织的生理分子谱。

微流体系统已用于迄今共培养的神经元和多种细胞类型中优化的媒体^34,36。该微流体系统可以代表更多的信心充分的体内的情况下，其中，神经细胞体，轴突终端和靶组织通常暴露于不同的细胞和分子的微环境。最近，微流体装置已被用于共培养整个背根神经节和成骨细胞^36。我们最近表明，三叉神经节和牙齿能够存活很长一段时间时，共培养在微流体装置^37。此外，我们证明了来自不同发育阶段的牙齿在这些体外条件对三叉神经支配相.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AXIS 轴突分离装置	不同长度的	Millipore	AX15010-TC
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504
重组小鼠 β-NGF	R&D Systems	1156-NG-100	人和大鼠 β-NGF （R&D 系统）等效于
DMEM-F12	Gibco	11320-033