通过III型分泌系统将效应蛋白转运至宿主细胞是革兰氏阴性菌中一种常见的毒力策略。本研究采用基于β-内酰胺酶效应蛋白融合的检测方法，对转运过程进行定量分析。在感染了Yersinia的细胞中，通过激光扫描显微镜监测β-内酰胺酶对FRET报告分子的转化作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
许多革兰氏阴性菌，包括致病菌 耶尔森菌属 利用III型分泌系统将效应蛋白转运至真核宿主细胞内。在宿主细胞内，这些效应蛋白可调控细胞功能，从而有利于细菌的生存与增殖。为了更深入理解细菌与宿主细胞相互作用过程中III型分泌系统的调控机制，亟需灵敏且准确的检测方法来评估效应蛋白的转位过程。本文描述了一种基于融合蛋白的检测方法的应用，该方法通过将一个 耶尔森菌 肠炎耶尔森菌 效应蛋白片段（耶尔森菌外膜蛋白；YopE）与TEM-1 β-内酰胺酶融合用于转位的定量分析. 该检测方法依赖于转位的β-内酰胺酶融合蛋白对细胞可渗透的FRET染料（CCF4/AM）的切割作用。当β-内酰胺酶切割CCF4的头孢菌素核心结构后，香豆素向荧光素的能量转移（FRET）被中断，此时激发香豆素部分将产生蓝色荧光发射。文献中已报道了该方法的多种应用，凸显其多功能性。该方法可用于分析蛋白质转位过程 体外 以及在 在体内，例如， 在小鼠模型中。荧光信号的检测可使用酶标仪、流式细胞分析或荧光显微镜进行。在本文所述的实验设置中， 体外 通过不同耶尔森菌突变株将效应子融合蛋白转位进入HeLa细胞的过程由激光扫描显微镜监测。实时记录细胞内β-内酰胺酶效应子融合蛋白对FRET报告分子的转化可提供可靠的定量结果。此处展示示例数据，表明某突变株增强了转位效率 Y. enterocolitica 与野生型菌株相比的YopE突变株。
引言
III型分泌系统是一类由多种革兰氏阴性菌属利用的特化蛋白质外排装置，可将细菌编码的效应蛋白直接递送至真核宿主细胞内。尽管分泌装置本身高度保守，不同细菌物种已进化出特异性的效应蛋白组合，用以调控宿主细胞信号通路并促进特定的细菌致病策略1. 如果发生 耶尔森菌属， 多达七种效应蛋白，称为Yops（耶尔森菌 外膜蛋白）在接触宿主细胞后被转运，共同作用以抑制免疫细胞反应，例如吞噬作用和细胞因子产生， 即， 以允许细菌在胞外存活2-4转位过程在不同阶段受到严格调控5已知III型分泌系统（T3SS）的初始活化由其与靶细胞的接触触发。6然而，这一启动过程的精确机制仍有待阐明。在 耶尔森菌 通过上调或下调细胞内Rho GTP结合蛋白Rac1或RhoA的活性，可实现易位的所谓第二层次的精细调节。Rac1的激活 例如 由侵袭素或耶氏菌细胞毒素坏死因子Y（CNF-Y）介导，可导致转位增加7-9而易位的YopE的GAP（GTP酶激活蛋白）功能可下调Rac1活性，从而通过负反馈机制降低易位效率10,11.
有效且精确的方法是研究Yersinia与宿主细胞相互作用过程中效应蛋白转位调控机制的前提。目前已有多种不同的系统被用于此目的，各自具有特定的优势和局限性。一些方法....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 峰值发射与串扰的测定（另见图 2）
- 为了确定供体（香豆素衍生物 V450）与受体（荧光素）染料之间的发射峰及串扰程度，需在 405 nm 激发波长下对分别标记两种荧光染料的细胞进行光谱扫描。
- 确定每种染料在供体和受体通道中使用的峰内10 nm带宽（此处为455–465 nm和525–535 nm）。绘制归一化强度随波长的变化曲线，并计算供体染料在受体通道中的平均串扰百分比 反之亦然 (图 2).
2. 细胞培养感染用Y. enterocolitica菌株的制备
- 使用以下菌株：WA-314 pMK-ova（分别用质粒 pMK-bla17 和 pMK-ova17 转化的 WA-314）和 WA-314ΔYopE pMK-bla（用质粒 pMK-bla17 转化的 WA-314ΔYopE）
- 感染前至少两天，从冻存菌种中挑取单菌落接种于含相应抗生素的 LB 琼脂平板上，菌株包括 Y. enterocolitica WA-314 pMK-ova、WA-314 pMK-bla 和 WA-314ΔE pMK-bla（WA-314 pMK-bla 和 WA-314 pMK-ova 使用卡那霉素；WA-314ΔE p....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了验证所述方法在定量分析效应蛋白向靶细胞转位方面的能力，研究了两种具有不同转位动力学的Yersinia菌株：Y. enterocolitica野生型菌株WA-314（血清型O8，携带毒力质粒pYVO822）及其衍生株WA-314ΔYopE（WA-314携带pYVO8ΔYopE23）。先前研究表明，缺乏功能性YopE的Y. enterocolitica突变体表现出显著更高的Yop蛋白转位速率10。两种菌株均被转化以表达YopE的N端分泌信号与TEM-1 β-内酰胺酶的融合蛋白（pMK-bla）17。此外，WA-314还被转化以表达相应的YopE-卵清蛋白融合蛋白（pMK-ova17），作为阴性对照。为进一步评估该方法的有效范围及其定量适用性，分别设置了30、60和90分钟的孵育时间。数据分析采用两种不同的读出方式：供体荧光信号（Ch1）和相对FRET系数（Ch3 = Ch2’ / (Ch1 + Ch2’)）（图1B和1C
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究成功应用了一种基于TEM-1 β-内酰胺酶报告系统的检测方法，用于定量分析Y. enterocolitica的效应蛋白转位。文献中已报道了该技术的多种不同变体，该方法具有高灵敏度、高特异性和相对简便的特点。在本研究中，采用激光扫描显微镜以实现对荧光信号最灵敏且精确的检测。特别是，通过校正供体与受体染料之间的串扰，并使用可单独调节的检测带宽，使得该方法在测量准确性方面优于其他变体。结果明确显示，该方法能够实现对转位过程的定量分析。不同的孵育时间代表细胞内β-内酰胺酶的不同浓度，其与供体荧光强度的斜率呈正相关。此外，还证实了WA-314ΔYopE菌株相较于野生型菌株WA-314具有显著更高的转位速率。
采用了两种替代的数据分析方法：供体通道强度和相对FRET系数。使用供体通道的优势在于其可直接反映CCF-4水解产物（香豆素）的积累情况。在显微镜设置中，该方法是可行的，因为在显微镜下无需像使用酶标仪那样通过供体/受体比值来校正细胞密度差异。然而，CCF4染料或其水解产物的外排仍可能对此方法造成干扰。这一缺点可通过计算相对FRET系数来克服。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Antonio Virgilio Failla 博士提供了 FRET 采集定量算法，感谢 Erwin Bohn 提供了 pMK-bla 和 pMK-ova 载体。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB-琼脂 | Roth | X969.2 | |
| LB培养基 | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96孔板（黑色，透明底） | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM，高糖，含GlutaMAX添加剂和丙酮酸 | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| 丙磺舒 | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G 加载试剂盒（含CCF4-AM） | Life Technologies | K1095 | |
| 小麦胚凝集素（Triticum vulgaris lectin）FITC标记物 | Sigma-Aldrich | L4895 | 用于峰值发射和串扰测定 |
| V450标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体 | BD Bioscience | 560469 | 用于峰值发射和串扰测定 |
| Immersol W 浸油 | Zeiss | 444969-0000-000 | 折射率 = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica microsystems | 配备2个GaAsP-混合探测器、4通道光谱仪、声光分光器、电动XY载物台、可调针孔，物镜：20X HC PL APO CS IMM/CORR，405 nm二极管激光器，50 mW | |
| Imaris 7.6 软件 | Bitplane | 包含插件：ImarisXT 和 MeasurementPro | |
| MatLab 编译器运行环境 | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad 软件 |
参考文献
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
