分析 小肠结肠炎耶尔森菌 利用β-内酰胺酶效应子融合蛋白将效应子转运至宿主细胞

摘要

通过III型分泌系统将效应蛋白转运至宿主细胞是革兰氏阴性菌中一种常见的毒力策略。本研究采用基于β-内酰胺酶效应蛋白融合的检测方法，对转运过程进行定量分析。在感染了Yersinia的细胞中，通过激光扫描显微镜监测β-内酰胺酶对FRET报告分子的转化作用。

摘要

许多革兰氏阴性菌，包括致病菌 耶尔森菌属 利用III型分泌系统将效应蛋白转运至真核宿主细胞内。在宿主细胞内，这些效应蛋白可调控细胞功能，从而有利于细菌的生存与增殖。为了更深入理解细菌与宿主细胞相互作用过程中III型分泌系统的调控机制，亟需灵敏且准确的检测方法来评估效应蛋白的转位过程。本文描述了一种基于融合蛋白的检测方法的应用，该方法通过将一个 耶尔森菌 肠炎耶尔森菌 效应蛋白片段（耶尔森菌外膜蛋白；YopE）与TEM-1 β-内酰胺酶融合用于转位的定量分析. 该检测方法依赖于转位的β-内酰胺酶融合蛋白对细胞可渗透的FRET染料（CCF4/AM）的切割作用。当β-内酰胺酶切割CCF4的头孢菌素核心结构后，香豆素向荧光素的能量转移（FRET）被中断，此时激发香豆素部分将产生蓝色荧光发射。文献中已报道了该方法的多种应用，凸显其多功能性。该方法可用于分析蛋白质转位过程 体外 以及在 在体内，例如， 在小鼠模型中。荧光信号的检测可使用酶标仪、流式细胞分析或荧光显微镜进行。在本文所述的实验设置中， 体外 通过不同耶尔森菌突变株将效应子融合蛋白转位进入HeLa细胞的过程由激光扫描显微镜监测。实时记录细胞内β-内酰胺酶效应子融合蛋白对FRET报告分子的转化可提供可靠的定量结果。此处展示示例数据，表明某突变株增强了转位效率 Y. enterocolitica 与野生型菌株相比的YopE突变株。

引言

III型分泌系统是一类由多种革兰氏阴性菌属利用的特化蛋白质外排装置，可将细菌编码的效应蛋白直接递送至真核宿主细胞内。尽管分泌装置本身高度保守，不同细菌物种已进化出特异性的效应蛋白组合，用以调控宿主细胞信号通路并促进特定的细菌致病策略¹. 如果发生 耶尔森菌属， 多达七种效应蛋白，称为Yops（耶尔森菌 外膜蛋白）在接触宿主细胞后被转运，共同作用以抑制免疫细胞反应，例如吞噬作用和细胞因子产生， 即， 以允许细菌在胞外存活^2-4转位过程在不同阶段受到严格调控⁵已知III型分泌系统（T3SS）的初始活化由其与靶细胞的接触触发。⁶然而，这一启动过程的精确机制仍有待阐明。在 耶尔森菌 通过上调或下调细胞内Rho GTP结合蛋白Rac1或RhoA的活性，可实现易位的所谓第二层次的精细调节。Rac1的激活 例如 由侵袭素或耶氏菌细胞毒素坏死因子Y（CNF-Y）介导，可导致转位增加^7-9而易位的YopE的GAP（GTP酶激活蛋白）功能可下调Rac1活性，从而通过负反馈机制降低易位效率^10,11.

有效且精确的方法是研究Yersinia与宿主细胞相互作用过程中效应蛋白转位调控机制的前提。目前已有多种不同的系统被用于此目的，各自具有特定的优势和局限性。一些方法依赖于使用不同去垢剂裂解感染的宿主细胞而非细菌，随后通过蛋白质印迹法（western blot）进行分析。这些方法的共同缺点是，轻微但不可避免的细菌裂解可能导致细菌相关效应蛋白污染宿主细胞裂解液。然而，有研究提出，先用蛋白酶K处理细胞以降解胞外效应蛋白，再使用皂苷（digitonin）选择性裂解真核细胞，可有效减轻这一问题¹²。重要的是，这些检测方法高度依赖高质量的抗效应蛋白抗体，而这类抗体大多无法商业化获得。尝试使用效应蛋白与荧光蛋白（如GFP）的融合蛋白来监测转位过程并未成功，可能是因为荧光蛋白具有球状的三级结构，分泌装置无法在分泌前将其解折叠¹³。然而，已有多种不同的报告标签被成功用于转位分析，例如百日咳杆菌（Bordetella pertussis）毒素环裂解素的cya（钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶）结构域¹⁴或Flash标签。在前一种检测中，利用cya的酶活性来放大细胞内融合蛋白的信号；而Flash标签是一种极短的四半胱氨酸（4Cys）基序标签，可通过双砷染料Flash进行标记，且不会干扰分泌过程¹⁵。

此处采用的方法首次由 Charpentier 报道 等 基于转位效应蛋白TEM-1 β-内酰胺酶融合蛋白对细胞内Förster共振能量转移（FRET）染料CCF4的转化¹⁶ (图 1A。CCF4/AM 是一种可穿透细胞膜的化合物，其结构包含一个香豆素衍生物（供体）和一个荧光素基团（受体），二者通过头孢菌素核心相连接。当该非荧光性的酯化形式 CCF4/AM 被动进入真核细胞后，可被细胞内的酯酶水解为带电荷且具有荧光的 CCF4，从而被滞留在细胞内。在 405 nm 激发下，香豆素基团发生荧光共振能量转移（FRET），使荧光素基团在 530 nm 处发射绿色荧光信号。当 β-内酰胺酶切割头孢菌素核心后，FRET 效应被中断，此时香豆素基团的激发将导致在 460 nm 处产生蓝色荧光发射。文献中已报道了该方法的多种应用，体现了其高度的通用性。该方法可用于分析转位过程 体外 以及在 体内，例如， 该技术在小鼠感染模型中被用于鉴定易发生转位的白细胞群体 体内^17-19可使用酶标仪、流式细胞分析或荧光显微镜读取信号。值得注意的是，该方法还可通过活细胞显微镜在感染过程中实时监测转位情况。^20,21此处采用激光扫描荧光显微镜读取荧光信号，因其具有最高的灵敏度和准确性。特别是，该系统能够以纳米级精度调节发射窗口，结合高灵敏度检测器，有助于实现优化的荧光检测并最大限度减少串扰。此外，该显微镜系统可适用于对转位过程进行实时监测，并有望实现对细胞水平上的宿主-病原体相互作用的同步分析。

本研究以举例方式分析了Y. enterocolitica野生型菌株和表现出高转位表型的YopE缺失突变株的转位速率^10,11。

方案

1. 峰值发射与串扰的测定（另见图 2）

1. 为了确定供体（香豆素衍生物 V450）与受体（荧光素）染料之间的发射峰及串扰程度，需在 405 nm 激发波长下对分别标记两种荧光染料的细胞进行光谱扫描。
2. 确定每种染料在供体和受体通道中使用的峰内10 nm带宽（此处为455–465 nm和525–535 nm）。绘制归一化强度随波长的变化曲线，并计算供体染料在受体通道中的平均串扰百分比 反之亦然 (图 2).

2. 细胞培养感染用Y. enterocolitica菌株的制备

1. 使用以下菌株：WA-314 pMK-ova（分别用质粒 pMK-bla¹⁷ 和 pMK-ova¹⁷ 转化的 WA-314）和 WA-314ΔYopE pMK-bla（用质粒 pMK-bla¹⁷ 转化的 WA-314ΔYopE）
2. 感染前至少两天，从冻存菌种中挑取单菌落接种于含相应抗生素的 LB 琼脂平板上，菌株包括 Y. enterocolitica WA-314 pMK-ova、WA-314 pMK-bla 和 WA-314ΔE pMK-bla（WA-314 pMK-bla 和 WA-314 pMK-ova 使用卡那霉素；WA-314ΔE pMK-bla 使用卡那霉素和四环素），在 27 °C 过夜培养。之后将平板置于 4 °C 保存，最多可保存一周。
3. 感染前一天，取各菌株单菌落接种于 3 ml 含相应抗生素的 LB 液体培养基中，于 27 °C、180 rpm 摇床过夜培养。
4. 感染当天，将 2 ml 过夜培养物接种至 40 ml 无抗生素的新鲜 LB 培养基中，于 37 °C、180 rpm 摇床培养 90 分钟，以诱导 III 型分泌系统的表达。
5. 将培养物转移至适当的离心管中，此后将培养物置于冰上或 4 °C 保存。在 4 °C 条件下，以 5,000 × g 离心 10 分钟。
6. 用 2–3 ml 冰冷的 PBS 重悬细菌沉淀。使用分光光度计将细菌悬液调整至浓度为 8 × 10⁸ cfu/ml，并单独测定对应的光密度值。此悬液在感染 HeLa 细胞前需始终保持在冰上。

3. 铺板HeLa细胞

1. 感染前一天，在96孔板的每孔中加入200 µl含10%热灭活胎牛血清（FCS）的DMEM培养基，接种1.5 × 10⁴个HeLa细胞，于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。每种菌株接种三孔（对应三个不同的孵育时间）。

4. 感染HeLa细胞并用CCF4加载

1. 通过将3.5 µl细菌悬液加入培养基中感染HeLa细胞，并轻轻吹打培养基两次以混匀。使细菌以每个细胞约100个细菌的感染复数（MOI）沉降到细胞上。若进行时间进程实验，分别在-90分钟、-60分钟和-30分钟开始感染，并在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育至0分钟，以达到共同的终点。
2. 孵育完成后，小心吸除培养基，避免去除HeLa细胞，然后每孔加入50 µl含20 µg/ml氯霉素（chloramphenicol）的PBS以终止效应蛋白的表达，同时加入2.5 mM丙磺舒（probenecid）以减少CCF4的外排。
3. 此时将96孔板转移至显微镜载物台上，并为每个孔定义适合后续分析的观察位点。此步骤需在10分钟内完成（采集细节见第5.1节）。
4. 每孔使用多通道移液器加入70 µl CCF4/AM负载溶液（0.24 µl溶液A，1.2 µl溶液B，18.56 µl溶液C（溶液A、B、C均来自CCF4/AM负载试剂盒）以及50 µl PBS（含20 µg/ml氯霉素和2.5 mM丙磺舒）），室温孵育5分钟。自此步骤起需连续操作，不得中断。
5. 吸除负载溶液，使用多通道移液器每孔加入100 µl含20 µg/ml氯霉素和2.5 mM丙磺舒的PBS。随后迅速将96孔板转移至显微镜载物台上，并在吸除负载溶液后的10分钟内开始图像采集。

5. 激光扫描显微镜及数据分析

1. 图像采集
   1. 以最大化总光子计数并最小化光毒性、光漂白和串扰激发为原则设置成像条件。
      1. 在现代共聚焦激光扫描显微镜中，使用20倍高数值孔径浸没物镜，将探测器针孔打开至2.5艾里单位（Airy units）即， 宽场光学切片），选择高灵敏度的GaAsP探测器，同时激活供体和受体通道，8位深度，像素大小约750 nm，3次帧平均，并使用405 nm半导体激光器的10%功率进行激发。
      2. 为确保准确的定量分析，将两个通道的检测器增益设置为相同值，并避免出现任何饱和像素。
         注：此处增益设置为150%。
   2. 通过使用1 ml注射器等工具将浸润液扩散至孔板底部，确保持续浸润，并避免产生气泡。
   3. 打开透射光源，在每个孔中选择一个具有代表性的视野。使用经过正确校准的自动载物台，并在软件中标记该位置。
   4. 染色完成后（参见第4.3节），将培养板重新插入，并在板上放置配重以防止焦点漂移。使用激光扫描模式检查已保存的位置，并适当调整焦平面和横向位置。
   5. 将时间间隔设为2 min，持续时间设为2 hr，然后开始采集。
2. 图像定量分析（将以 Imaris 等 Bitplane 软件为例说明）
   1. 将数据集导入支持像素矩阵算术运算的软件中。通过将包含供体和受体通道的源文件拖放到软件图标上来完成此操作。
   2. 使用相同的偏移量对两个通道进行背景扣除。为此，请单击 菜单 然后点击图像>处理>基线扣除。选择每个通道并输入基线值。
   3. 使用预先确定的校正系数 f（参见 1.1）校正供体通道（Ch1）向受体通道（Ch2）的串色，生成一个新的通道：
      Ch2’ = Ch2 – Ch1 * f
      注意：在噪声水平之上，未检测到受体信号渗漏至供体通道。
      1. 点击菜单>图像处理>通道算术并输入 abs(ch2-(ch1×0.33)随后，通过点击菜单删除通道2>编辑>删除通道。确保已校正串色的受体通道保留为新的通道2。可选：通过进入菜单将通道颜色从灰色更改为原始颜色>编辑>图像属性。选择通道 4>映射颜色>基础颜色并将其更改为 例如， 绿色
   4. 创建一个新通道，执行以下操作以确定相对FRET系数：
      Ch3 = Ch2’ / (Ch1 + Ch2’)
      1. 前往菜单>图像处理>通道算术并输入 ch2./(ch1+ch2)
   5. 为在8位图像中正确显示FRET通道，请创建第四个通道：
      Ch4 = 255 * Ch3
      1. 前往菜单>图像处理>通道算术并输入 255*ch3. 通过菜单更改通道颜色>编辑>图像属性。选择通道 4>映射颜色>颜色表文件>喷流
   6. 对通道Ch3和Ch4应用3×3中值滤波器，以降低图像中的噪声。操作方法为：点击菜单>图像处理>平滑处理>中值滤波。选择两个通道并应用滤波尺寸“3x3x1”。
   7. 为定量分析细胞信号，通过适当设置偏移量并在第四通道（Ch4）中按尺寸对结构进行过滤以排除过小的结构，从而检测细胞。
      1. 选择 Surpass View 并点击图标“添加新表面在“表面”窗口中定义检测算法参数。为加快处理速度，勾选“仅分割感兴趣区域”和“最终处理整幅图像”两个选项。通过编辑尺寸来定义感兴趣区域。
      2. 选择通道4作为源通道，并通过阈值设定来确定阈值>背景减除（局部对比度），将直径设置为 10 µm。手动设置最小强度阈值为 0，最大阈值为最大强度。按面积筛选结构，并将最小值设置为 例如， 187 µm²。完成表面检测。
   8. 提取细胞实体中供体荧光强度（Ch1）和相对FRET系数（Ch3）的平均值及其标准差。为此，请进入“Surface properties”（表面属性）界面，通过选择“Surfaces Style/Quality”（表面样式/质量）来调整结构的显示外观。>表面。点击筛选器选项卡以选择所有结构，然后转到处理选区以合并检测到的结构。>统一。通过点击统计选项卡，将表面统计数据导出至 MS Excel>导出所有统计数据至文件。
   9. 随时间绘制这些数值。针对每种条件，确定供体通道荧光增加斜率最大的10分钟区间，作为反映效应分子转位量的合理参数。计算该斜率为 m =  Δ 供体荧光强度 / Δ 时间（min）

结果

为了展示所述方法在定量分析效应分子向靶细胞转位方面的能力，研究了两种具有不同转位动力学的Yersinia菌株：Y. enterocolitica野生型菌株WA-314（血清型O8，携带毒力质粒pYVO8²²）及其衍生株WA-314ΔYopE（WA-314携带pYVO8ΔYopE²³）。先前的研究表明，缺乏功能性YopE的Y. enterocolitica突变体表现出显著更高的Yop转位速率¹⁰。两种菌株均被转化以表达YopE的N端分泌信号与TEM-1 β-内酰胺酶的融合蛋白（pMK-bla）¹⁷。此外，WA-314还被转化以表达相应的YopE-卵清蛋白融合蛋白（pMK-ova¹⁷），作为阴性对照。为进一步评估该方法的有效检测范围及其定量适用性，采用了30、60和90分钟的孵育时间。数据分析采用两种不同的读出方式：供体荧光（Ch1）和相对FRET系数（Ch3 = Ch2’ / (Ch1 + Ch2’)）（图1B和1C

讨论

本研究成功应用了一种基于TEM-1 β-内酰胺酶报告系统的检测方法，用于定量分析Y. enterocolitica的效应蛋白转位。文献中已报道了该技术的多种不同变体，该方法具有高灵敏度、高特异性和相对简便的特点。在本研究中，采用激光扫描显微镜以实现对荧光信号最灵敏且精确的检测。特别是，通过校正供体与受体染料之间的串扰，并使用可单独调节的检测带宽，使得该方法在测量准确性方面优于其他变体。结果明确显示，该方法能够实现对转位过程的定量分析。不同的孵育时间代表细胞内β-内酰胺酶的不同浓度，其与供体荧光强度的斜率呈正相关。此外，还证实了WA-314ΔYopE菌株相较于野生型菌株WA-314具有显著更高的转位速率。

采用了两种替代的数据分析方法：供体通道强度和相对FRET系数。使用供体通道的优势在于其可直接反映CCF-4水解产物（香豆素）的积累情况。在显微镜设置中，该方法是可行的，因为在显微镜下无需像使用酶标仪那样通过供体/受体比值来校正细胞密度差异。然而，CCF4染料或其水解产物的外排仍可能对此方法造成干扰。这一缺点可通过计算相对FRET系数来克服。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB-琼脂	Roth	X969.2
LB培养基	Roth	X968.2
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
96孔板（黑色，透明底）	Greiner Bio One	655087
DMEM，高糖，含GlutaMAX添加剂和丙酮酸	Gibco/Life Technologies	31966-047
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G 加载试剂盒（含CCF4-AM）	Life Technologies	K1095
小麦胚凝集素（Triticum vulgaris lectin）FITC标记物	Sigma-Aldrich	L4895	用于峰值发射和串扰测定
V450标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体	BD Bioscience	560469	用于峰值发射和串扰测定
Immersol W 浸油	Zeiss	444969-0000-000	折射率 = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II 共聚焦激光扫描显微镜	Leica microsystems		配备2个GaAsP-混合探测器、4通道光谱仪、声光分光器、电动XY载物台、可调针孔，物镜：20X HC PL APO CS IMM/CORR，405 nm二极管激光器，50 mW
Imaris 7.6 软件	Bitplane		包含插件：ImarisXT 和 MeasurementPro
MatLab 编译器运行环境	MathWorks
Prism 5	GraphPad 软件