一种用于单细胞分泌物时空成像的无标记技术

摘要

细胞间通讯对于调控细胞内外多种生理活动至关重要。本文介绍了一种用于测量单个细胞分泌物时空特性的实验方案。为实现这一目标，采用了一种多学科交叉的方法，将无标记纳米等离子体传感技术与活细胞成像相结合。

摘要

细胞间通讯是复杂系统的重要组成部分，有助于维持基本的细胞活动。因此，此类信号传导功能异常可导致多种疾病。为了理解细胞间的信号传递，必须在不干扰局部环境的情况下，研究细胞分泌分子的空间和时间特性。目前已开发出多种检测方法用于研究蛋白质分泌，但这些方法通常依赖荧光探针，会干扰相关信号通路。为克服这一局限性，需要一种无需标记的检测技术。

本文介绍了一种无标记局域表面等离激元共振成像（LSPRi）技术的制备与应用，该技术能够检测单个细胞分泌的蛋白质。等离激元纳米结构通过光刻工艺加工在标准玻璃盖玻片上，可利用商用光学显微镜的可见光激发。纳米结构仅覆盖盖玻片的一小部分区域，因此该技术非常适合与荧光成像和明场成像等常规技术联用。

本方案采用多学科交叉的方法，包括传感器的纳米制造及后续生物功能化、配体与分析物结合动力学的表征、芯片与活细胞的整合，以及对测量信号的分析。总体而言，该技术为无标记检测细胞分泌物并将其与邻近细胞的响应相关联提供了一种通用的方法。

引言

细胞间的通讯对于调控细胞内外多种生理活动至关重要。多种蛋白质和囊泡可被分泌出来，进而触发复杂的细胞过程，如分化、伤口愈合、免疫反应、迁移和增殖。^1-5 细胞间信号通路的功能障碍已发现与多种疾病相关，包括癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等。

理想的细胞分泌检测方法应能够在不干扰相关信号通路的前提下，对目标分泌蛋白进行时空上的动态定位。通过这种方法，可以推断出分泌物浓度分布与受体细胞响应之间的因果关系。然而，目前常用的许多基于荧光的技术并未达到这些标准。虽然荧光融合蛋白可用于在细胞内标记分析物，但可能干扰分泌途径；若被分泌至胞外，则会在细胞周围产生弥散的荧光信号，难以定量。基于荧光免疫夹心法的检测是目前检测细胞分泌物最常用的技术，但通常需要对单个细胞进行分离^6-11。此外，检测过程中引入的感应抗体通常会中断或终止实验，且抗体标记分子的尺寸较大（IgG为150 kDa），可能阻碍下游信号传导。

由于这些障碍，最好采用无标记技术来成像蛋白质分泌；而在现有的无标记技术中，表面等离子体共振（SPR）和局域表面等离子体共振（LSPR）传感器是极佳的选择^12-17。这些传感器已广泛用于蛋白质、外泌体及其他生物标志物的分析物结合研究^18-24。对于LSPR而言，等离子体纳米结构可通过光刻技术图案化于玻璃盖玻片上，并利用可见光通过标准的宽场显微镜配置进行激发。由于其纳米级的尺寸，玻璃基底的大部分区域仍可用于明场和荧光显微镜等常规成像技术，因此这些探针非常适合与活细胞显微镜结合使用^25-28。我们已利用功能化的金等离子体纳米结构，实现了对杂交瘤细胞抗体分泌的实时测量，其时间分辨率为225毫秒，空间分辨率为10 µm。基本芯片结构如图1所示²⁸。显微镜的输出光路被分为两部分：一部分通往用于成像的CCD相机，另一部分通过光纤耦合至光谱仪，用于定量测定特定纳米结构阵列的占据分数（图2）。

本文所述方案介绍了在利用标准明场显微镜实时监测细胞反应的同时，对单个细胞分泌物进行实时测量的实验设计。该多学科方法包括纳米结构的制备、对纳米结构进行功能化以实现分析物的高亲和力结合、利用商用表面等离子体共振（SPR）仪器优化表面以最大限度减少非特异性结合并表征动力学速率常数、将细胞系整合到基底上，以及对图像和光谱数据进行分析。我们预期该技术将成为实现细胞分泌物时空图谱绘制及其与受体细胞之间因果关系研究的关键使能技术。

方案

1. 纳米结构制备

1. 选择直径为25 mm、厚度约为170 µm（No. 1.5）的玻璃盖玻片作为纳米加工的基底。
2. 将盖玻片浸入piranha溶液（浓硫酸与过氧化氢体积比为3:1）中至少6小时。用大量超纯18.2 MΩ去离子蒸馏水（DDW）清洗经piranha溶液处理的盖玻片。
   警告：Piranha酸与有机物接触会发生剧烈反应，操作时必须格外小心。
3. 通过电子束蒸发在盖玻片上沉积10 nm厚的铬薄膜，以避免在纳米结构的图形化和成像过程中产生电荷效应。
4. 以2,000 rpm转速旋涂双层抗蚀剂的第一层——乳酸乙酯甲基丙烯酸甲酯（MMA_EL6）共聚物，持续45秒，随后在150 °C下烘烤；再以3,000 rpm转速旋涂第二层聚甲基丙烯酸甲酯（950PMMA_A2），持续45秒，随后在180 °C下烘烤。
5. 使用电子束光刻（EBL）在25 kV条件下对双层抗蚀剂进行图形化，曝光剂量为300 µC/cm²。在异丙醇（IPA）/甲基异丁基酮（MIBK）溶液（体积比2:1）中显影，然后用IPA冲洗。
6. 使用电子束蒸发仪在基底上沉积Ti（5 nm）/Au（80 nm）薄膜。
7. 在完成金膜沉积后，将基底浸泡于丙酮中4小时，以剥离共聚物双层抗蚀剂。
8. 使用扫描电子显微镜（SEM）检查基底，确认纳米结构的形貌与尺寸；在室温下使用CR-7刻蚀液湿法刻蚀60秒，去除基底上残留的铬层，随后用DDW冲洗。
9. 设计中心间距为33 µm的阵列布局，以便在阵列之间留出用于细胞成像的空间。使用电子束光刻机以300 nm节距在每个阵列中制备20 × 20的纳米结构图案。每块芯片包含300个阵列，纳米结构典型尺寸为高度80±2.5 nm，直径70±2.5 nm。
10. 使用原子力显微镜（AFM）检查部分阵列，以验证其尺寸与均匀性。
11. 使用紫外固化环氧树脂将支撑环（通常为硅材料）固定在盖玻片背面。

2. 芯片清洗与自组装单分子层的施加

1. 清洗和再生芯片时，先在相同条件下对腔室进行5分钟的清洁，然后在300 mTorr、含5%氢气和95%氩气的混合气体中，以40 W功率进行45秒的等离子体灰化处理。
2. 等离子体灰化后立即对金纳米结构进行功能化处理：将芯片浸入由两种组分组成的乙醇硫醇溶液中，其中SH-(CH₂)₈-EG₃-OH（SPO）与含氨基或羧基官能团的组分按3:1比例混合，后者为SH-(CH₂)₁₁-EG₃-NH₂（SPN）或SH-(CH₂)₁₁-EG₃-COOH（SPC）。
3. 将芯片置于硫醇溶液中过夜 以形成自组装单分子层（SAM）。
4. 用乙醇冲洗芯片，并用氮气吹干。
5. 如有需要，可将功能化后的芯片在4 °C下保存最多2周。
6. 使用前，根据所选配体的类型，采用相应的化学方法使SPN或SPC组分与配体发生反应（见下文）。
   注意：芯片可反复再生和重新功能化数十次。同一芯片的使用周期可从6个月到一年以上。在经过多次等离子体灰化再生并继之以生物功能化后，同一阵列上测得的光谱具有良好的可重复性。²⁹

3. 表面功能化与动力学表征

注意：使用商业 SPR 仪器中的功能化芯片来表征配体与分析物之间的动力学速率常数，并研究自组装单分子膜（SAM）对非特异性结合的抗性。存在多种流速和微流控设计，可实现高效的表面功能化。由于我们使用的是商用 SPR 仪器，因此采用了其推荐的流速标准。需要指出的是，这些流速在所有 SPR 仪器中均属典型值，因此并不具有限制性。尽管 SPR 仪器并非必需，因为所有功能化步骤均可直接在局域表面等离子体共振（LSPR）芯片上完成，但 SPR 仪器确实减轻了我们的工作负担，因其为多通道检测仪器，而我们的 LSPR 微流控装置则不具备此功能。

1. 按照第2节所述方法，将商用裸金芯片用自组装单分子层（SAM）进行功能化修饰。
2. 若使用基于SPC的SAM，需用133 mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）与33 mM的 N在 DDW 中孵育 10 分钟。
3. 将活化的羧基与目标抗体/配体在 pH 6 的磷酸盐缓冲液中以 30 µl/min 的流速反应 300 秒。配体的缓冲液通常选用 pH 6 的磷酸盐缓冲液，但可根据具体分子进行调整。
4. 配体偶联后，以30 µl/min的流速在磷酸盐缓冲液（PBS）中注入0.1 M乙醇胺，作为失活步骤，持续300秒。乙醇胺有助于减少非特异性结合。
5. 以100 µl/min的流速引入一系列浓度的目标分析物，并使用动力学分析软件计算动力学速率常数。
6. 如果非特异性结合问题显著，可提高SPO与SPC或SPN的比例。

4. LSPR 通用设置

1. 显微镜设置：
   1. 使用100 W卤素灯对样品进行科勒照明。在光路中使用长通滤光片（通常截止波长为593 nm），以消除不引起共振位移的波长（图2）。
   2. 进行局域表面等离子体共振成像（LSPRi）数据采集时，使用配备40倍油浸物镜（1.4 NA）和热电冷却的16位CCD相机的倒置显微镜。
   3. 在显微镜输出端口安装分光镜，以同时获取图像和光谱数据。
   4. 将温控显微镜载物台设定为37 °C，并平衡4小时。
   5. 在显微镜上集成额外的培养装置，以将CO₂浓度和湿度分别调节至5%和95%。
2. 芯片准备与安装：
   1. 根据表面等离子体共振（SPR）实验确定的最佳双组分自组装单分子膜（SAM）比例，对LSPR芯片进行功能化修饰。
   2. 将芯片装入定制的微流控夹具中，具体步骤如下：将芯片置于铝制底板上，用硅胶垫圈和透明塑料顶板夹紧芯片，并用4个螺丝固定组件。
   3. 对于典型的基于SPC的硫醇应用，滴加300 µl去离子水中含133 mM EDC和33 mM NHS的1:1混合溶液，以活化SPC硫醇组分中的羧基基团。
   4. 等待10 min ，然后手动用10 mM PBS冲洗表面。
   5. 通过滴加300 µl配体溶液，将活化的羧基与目标配体（通常为抗体或抗体片段）偶联。
   6. 等待30 min，然后手动用10 mM PBS冲洗。
   7. 在芯片上滴加300 µl含0.1 M乙醇胺的PBS溶液，以最大限度减少非特异性结合。静置10 min。
   8. 用含0.005% Tween 20的PBS（PBS-T20）洗涤乙醇胺。
   9. 在芯片上方放置一块石英片，以减少因弯月面变化引起的数据波动。
   10. 在将芯片安装到显微镜上时，始终保持芯片被PBS-T20缓冲液润湿。
   11. 将LSPR芯片组件牢固地放入加热载物台的样品架中，并连接微流控管路。
   12. 将微流控管路连接至组件，并通入缓冲液（或细胞实验中的无血清培养基），直至达到稳态。
   13. 使组件和显微镜至少平衡2小时。
   14. 使用操纵杆调整芯片位置，使中央阵列与用于光谱分析的光纤对齐。光谱数据通过光谱仪和光谱分析软件采集。
   15. 在整个实验过程中，使用软件自动对焦、蔡司Definite Focus或等效自动对焦装置，保持阵列始终处于焦点位置。

5. 9E10 杂交瘤细胞分泌抗 c-myc 的 LSPR 成像

注意：本研究使用的杂交瘤细胞系可组成型表达抗c-myc抗体，因此无需化学诱导剂

1. 用 c-myc 肽对纳米结构进行功能化修饰。该肽与 9E10 杂交瘤细胞克隆分泌的抗 c-myc 抗体的 K_D 值为 1.77 nM。
2. 在含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素的完全培养基中，将杂交瘤细胞接种于 T75 培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。维持细胞密度为 4 ×10⁵ 个细胞/ml。
3. 进行细胞分泌研究时，通过离心收集 T75 培养瓶中的细胞，用无血清 RPMI-1640 培养基（SFM）洗涤两次以去除已分泌的抗体，并将细胞密度调整至 4 ×10⁶ 个细胞/ml。
4. 收集细胞并在接种至 LSPR 芯片前检测细胞活力。
5. 使用微量移液器将 50 µl 细胞悬液手动加样至 LSPR 芯片表面。数分钟后，有 25 至 50 个细胞黏附于 LSPR 芯片表面。
6. 利用微流控灌注系统，用新鲜的 SFM 洗去未黏附的悬浮细胞。
7. 选择与细胞距离较近（在 10 μm 范围内）但未与细胞重叠的 LSPR 阵列进行成像。
8. 为确保检测信号特异性来源于分泌的抗 c-myc 抗体，需分别引入含有或不含抗体的细胞培养基，以及在溶液中加入过量 c-myc 肽以饱和结合位点、阻断抗体结合能力的抗体样本进行对照实验。
9. 每次实验结束后，使用饱和浓度的抗 c-myc 抗体溶液（250 nM）对传感器进行校准。该步骤有助于标准化传感器响应，并根据每次实验的生物功能化情况确定结合位点的占有率。
10. 使用图像配准软件校正 X 和 Y 方向的漂移。

结果

在典型的活细胞分泌研究中，会同时进行多种模式的数据采集。图3展示了LSPRi图像与透射光照明图像的叠加，其中LSPRi图像突出显示了方形阵列，而透射光图像则突出了左下方的细胞。通常数据采集持续3小时，随后引入分析物的饱和溶液，用于下文所述的归一化计算。通过自动切换滤光片组，还可将荧光成像整合到数据采集流程中。在图4中，经荧光膜染料罗丹明DHPE染色的细胞显示出类似伪足的突起（箭头所示）。如果此类突起与阵列发生重叠，则可能导致蛋白分泌的假阳性信号。采用多种成像模式有助于识别此类情况。

图5显示了在向c-myc功能化的阵列引入市售抗c-myc抗体的饱和溶液（400 nM）前后获得的光谱数据。本实验中未使用细胞。光谱显示出红移现象以及强度的增加。两条曲线下的面积差异导致在CCD相机的LSPRi模式下阵列图像强度的增强。已开发出一种非线性最小二乘法数据分析方法，用于从光谱中推断表面结合配体的占有率。^30,31

实验结束时，饱和强度值（即， 分数占据率 ≈ 1）用于通过以下公式计算每个阵列的标准化响应：

其中分别表示时间点 t 的归一化强度、实验开始时的初始强度、最终饱和强度以及在时间点 t 测得的阵列强度。

两个阵列的归一化值如图6所示。其中一个阵列位于待研究细胞10 µm范围内，另一个作为对照的阵列则距离细胞130 µm。与对照阵列平稳的响应相比，靠近细胞的阵列其归一化响应出现突然升高，表明存在局部的分泌抗体爆发事件。

图1. 传感器设计。一幅图示典型活细胞分泌实验几何结构的示意图。 细胞（蓝色球状体）被放置在局域表面等离子体共振（LSPR）芯片上，该芯片包含阵列式生物功能化的金纳米结构。在放大视图中，感兴趣的细胞分泌物（本例中为Y形分子表示的抗体）在结合到功能化纳米结构表面时被检测到。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 光学装置示意图。 氙灯发出的光首先通过一个长通滤光片（LP）进行过滤。该光经线偏振片（P1）线性偏振后，通过一个40倍、数值孔径为1.4的物镜照射到样品上。散射光由同一物镜收集，并通过一个正交偏振片（P2）。在收集的光路中插入一个50/50的分束器（BS），以实现光谱和成像的同步分析。右上角：九个独立纳米结构的原子力显微镜图像，纳米结构之间的间距为300 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 活细胞局域表面等离子体共振成像研究。 一幅透射光与局域表面等离子体共振成像（LSPRi）的融合图像，显示一个杂交瘤细胞（左下）被12个阵列包围。此图为对比度增强图像。比例尺为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 活细胞荧光研究。 使用罗丹明 DHPE（一种膜染料）染色的单个杂交瘤细胞的荧光伪彩图像。在荧光成像模式下，阵列通常不可见，但在此图像中，右下角可见一个邻近的阵列，呈黑色方块状。可以看出细胞与阵列是分离的，但细胞向外延伸出触手样的突起（可能是丝状伪足或片状伪足）（箭头所示）。比例尺为 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. 光谱模式。 从经 c-myc 功能化的阵列在引入 400 nM 的抗 c-myc 抗体溶液前后所获得的光谱。本研究中不存在细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 单细胞分泌。 位于单个细胞15 µm范围内阵列的响应与位于130 µm远处（对照组）阵列的响应。比例尺为10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究中描述的LSPR成像技术相较于检测细胞分泌物的传统方法具有诸多优势。首先，本技术的时间分辨率为秒级，而商业化的替代方法——一种名为EliSpot的免疫夹心法，其典型时间分辨率通常为2至3天^7,32。因此，我们能够解析蛋白质分泌速率的突发性变化，如图6所示。其次，芯片上分布的阵列使得分泌信号可在空间和时间上被追踪，从而实现与基于扩散的细胞分泌模型进行更严格的比较。此外，像图6中所示的对照阵列可用于扣除图像中通常由仪器因素（如焦距漂移）引起的全局性变化。第三，本技术无需对细胞进行任何修饰。若需要，实验可结合常用的标记物（如荧光蛋白），但若担心此类标记可能对细胞活力或稳态产生负面影响，则本方法无需标记的特性使其无需使用这些标记物。第四，通过使用光谱数据，我们已证明可计算出表面结合配体的分数占有率的定量信息。

制备金属纳米颗粒的方法中，存在多种可替代电子束光刻（EBL）的技术。然而，我们发现EBL在优化纳米结构和阵列尺寸方面具有显著的灵活性，能够更好地适应所研究的光学系统和细胞特性。此外，芯片可通过等离子体灰化法轻松再生，这一点也至关重要。通过这种方式，一块典型的芯片可重复使用数十次。生物功能化步骤的具体细节需根据特定应用进行调整。本文所述方案采用相对较小的c-myc肽配体对表面进行共轭修饰。对于抗体等较大配体，通常需要更大的间距，因此需要更高的SPO与SPN/SPC比例。无论如何，在活细胞实验中，形成完整的自组装单分子膜（SAM）层对于防止非特异性结合至关重要。总体而言，分子量较大的分析物更易于通过局域表面等离子体共振（LSPR）检测到。因此，在单细胞层面应用时，该技术可能不适用于检测如细胞因子等小分子蛋白质的分泌。

目前的实验装置已用于研究单个非贴壁细胞。存在大量分泌型信号蛋白和囊泡，本研究所报告的结果可直接适用于这些分子。例如癌胚抗原（CEA），数十年来一直被用作癌症的诊断标志物。已知结肠癌细胞以每细胞每小时数千个分子的速率分泌CEA，其分子量为180 kDa，超过IgG抗体的分子量。目前认为CEA参与自分泌和旁分泌信号通路，但这些分泌过程的空间-时间特性从未被测量过。我们的技术可直接解答这些信号相关问题。本研究的一个延伸方向是测量单个细胞CEA分泌的空间-时间特性³³。未来的工作还将聚焦于将LSPRi技术与贴壁细胞的二维和三维细胞培养体系相结合。通过整合能够并行检测多种分泌蛋白的多重阵列，该技术有望为研究细胞分泌物及其对邻近细胞的影响打开一扇新的窗口。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 mm 直径玻璃盖玻片	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	170±5 µm 为最佳厚度
聚甲基丙烯酸甲酯	Microchem	PMMA 950 A4
乳酸乙酯甲基丙烯酸甲酯	Microchem	MMA EL6
电子束蒸发仪	Temescal	FC-2000
电子束光刻系统	Raith	Series 150
乙醇	Sigma-Aldrich	459836
丙酮	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 铬蚀刻剂	Cyantek	CR-7
扫描电子显微镜	Zeiss	Ultra 55
原子力显微镜	Veeco	Nanoscope III
等离子体灰化系统	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
表面等离子体共振系统	Biorad	XPR36
裸金芯片	Biorad	GLC 芯片	经等离子体灰化以去除单分子层
1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺	Thermo	22980
N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)	Thermo	24510
戊胺-生物素	Thermo	21345
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E9508
中性亲和素	Thermo	31000
磷酸盐缓冲液	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
倒置显微镜	Zeiss	Axio Observer	显微镜配备 40X 油浸物镜；CO2 及湿度培养系统（Pecon GmbH）
CCD 相机	Hamamatsu	Orca R2	热电制冷（16 位）
光谱仪	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc 肽 HyNic 标签	Solulink	SP-E003
单克隆抗 c-myc 抗体	Sigma-Aldrich	M4439
杂交瘤细胞系	ATCC	CRL-1729
抗生素-抗真菌溶液（100×）	Sigma-Aldrich	A5955
无血清 RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11835-030
胎牛血清	ATCC	30-2020
罗丹明 DHPE	Life Technologies	L-1392