解析与成像Mycobacterium abscessus在斑马鱼胚胎中的致病机制及索状结构

摘要

光学透明的斑马鱼胚胎被广泛用于实时研究和观察病原微生物与先天免疫细胞之间的相互作用。通过将脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）显微注射结合荧光成像技术，可在斑马鱼胚胎中深入分析其关键致病特征，例如索状结构的形成。

摘要

斑马鱼（Danio rerio胚胎越来越多地被用作感染模型，以研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中的功能。 获得大量胚胎的便捷性、胚胎因体外发育而易于操作、其光学透明性，以及丰富的遗传学/免疫学工具和转基因报告基因品系资源，共同赋予了该模型系统的多功能性。 在这方面，本文描述了斑马鱼的使用作为一种 体内 研究时间顺序的模型系统 脓肿分枝杆菌 感染。该人类病原体可根据细胞壁组成呈现光滑型（S）或粗糙型（R）变异体，其相应的毒力可在斑马鱼胚胎和幼鱼中进行成像与比较。将S型或R型荧光标记的变异体直接显微注射至血液循环中 通过 尾静脉注射则分别导致慢性或急性/致死性感染。该生物系统可实现对分枝杆菌索状结构在促进脓肿形成中作用的高分辨率可视化与分析。此外，结合使用荧光标记的细菌与携带荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼品系，为宿主-病原体相互作用的多色成像提供了独特机会。本文详细描述了制备均一 M. abscessus 接种物制备以及用于斑马鱼胚胎的静脉注射，以便后续对与巨噬细胞相互作用进行荧光成像。这些技术为未来研究涉及索状结构形成缺陷的突变体开辟了途径，并致力于阐明其对 M. abscessus 在完整脊椎动物中的致病性

引言

Mycobacterium abscessus 是一种新发的病原体，可在人类中引起多种临床综合征，包括皮肤感染以及严重的慢性肺部感染，后者多见于免疫功能低下者和囊性纤维化患者^1,2,3,4。M. abscessus 还被认为是导致人类医院内感染和医源性感染的主要快速生长分枝杆菌之一。此外，近年来多项报道指出，M. abscessus 可能穿越血脑屏障，并在中枢神经系统（CNS）中引发严重病变^5,6。尽管属于快速生长型分枝杆菌，M. abscessus 仍表现出多种与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）相似的致病特征，包括可在肉芽肿结构中长期潜伏以及在肺部形成干酪样病变的能力⁷。更令人担忧的是，M. abscessus 对抗生素的敏感性较低，导致这些 感染极难治疗，治疗失败率显著升高^8,9。该菌种构成重大威胁的主要原因在于其对抗生素的固有耐药性，这已成为公共卫生机构高度关注的问题¹⁰，并成为肺移植的禁忌证之一¹¹。

M. abscessus 呈现光滑（S）或粗糙（R）的菌落形态型，可导致不同的临床结局。与S型菌株相比，R型细菌倾向于首尾相连生长，形成绳索状或 cords 状结构。

方案

斑马鱼实验操作必须遵守相关机构和政府的法规。本研究中的斑马鱼实验在蒙彼利埃大学进行，遵循欧盟关于实验动物管理的指导方针（http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm），并已获得编号为 CEEA-LR-13007 的批准。

1. 试剂与显微注射设备的准备

1. 通过将 0.06 g Instant Ocean 海盐溶解于 1 L 蒸馏水中制备鱼水³¹，然后经高压灭菌（120 °C，20 分钟）并储存于 28.5 °C，可保存长达 1 个月。
2. 通过将 1 g 亚甲蓝溶解于 1 L 蒸馏水中制备亚甲蓝溶液。向 1 L 鱼水中加入 300 µl 亚甲蓝溶液以制得蓝色鱼水，随后高压灭菌并储存于 28.5 °C，可保存长达 1 个月。
   注意：在鱼水中添加亚甲蓝可防止霉菌生长。
3. 磷酸盐缓冲液（PBS）的制备
   1. 通过将 5.696 g Na₂HPO₄、680 mg KH₂PO₄、969 mg KCl 和 78.894 g NaCl 溶解于 1 L 蒸馏水中，用 HCl 调节 pH 至 7.0，制备 10 X PBS 储存液。为获得 1 X PBS，取 100 ml 10 X PBS 溶液加入 900 ml 蒸馏....

结果

尽管可注射多种解剖位点³²，尾静脉注射常用于建立全身性感染，以便后续进行生存实验、细菌负荷测定、吞噬活性分析或类绳索结构形成等研究。尾部肌肉注射则用于评估巨噬细胞在注射部位的募集情况（图3A）。为研究和比较M. abscessus粗糙型（R）与光滑型（S）变异株的毒力，可将荧光标记的细菌悬液注射至30 hpf胚胎的尾静脉中（图3A）¹⁹。与S型变异株相比，R形态型在斑马鱼胚胎中引发更强烈且致死性的感染（图3B），其特征是在中枢神经系统（CNS）内迅速形成细菌性脓肿（图3C）。R型和S型变异株的全身注射均可导致中枢神经系统感染，其病理学差异和毒力表型可通过荧光显微镜观察（图3C）、每尾鱼的菌落形成单位（CFU）计数（图3D）或图像的荧光像素计数（FPC）定量分析（图3E）进行量化。重要的是，CFU与FPC的测定结果具有相关性，均表明在感染后3天.......

讨论

斑马鱼最近已成为利用宽场和共聚焦成像实时研究细菌感染动态的优良脊椎动物模型系统³⁶将分散的分枝杆菌悬液（方案2.2）与显微注射方法（方案4）相结合，可实现可重复的系统性感染，并能够后续监测和可视化感染进展过程，特别关注细菌与宿主巨噬细胞之间的相互作用。毒力 M. abscessus 体内 可借助野生型的使用进行研究 金色 斑马鱼³⁷研究相互作用 M. abscessus 以及宿主髓系细胞，可使用多种转基因斑马鱼品系，例如 Tg(mpeg1:mCherry) 以观察巨噬细胞¹⁹. 其他转基因报告基因品系，例如 as Tg(mpx:GFP)³⁸ 或 Tg(lyz:DsRed)³⁹ 分别使用绿色或红色的中性粒细胞，也可用于研究这些粒细胞在应对感染时的特定作用。

M. abscessus，尤其是粗糙型（R型）变异株，具有自然形成大.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BBL MGIT PANTA	BD 生物科学	245114
牛血清白蛋白	Euromedex	04-100-811-E
牛肝过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 琼脂	BD 生物科学	262710
Difco Middlebrook 7H9 肉汤	BD 生物科学	271310
甲磺酸乙酯间氨基苯甲酸盐（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040
油酸	Sigma-Aldrich	O1008
多聚甲醛	Delta Microscopie	15710
酚红	Sigma-Aldrich	319244
吐温 80	Sigma-Aldrich	P4780
琼脂	Gibco Life Technologie	30391-023
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich
Instant Ocean 海水盐	Aquarium Systems Inc
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Inc	BF100-78-10	1 mm 外径 × 0.78 mm 内径
微量移液管拉制仪	Sutter Instrument Inc		Flamming/Brown 微量移液管拉制仪 p-87
显微注射仪	Tritech Research		数字显微注射仪，MINJ-D
镊子	Sciences Tools Inc		Dumont # M5S
微量加样器吸头	Eppendorf