双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

摘要

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是生物学中的关键分子事件。然而，由于传统光学显微镜的分辨率受衍射极限限制（约250 nm），在细胞内以足够高的分辨率和灵敏度可视化PPIs仍具挑战性。通过将双分子荧光互补（BiFC）技术与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在单分子灵敏度和纳米级空间分辨率下实现细胞内PPIs的可视化。BiFC是一种常用的以荧光对比可视化PPIs的技术，其原理是将一个荧光蛋白拆分为两个无荧光的片段。PALM是一种新兴的超分辨率显微技术，可用于在纳米尺度和单分子水平上成像生物样本，该技术使用光可转换荧光探针，例如光激活荧光蛋白（PA-FPs）。BiFC-PALM技术通过拆分PAmCherry1实现，该PA-FP具有单体性质、良好的单分子亮度、高对比度以及适用于化学计量比测量等优点。当在第159和160位氨基酸之间拆分时，PAmCherry1可构建成一种高效的BiFC探针，在37 °C下能特异性地重组，并对PPIs具有高度特异性且非特异性重组水平低。以Ras-Raf相互作用为例，展示了BiFC-PALM如何在纳米尺度和单分子分辨率下探测蛋白质相互作用。此外，还可利用单分子追踪（smt-）PALM在活细胞中追踪它们的扩散行为。本实验方案讨论了设计BiFC-PALM融合蛋白时需考虑的因素，详细说明了样品制备、图像采集和数据分析步骤，并展示了一些典型结果。由于具备高空间分辨率、高特异性和高灵敏度，BiFC-PALM是研究完整生物样本中PPIs的有力工具。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是生物学的基础¹，并通过多种时空机制在广泛的时间和空间尺度上受到严密调控。例如，关于细胞膜上细胞信号传导的研究揭示了动态的纳米级空间区室，这些区室可促进特定的PPI及细胞过程²。因此，以足够的空间和时间分辨率、高特异性和高灵敏度探测生物系统中PPI的能力，是实现对生物学机制性理解的关键。

双分子荧光互补（BiFC）是目前少数几种能够在亚细胞分辨率下实现活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）可视化的工具之一^3–5。该技术相对简单，其原理是将一个荧光蛋白拆分为两个无荧光的片段；当这两个片段分别与相互作用的蛋白质融合表达并因蛋白相互作用而靠近时，可重新组装形成完整的荧光蛋白，从而产生荧光信号。若设计得当，BiFC探针在不存在蛋白质相互作用的情况下不应发生自发重组。因此，BiFC实验中的荧光信号仅在PPI发生时出现，从而实现对PPI的高度特异性直接可视化。以荧光作为检测信号的其他优势还包括高灵敏度、亚细胞分辨率，以及与高通量和高内涵筛选实验的兼容性等。得益于这些优点，目前已开发出多种基于不同母体荧光蛋白的BiFC探针。然而，与所有基于传统光学显微镜的检测技术一样，BiFC的空间分辨率受限于光的衍射极限，约为250 nm。这使得在纳米尺度上研究PPI的调控变得具有挑战性；而正如前文所述及脂筏⁶ 和Ras纳米簇⁷所例证的，纳米尺度是理解许多细胞过程（如信号转导）的关键长度尺度。

BiFC 已与光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy, PALM）^8,9 相结合，以克服成像蛋白质相互作用（PPIs）时空间分辨率的限制¹⁰。PALM 是一种新兴的超分辨率显微技术，通过单个荧光分子的随机激活和亚衍射极限定位，突破了荧光成像中的衍射极限。在每一次激活循环中，一个荧光分子会发射出数百至数千个光子，在探测器上形成一个单分子图像。尽管该图像受衍射限制（宽度约 250 nm），但其质心位置可被更精确地确定，精度通常在 10–50 nm 范围内，具体取决于所检测到的光子数量。通过对样品中每个荧光分子依次进行激活和定位，即可重构出高分辨率图像。在活细胞中进行的单分子示踪（smt-）PALM 技术，还能从单个细胞中获取数千条蛋白质扩散轨迹¹¹。重要的是，PALM 使用特殊的荧光探针，例如光激活荧光蛋白（photoactivatable fluorescent proteins, PA-FPs），以实现随机激活。由于 BiFC 和 PALM 均使用荧光蛋白，因此研究人员通过在氨基酸 159 和 160 之间切割常用于 PALM 的光激活荧光蛋白 PAmCherry1，将其分为两个片段，从而实现了两种技术的结合。

基于分裂型PAmCherry1的BiFC系统在两个片段自发重组时表现出较低的背景信号。当这两个片段（RN = 第1-159位氨基酸；RC = 甲硫氨酸+第160-236位氨基酸）分别与一对相互作用的蛋白质进行基因标记时，即使在37 °C条件下且无需低温孵育，也能高效重组形成完整的PAmCherry1蛋白，而其他BiFC组合（如母体mCherry¹²）则不具备这一特性¹³。此外，重组后的PAmCherry1蛋白保留了母体PAmCherry1的光物理特性，例如高对比度、中等光子产率以及快速光激活能力等，这些特性对于精确的单分子定位和高分辨率PALM成像至关重要。

本方案描述了在U2OS细胞中利用分裂PAmCherry1进行BiFC-PALM成像以研究Ras-Raf相互作用的方法（图1A）。第一步是设计表达PAmCherry1片段（即，RN和RC）与目标蛋白融合蛋白的构建体。理论上，对于每一对候选蛋白（A和B），需要测试八种融合蛋白组合：RN-A/RC-B；RN-A/B-RC；RC-A/RN-B；RC-A/B-RN；A-RN/RC-B；A-RN/B-RC；A-RC/RN-B；以及A-RC/B-RN。通过考虑候选蛋白的结构或生化特性，该过程通常可以简化。以Ras蛋白为例，其在翻译后会被修饰于C末端的CAAX盒（C=半胱氨酸；A=脂肪族氨基酸；X=任意氨基酸），随后AAX基序被切除。因此，RN或RC只能与Ras的N末端融合，从而将融合蛋白组合的数量减少至四种（图1B）。对于Raf蛋白，则使用其Ras结合域（RBD；第51-131位残基），该结构域可在任一末端进行标记。由此构建了以下四种融合形式：RN-KRas/RC-Raf RBD；RN-KRas/Raf RBD-RC；RC-KRas/RN-Raf RBD；以及RC-KRas/Raf RBD-RN。

此外，还需考虑片段与目标蛋白之间的连接子。通常使用约十个氨基酸的柔性连接子，因为它能够为互补作用的发生提供足够的自由度。其中一个典型的连接子是(GGGGS)x2，但也有许多其他成功应用的连接子，包括从多克隆位点（MCS）产生的随机序列¹⁴。连接子的长度可能需要根据目标蛋白的大小及其相互作用时的方向进行优化。

PAmCherry1 片段包含在一个带有侧翼多克隆位点（MCS）的小型克隆载体骨架中（参见材料列表）。目的基因可通过限制性酶切位点或无需连接的方法插入。克隆并经序列验证后，通过重组酶反应将表达盒转移至表达载体，该克隆过程具有高保真性和高效率。

接下来，将获得的表达载体转染至目标细胞系中；如果需要建立稳定细胞系，则可将其包装到慢病毒中以感染目标细胞系。瞬时转染可用于快速验证BiFC构型，但需注意潜在问题。化学试剂转染常对细胞造成应激，导致自发荧光增强；虽然全内反射荧光（TIRF）显微镜可通过限制照明体积来降低背景信号，但TIRF最适合用于发生在细胞膜上的蛋白质相互作用（PPIs）研究。此外，瞬时转染通常导致蛋白表达水平过高，远超内源性蛋白水平，这可能在检测PPIs时引发假象。因此，建议在通过初步实验确定合适的BiFC构型后，建立稳定细胞系。稳定细胞系还可通过多西环素诱导实现可调控的表达¹⁵。

感染后，细胞用抗生素进行筛选，通常使用嘌呤霉素和新霉素，每种构建体各用一种。后续的样品制备、图像采集和数据分析步骤将在实验方案中详细描述。

采用该方法，通常可在Ras-Raf RBD的BiFC-PALM图像中观察到纳米级簇的形成（图2A）。与此一致，Ras-Raf RBD的单分子跟踪-PALM轨迹显示其扩散状态呈异质性分布（图2B-D）。这些结果表明，Ras-Raf复合物在细胞膜上以多种状态存在，可能包括单体和簇状结构，具有潜在的生物学意义。本研究展示了BiFC-PALM在细胞内以纳米级空间分辨率和单分子灵敏度选择性成像蛋白质相互作用（PPI）的强大能力，而这种能力通过传统的BiFC、荧光共定位或荧光共振能量转移（FRET）方法难以实现。

在设计BiFC实验并解读结果时，必须注意大多数情况下BiFC过程是不可逆的，包括使用分裂型PAmCherry1的情况。一旦两个片段结合并形成完整的PAmCherry1蛋白，这两个片段之间的连接以及由此产生的蛋白质相互作用（PPI）将永久固定。这限制了BiFC和BiFC-PALM在监测PPI动态变化中的应用即结合动力学而非蛋白质复合物形成后的扩散动力学，有时甚至可能导致蛋白质相互作用复合物的错误定位。

设计BiFC-PALM实验时需考虑的另一个因素是荧光蛋白固有的发色团成熟延迟。当两个蛋白相互作用并使荧光蛋白片段结合后，其通常在数秒内完成重折叠（EYFP的半衰期为60秒³）。然而，随后的发色团成熟及荧光信号的产生则需要数分钟时间。尽管在分裂型Venus（一种快速折叠的YFP变体）重组后10分钟内即可检测到荧光信号 ，但一般情况下其成熟的半衰期通常约为60分钟¹⁶。分裂型PAmCherry1也被观察到具有类似的成熟速率。因此，BiFC和BiFC-PALM目前并不适合用于监测蛋白质相互作用（PPI）的实时动力学过程；其他方法，如FRET以及最近开发的二聚化依赖性荧光蛋白¹⁷，可能更适合此类研究目的。

方案

1. 克隆

1. 确定要克隆的构型并选择连接子。如以下所述，在目标蛋白的N端或C端添加片段标签，以避免干扰其正常定位。使用柔性连接子，例如(GGGGS)x2。
2. 将目标蛋白与PAmCherry1片段进行基因标记。一种可选方法是使用材料列表中所列的克隆质粒，这些质粒包含片段RN（PAmCherry1残基1-159）和RC（Met加上PAmCherry1残基160-236），并带有侧翼MCS序列。
   1. 通过反向PCR（或限制性酶切）在插入位点线性化含有RN和RC片段的质粒。反向PCR所用引物列于表1。以下是作者实验室使用的PCR方案示例（本方案所用具体材料见材料列表）。
      1. 将PCR反应体系混合，加水至终体积50 µl：向薄壁PCR管中加入水、25 µl 2x预混液、正向和反向引物各0.5 µl（20 µM稀释储备液，终浓度0.2 µM）以及1 ng模板。使用以下循环条件：98 °C预变性30秒，30个循环（98 °C变性7秒，68 °C退火延伸2分钟），最后72 °C延伸10分钟。
   2. 对目标基因进行PCR扩增，以便插入至含有RN和RC片段的线性质粒中。按照步骤1.2.1的方法进行PCR，68 °C延伸时间根据片段长度调整。引物设计应包含柔性连接子序列的突出端，例如用于(GGGGS)x2的GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT，以及与线性化RN和RC质粒末端具有15个碱基同源性的序列，以用于重组。
      注：若使用表1中的引物线性化质粒骨架，则目标蛋白引物的突出端序列见表2。
   3. 用DpnI消化PCR产物以去除PCR模板。直接向50 µl PCR反应体系中加入0.5 µl DpnI（20 U/µl）。37 °C孵育1小时，80 °C加热灭活20分钟。若后续步骤中仍有模板背景残留，可增加酶量或延长消化时间。
   4. 按照制造商说明，通过离心柱纯化PCR产物。
   5. 进行无需连接酶的反应，将含有RN或RC片段的线性质粒与目标基因连接。测定纯化后PCR产物的浓度：将50 ng线性质粒与50 ng目标基因混合，加入1 µl酶预混液，并用去离子水补足至总体积5 µl。50 °C孵育15分钟，置于冰上，再加入20 µl TE缓冲液。
   6. 将重组质粒转化至感受态细菌¹⁸。
   7. 挑选2-4个或更多（根据需要）单菌落进行过夜培养。向14 ml聚丙烯圆底管中加入5 ml LB液体培养基和5 µl卡那霉素（50 mg/ml储备液），用无菌接种环挑取选定的菌落加入管中。37 °C、225 rpm振荡培养过夜。
   8. 取1 ml过夜培养物制备甘油菌种保存¹⁹，其余部分按制造商说明进行质粒小提。
   9. 进行测序以确定正确克隆。若使用材料列表中的克隆质粒，可根据需要分别使用M13正向和反向引物（在不同反应中）获得融合构建体的完整序列。使用NCBI（美国国家生物技术信息中心）的BLAST等比对工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi）与预期序列进行比对。
   10. 通过重组酶反应将测序验证后的构建体转移至表达质粒。
       1. 向1 µl酶预混液中加入75 ng目的质粒（如用于瞬时转染的pcDNA或用于慢病毒包装的pLenti²⁰）和50 ng重组克隆质粒，并用去离子水补足至总体积5 µl。25 °C孵育1小时，然后加入5 µl TE缓冲液。
          注：对于慢病毒包装和稳定细胞系构建，每个构建体应使用不同的目的质粒，例如一个带有嘌呤霉素抗性，另一个带有新霉素抗性，以便对转导细胞进行双重筛选。同时考虑各质粒的启动子选择，例如使用组成型 巨细胞病毒（CMV）启动子实现高水平表达，或使用带有TetO操纵子的CMV启动子实现可调节的强力霉素诱导表达。
       2. 取5 µl转化感受态细菌，并按照步骤1.2.6至1.2.8进行质粒小提，但使用相应的抗生素（通常为氨苄青霉素）。
3. 确定最佳的BiFC构型。
   1. 将表达质粒共转染至U2OS细胞（或其他选定细胞）。
      1. 向8孔#1.5玻璃底共聚焦培养板的每孔中加入350 µl不含酚红和抗生素的DMEM培养基，并补充10% FBS。每孔接种约7.5 × 10⁴个细胞，使次日细胞融合度达到70%-90%。
      2. 接种后第二天，使用优选的转染试剂并按照制造商说明，在每孔中以不同构型共转染表达质粒。
         1. 对于每孔，将125 ng每种表达质粒加入0.6 ml离心管中的50 µl无血清低血清培养基中，上下吹打混匀。将1 µl转染试剂沿管壁中心直接加入培养基中，轻轻振荡混匀，室温静置30分钟。
         2. 将培养板每孔中的培养基减少约一半。将转染混合物逐滴加入各孔，轻轻摇晃混匀。37 °C、5% CO₂条件下培养24-48小时。转染次日更换培养基。
   2. 从第2.1.4步开始，按照方案2的方法在荧光显微镜下观察细胞。
      注：若表达水平较高且相机对PAmCherry1相对较低的光子输出足够敏感，则可在标准荧光显微镜下成像。成像前可使用紫外滤光片（405 nm）激活重组的PAmCherry1分子，随后使用绿色激发（561 nm）滤光片进行成像。
4. 在适用情况下，可通过例如在其中一个目标蛋白中引入破坏相互作用的点突变来构建阴性对照。对拟突变蛋白的克隆质粒及其选定构型进行定点突变²¹。
5. 通过将构建体包装成病毒颗粒并感染U2OS细胞（或其他选定细胞系）来构建稳定细胞系。建议考虑使用可诱导（四环素）表达系统¹⁵，以便在成像前诱导表达，特别是在BiFC不可逆性持续时间较长或需要可调节表达的情况下。
   警告：病毒操作属于生物安全二级（BSL-2）操作。尽管近年来的病毒包装系统已极大降低了复制型病毒产生的可能性，但仍存在一定风险。相关参考资料见http://www.cdc.gov/biosafety/publications/。
   1. 使用慢病毒或逆转病毒目的载体重复步骤1.2.10²⁰。将过夜培养体积增至100 ml，以进行中提并获得更高纯度的质粒。
   2. 第1天：为每个待包装的构建体，在10 cm培养皿中接种约2 × 10⁶个293T/17细胞。
   3. 第2天：使用选定的转染试剂并按照制造商说明准备转染反应。
      1. 在无菌水中配制包装质粒预混液，包装质粒1和2终浓度为250 ng/µl，包装质粒3终浓度为100 ng/µl。将10 µl包装质粒预混液和2.5 µg目标质粒加入5 ml聚丙烯圆底管中的1 ml无血清低血清培养基中，上下吹打混匀。将20 µl转染试剂沿管壁中心直接加入培养基中。
         1. 轻轻振荡混匀，室温孵育30分钟。吸除细胞培养基约一半，将转染混合物逐滴加入培养皿边缘。轻轻摇晃混匀后，置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。同时将每板10 ml培养基置于松盖试管中，进行温度和CO₂平衡。
      2. 第3天：用预平衡的培养基轻轻更换原培养基，将细胞放回培养箱。另取一管培养基松盖孵育。
         注：合胞体（即多核大细胞）的形成可能是包装成功的标志。但此时细胞状态脆弱，易脱落。换液时应将移液器倾斜至水平，沿培养皿边缘逐滴加入培养基。
      3. 第4天：用注射器收集培养基，经0.45 µm孔径滤器过滤至洁净的50 ml离心管中。用预平衡的培养基轻轻替换原培养基。
      4. 第5天：重复步骤1.5.3.3的操作再次收集病毒液，并将相同滤液合并至同一50 ml离心管中。每管加入6 ml病毒浓缩液并混匀。4 °C静置至少24小时，直至病毒沉淀。
         注：根据细胞状态，病毒可进行第三次收集。
      5. 在4 °C条件下以1,500 × g离心15分钟浓缩病毒。吸弃上清，将沉淀重悬于250 µl培养基中。病毒可立即用于感染，或分装为50 µl每份，于-80 °C保存长达一年。
      6. 在6孔板中每孔接种约3 × 10⁵个U2OS（或靶细胞）细胞（每孔2 ml含10% FBS的DMEM），用于感染，使感染时细胞融合度约为50%。
      7. 次日，吸除约一半培养基，使每孔剩余约1 ml。每孔共感染50 µl浓缩病毒液。每孔加入1 µl聚凝胺（8 mg/ml）。37 °C、5% CO₂条件下孵育。次日更换培养基，再培养一天后开始抗生素筛选。
         注：加入病毒量可根据所需感染效率调整。可通过qRT-PCR对病毒进行滴定。
      8. 加入抗生素以筛选感染细胞。需设置未感染细胞的独立孔作为“哨兵细胞”以检测筛选效果。孵育2-7天，或直至筛选完成。
         注：有效浓度应先进行滴定，通常嘌呤霉素为1.0 µg/ml，新霉素为1.0 mg/ml。
      9. 将筛选后的细胞扩增至更大的10 cm培养皿中，并进入方案2。

2. 成像固定细胞

1. 准备用于成像的样本
   1. 通过向8孔#1.5玻璃底培养皿中加入250 µl的1 M NaOH溶液，孵育至少1小时，然后用PBS彻底清洗，以清洁培养皿。
      注意：未经处理的培养皿通常会导致较高的背景信号。此外，细胞可能对残留的NaOH敏感，若未彻底清洗玻璃表面（可能需要多达10次洗涤），将影响细胞贴壁。如有必要，清洗后可将清洁的培养皿在PBS中孵育过夜（O/N）。对于敏感的细胞系，可提高接种密度（例如，初始汇合度为50%–60%）以改善贴壁。
   2. 每孔加入350 µl含10% FBS的无酚红DMEM培养基，接种约5.5 × 10⁴个U2OS稳定表达细胞，确保成像时细胞状态健康且未过度汇合。
   3. 根据实验需要进行相应处理，例如加入四环素以诱导蛋白表达。
   4. 成像前立即固定细胞。
      1. 固定前，配制新鲜的多聚甲醛（PFA）溶液——3.7% PFA溶于含0.1%戊二醛（GA）的1× PHEM缓冲液中。配制10 ml PFA溶液时，称取0.37 g PFA，转移至1.5 ml离心管中，加入1 ml蒸馏水和30 µl 1 M NaOH，涡旋混匀。在70 °C加热，并每隔1–2分钟涡旋一次，直至PFA完全溶解。
      2. 将溶解的PFA转移至15 ml锥形管中，加入3.8 ml蒸馏水、5 ml 2× PHEM缓冲液和20 µl 25%戊二醛，涡旋混匀。2× PHEM缓冲液的组成为：120 mM PIPES、50 mM HEPES、20 mM EGTA和16 mM MgSO₄，用10 M KOH调节pH至7.0。该固定液可在4 °C保存数天。
         警告：PFA和GA均为有害物质。应在通风橱中配制，并在操作时穿戴适当的防护装备。避免吸入或直接皮肤接触。
      3. 移除培养基，用500 µl PBS快速洗涤，每孔加入250 µl PFA固定液，在室温下孵育20分钟。
   5. 移除样本中的PFA固定液，每孔加入350 µl PBS或成像缓冲液（含100 mM Tris、30 mM NaCl和20 mM MgCl₂，pH 8.5）。
   6. 涡旋100 nm金颗粒以打破聚集体，每孔加入35 µl（终浓度稀释10倍），用于成像过程中校正载物台漂移。
2. 采集图像
   1. 打开显微镜。开启405 nm和561 nm激光器，但此时保持快门（内部或外部）关闭。开启EMCCD相机并使其冷却。确保561 nm滤光片已正确安装。
   2. 打开采集软件，设置曝光时间为100毫秒，EMCCD增益为300（范围1–1,000）。
   3. 在物镜上添加浸油，并将样本固定在显微镜载物台上。
   4. 使用明场或561 nm激光（约1 kW/cm²）将样本调至焦点。
   5. 对于Ras及其他膜蛋白的成像，使用60倍复消色差TIRF物镜（数值孔径1.49），并将显微镜设置为TIRF模式。调节激发激光，使其偏心照射TIRF物镜的后光圈，从而使激光在到达样本时发生偏折。持续调节激光，直至达到临界角并发生全反射。寻找视野中包含多个金颗粒的细胞，设定一个包含该细胞（或细胞内某区域）及金颗粒的兴趣区域。
      注意：TIRF可降低激发激光的穿透深度，减少离焦背景信号。此外，视野中金颗粒越多，漂移校正的准确性通常越高。
   6. 如有自动对焦系统，启用以校正样本在z方向的漂移。否则，在采集过程中若图像失焦，需手动调节对焦。
   7. 开始采集时，先关闭405 nm激光，仅开启561 nm激光（约1 kW/cm²），以防已有足够的激活（通常在表达水平较高时发生）。否则，以最低出厂功率（0.02 mW或0.01 W/cm²）开启405 nm激光，并根据需要逐步增加（每次0.1 mW），直至每帧出现数十个分子，或单个分子之间充分分离。
   8. 在数据采集过程中，逐步增加405 nm激光功率，以保持荧光点密度大致恒定。
      注意：在较低的405 nm激发功率下，部分PAmCherry1可能已被激活。随着这些分子发生光漂白，剩余可光激活的PAmCherry1分子数量减少，因此需要更高的光子通量以维持每帧中荧光分子的密度。
   9. 持续采集图像，直至在高405 nm功率（2.5–10 W/cm²）下不再有新的激活事件出现。
      注意：总采集时间取决于蛋白表达水平及互补效率。
3. 处理图像
   注意：目前有许多开源的图像处理软件可供选择，例如ThunderSTORM（https://code.google.com/p/thunder-storm/）和QuickPALM（https://code.google.com/p/quickpalm/）。此处以自定义的Matlab程序包wfiread为例，简要说明典型的图像处理流程。但未来版本可能与本文描述不完全一致。 如使用其他软件进行图像处理，请参考其用户文档。
   1. 下载图像处理软件（补充代码文件）或访问http://www.ohsu.edu/nan获取最新版本。打开Matlab并加载wfiread软件（该软件已置于默认路径中）。
   2. 查看原始图像序列并确定兴趣区域。通过左键点击并拖动框选所需区域，选择待处理的图像堆栈部分。若采集时未缩小兴趣区域（约256×256像素），可选择更小区域以减少计算时间。如需取消选择并处理整帧图像，可在图像任意位置右键点击。
   3. 输入待处理的帧范围。
   4. 在图像上左键点击并围绕一个孤立且形态均匀的金颗粒拖动小框进行选择。在“Particle Tracking”（颗粒追踪）模块中点击“Track”按钮，将显示所选金颗粒在图像堆栈中的位置变化图，反映漂移程度。
   5. 重复此过程，尽可能多地追踪金颗粒，并确定哪些颗粒共同移动（颗粒将以不同颜色编码）。理想情况下，整体漂移应不超过一个像素。
   6. 逐一选择共同移动的金颗粒，点击“Particle Tracking”下的“Add Marker”按钮。绿色十字将出现，表示该颗粒已被添加为标记点，用于漂移校正。
   7. 根据需要微调Sigma Range、Smoothing Range和Threshold参数。点击“Find Particle”按钮测试设置效果。程序将框选待处理的颗粒，未被选中的将被排除。应选择PAmCherry1分子，即形态较圆且亮度较高的颗粒。
   8. 点击“Make Coord File”按钮开始处理图像，并保存生成的文件。
      注意：程序将遍历设定帧范围内的每一帧，识别所有荧光点，并通过高斯拟合确定其中心坐标。生成的.cor文件将存储所有处理后的单分子图像的坐标及其他拟合参数。
4. 图像后处理并生成PALM图像
   注意：其他软件可能在坐标提取后直接生成图像。
   1. 在Matlab中启动“palm”程序包，并加载刚刚创建的.cor文件。
   2. 在使用坐标生成PALM图像前，需对单个坐标（每个来自一次“定位事件”）进行排序。最优排序参数可能因实验设置和荧光探针而异。
      1. 对于PAmCherry1，使用以下参数：Combining Frame（合并帧数）— 8；Combining Distance（nm）（合并距离）— 100；Minimum RMS（最小均方根）— 4；Minimum Fit Goodness（最小拟合优度）— 0.25；Max. Eccentricity（最大偏心率）— 1.4。相关参数的进一步解释见讨论部分。
   3. 点击“Sort”按钮，生成可用于高分辨率图像重建的新坐标集。
   4. 输入最终图像渲染所需参数，如原始像素尺寸（nm）、渲染图像中期望的特征尺寸（nm）以及渲染图像的像素尺寸。
      注意：原始像素尺寸需根据每个实验系统单独测定。渲染特征尺寸可任意设定，但通常略高于平均定位精度。对于PAmCherry1，平均定位精度约为18 nm，因此20–30 nm的特征尺寸较为合适。需注意，定位精度是通过同一分子在多帧图像中定位坐标的**标准差**计算得出²²，而非通过将衍射极限除以检测光子数的平方根估算。至于渲染图像的像素尺寸，10 nm是良好的起始值；若设置过低，将导致未放大视图的图像文件过大。
   5. 点击“Render”按钮生成PALM图像。使用图像窗口工具栏中的+/-放大图标进行缩放。
   6. 可选：使用Ripley’s K检验或其他方法（如模拟辅助DBSCAN，SAD²³）对重建的PALM图像进行聚类分析。注意：在自定义的palm程序包中，Ripley’s K和SAD分析均已内置；对于其他软件生成的坐标，可通过额外自定义脚本执行相同分析。

3. 活细胞中单分子追踪

1. 按照方案2所述处理组织培养表面并接种细胞。由于温度和/或CO₂控制载物台可能需要特定的培养皿，请确保盖玻片具有适用于显微镜系统的适当厚度（0.17 mm）。
   1. 若进行瞬时表达，则转染细胞，并根据实验需要进行相应处理，例如添加四环素以诱导表达，并按需孵育。此步骤与方案2中所述相同。
   2. 将培养皿置于载物台培养箱上。每次安装培养皿或移动至新的感兴趣区域后，让培养皿在载物台上静置数分钟，直至温度和CO₂浓度稳定。此步骤中应屏蔽激光。若无CO₂控制条件，成像前应立即更换为不含CO₂的培养基，例如Leibovitz’s L-15。
      注意：建议使用不含酚红的培养基以降低背景荧光。
2. 按照方案2进行图像采集。但需设置适当的曝光时间（对于PAmCherry1通常为25–50毫秒）。
   注意：分子密度应低于固定细胞的密度，以确保轨迹记录时互不重叠。在像素尺寸约为160 nm、图像大小为256×256像素的采集条件下，通常仅有数十个分子较为合适。561 nm激光的功率密度设定为0.8 kW/cm²，以在降低细胞光毒性的同时维持良好的信噪比，并延长平均轨迹长度。
3. 处理图像。
   1. 使用wfiread软件包（如方案2所述）或其他软件包提取单分子坐标。
   2. 基于其他文献中报道的不同算法，使用多种单粒子追踪（SPT）软件包重建单粒子轨迹²⁴。注意：也可使用自主开发的Matlab软件包完成此步骤（未来版本可能在http://www.ohsu.edu/nan获取）。
   3. 可选：轨迹重建后，使用SPT软件包²⁴根据轨迹计算位移和扩散系数。此外，可使用变分贝叶斯单粒子追踪（vbSPT）²⁵方法确定目标蛋白的扩散状态。vbSPT的Matlab软件包及文档可在其官方Sourceforge网站获取：http://vbspt.sourceforge.net/。

结果

所示的BiFC-PALM示例为KRas G12D突变体与CRaf的Ras结合结构域（RBD）之间的相互作用（图1A）。如前所述，RN或RC片段未标记在Ras的C末端，因为这会破坏Ras的膜定位，从而影响其生物学活性。因此，可能的组合从八种减少至四种（图1B）。这四种组合均通过慢病毒感染导入U2OS细胞。细胞按照实验方案进行固定，并使用PALM系统检测BiFC信号。当开启405 nm激光时，出现荧光突然增强的细胞即被识别为具有阳性BiFC信号；在整个成像过程中，561 nm激光持续开启。这种荧光的突然变化是由于在405 nm激光照射下，BiFC重构的PAmCherry1发生光激活所致。采用该方法对样品中的多个区域进行检测，并通过计算405 nm激光高强度脉冲前后像素强度增加的平均值来确定BiFC信号强度。

如图1C所示，在四种可能的构型中，有两种构型（即RN-Ras/RC-Raf RBD和RN-Ras/Raf RBD-RC）显示出强烈的双分子荧光互补（BiFC）信号。另一种构型（RC...

讨论

BiFC 是一种常用于在细胞内检测和可视化蛋白质相互作用（PPI）的技术，而 PALM 是一种新兴的单分子超分辨率显微技术，能够对完整的生物样品进行纳米尺度成像。将 BiFC 与 PALM 相结合，可在细胞内实现具有纳米级空间分辨率和单分子灵敏度的 PPI 选择性成像。BiFC-PALM 拓展了这两种技术的应用范围，正如本研究所展示的，该方法在揭示蛋白质相互作用在其天然细胞环境中的分子细节方面展现出巨大潜力。特别是，纳米级分辨率使得能够在分子尺度上深入研究特定蛋白质相互作用的空间和时间调控机制，而这在生物医学研究中一直是一项挑战。然而，如前所述，BiFC-PALM 受限于互补反应的不可逆性以及发色团成熟速度较慢的问题。

利用分裂的PAmCherry1展示了BiFC-PALM的原理及其应用价值。PAmCherry1因其优异的光物理特性，已被广泛应用于PALM实验中。将PAmCherry1用作BiFC探针的另一个优势在于，当其与蛋白质相互作用（PPIs）偶联时，在37 °C条件下蛋白重构具有低背景、高特异性和高效率。基于这些原因，分裂PAmCherry1 BiFC探针有望成为适用于多种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜机身	Nikon	Ti-U
60倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD相机	Andor	iXon Ultra 897
561 nm激光器	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm激光器	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm二向色镜	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm滤光片	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm陷波滤光片	Semrock	NF01-405/488/568-25
温度和CO2控制载物台	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion高保真DNA聚合酶	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD克隆试剂盒	Clontech	639649
LR Clonase酶	Life Technologies	11791
Vira Power慢病毒包装系统	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE转染试剂	Roche	13873800
Lab-Tek II腔室盖玻片	Thermo Scientific	155409	#1.5玻璃底培养皿
U2OS细胞	ATCC	HTB-96
293T/17细胞	ATCC	CRL-11268
含酚红的DMEM培养基	Life Technologies	11995
无酚红DMEM培养基	Life Technologies	21063
胎牛血清	Life Technologies	10082
Leibovitz's L-15（无酚红）	Life Technologies	21083-027
低血清培养基	Life Technologies	31985
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	14040
注射器	BD Biosciences	309604
注射器滤器	Millipore	SLHV033RB
慢病毒浓缩试剂	Clontech	631231
逆转录病毒浓缩试剂	Clontech	631455
10 cm培养皿	BD Biosciences	353003
6孔培养板	BD Biosciences	353046
聚凝胺（Polybrene）	Sigma	107689
嘌呤霉素（Puromycin）	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	新霉素（Neomycin）
强力霉素（Doxycyline）	Fisher	BP2653
Tris碱	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
氢氧化钠	Sigma	S5881
多聚甲醛	Sigma	158127
戊二醛	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
硫酸镁	Sigma	M2643
氢氧化钾	Sigma	221473
氯化钠	Fisher	BP358
氯化镁	Fisher	M33
100 nm金颗粒	BBI Solutions	EM.GC100
分子生物学级水	Life Technologies	10977
DpnI酶	New England Biolabs	R0176
PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
质粒中提试剂盒	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml微量离心管	Fisher	05-408-120
1.5 ml微量离心管	Fisher	05-408-137
15 ml离心管	Fisher	05-539-12
5 ml聚丙烯圆底管	BD Biosciences	352063
14 ml聚丙烯圆底管	BD Biosciences	352059
50 ml离心管	BD Biosciences	352070
PCR管	GeneMate	C-3328-1
SOC培养基	Life Technologies	15544
LB肉汤培养基	BD Biosciences	244610
硫酸卡那霉素	Fisher	BP906
感受态细胞	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks