使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

摘要

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。

摘要

组织工程已将研究重点集中于构建用于替代功能失常或受损组织的仿生结构。三维生物打印技术在组织工程中的应用，为细胞与基质的打印提供了构建仿生组织的新方法。为实现三维生物打印而开发的实体自由成形制造（SFF）技术，采用增材制造策略，通过逐层沉积细胞液滴与水凝胶的方式进行构建。生物打印的制造过程依赖于将生物材料精确地定位至三维结构中，所打印的构建物应能高度模拟天然组织中细胞与细胞外基质的复杂空间组织。本文重点介绍帕尔梅托打印机（Palmetto Printer）——一种笛卡尔式生物打印机——在制备空间有序、具有活性的构建物中的应用，同时实现对环境因素的可控调节。该方法利用计算机辅助设计与计算机辅助制造技术，以生成特定且复杂的几何结构。最终，该策略可通过可调控的打印参数，实现构建物的可重复、优化生产。

引言

组织工程结合生物学与工程学原理，致力于开发功能性替代物，以维持、修复或增强天然组织。按需生成三维仿生结构的能力，将推动组织工程以及基于细胞的传感器、药物/毒性筛选、组织或肿瘤模型等领域的科学与技术进步。对于组织工程构建物而言，其三维结构是制备方法中的基本要素，因为必须紧密模拟天然组织中细胞与细胞外基质之间高度有序的相互作用。

可生物降解且可塑形的三维支架是构建新型组织结构的关键因素，因为细胞会迁移并形成二维细胞层，但缺乏在理想的三维环境中生长的能力。支架可作为细胞黏附和增殖的临时基底，因此必须由具有可控孔隙率和可生物降解性且具备足够力学完整性的材料制成。支架材料不应具有细胞毒性，也不应引起宿主的不良反应。水凝胶已广泛应用于组织工程技术中，由于其亲水性，水凝胶允许液体和气体在整个结构中进行交换。通过组合不同的水凝胶，可调节合成水凝胶的性能，以满足特定应用需求。

传统的组织工程方法涉及制造无细胞的多孔牺牲支架，然后在支架制备完成后接种细胞。已采用多种技术，如纤维键合、溶剂浇铸和熔融成型，但这些方法在组织工程应用中均收效甚微。纤维键合方法可使纤维按特定形状排列，但仅能制备非常薄的支架。溶剂浇铸法虽可制得高孔隙率的结构，但所制备的最大膜厚度仅为3 mm。因此，使用这些技术无法制备三维结构。熔融成型技术虽能成功制备三维支架，但所需温度过高，导致在生产过程中无法掺入生物材料。在制备完成后接种细胞的支架难以满足组织工程对具有预定义或可....

方案

1. 用于海藻酸盐水凝胶三维生物打印的明胶基底制备

1. 按照 Pataky et al¹¹ 所述的钙/明胶基底方法制备钙/明胶基底，以避免高含量导致的细胞活力降低。钙/明胶基底方法如下所列。
   1. 将氯化钙二水合物（1.5 wt%）、氯化钠（0.9 wt%）和猪明胶（2 wt%）溶于蒸馏水中，煮沸 2 min，制成 100 mM 的明胶溶液。
2. 将 5 ml 明胶/钙溶液倒入 100 mm 标准培养皿中，轻轻旋转使溶液在表面形成均匀涂层，然后置于冰箱中过夜凝胶化（使用前至少静置凝胶 8 小时）。
3. 为提高基底表面的不透明度，向明胶/CaCl₂ 溶液中加入二氧化钛（0.3 wt%），搅拌 10 分钟。将明胶/TiO₂ 溶液在液体循环模式下高压灭菌 30 分钟以实现灭菌。
   1. 将 3 ml 明胶/TiO₂ 溶液加至先前制备的明胶板表面，轻轻旋转混合物以确保其在表面均匀分布。在 4 °C 冰箱中过夜静置凝胶（使用前至少凝胶 8 小时）。基底必须在 3 天内使用。

2. 藻酸盐氧化

1. 按照Bouhadir的部分氧化海藻酸盐方法，对海藻酸钠生物墨水进行氧化 等³⁰ 

结果

结果表明，该生物打印机能够利用计算机辅助软件，准确且一致地将含细胞水凝胶沉积到特定的三维位置。这些软件可确定每个液滴的放置位置，并控制分配过程中的多个参数（图3,4）。生物打印机在组织工程应用中能否成功，其关键在于对生物材料进行精确沉积的可重复性。

细胞活性是成功生物打印技术所需满足的条件之一，在打印后1小时和8天进行了分析。高细胞活性对于构建仿生结构至关重要，也是生物墨水性能良好的直接体现。RGD肽的偶联可通过促进细胞铺展，从而在较长时间内提高细胞活性。采用荧光显微镜对打印后结构中的细胞活性进行定量分析。浓度为15%、氧化度为5%的海藻酸盐生物墨水在第0天的细胞活性为98%，第4天为96%，第8天为95%（图5）。这些结果表明，直接书写式生物打印机的沉积技术能够温和地挤出细胞，从而生成在打印过程中及打印后均保持活性的结构（图1、2）。高细胞活性说明氧化度5%、浓度15%的海藻酸盐生物墨水是适合细胞沉积的载体，为细胞存活提供了适宜的环境。各区域中相似的细胞数量表明海藻酸盐生物墨水中.......

讨论

组织工程的主要目标是通过开发能够恢复、维持或改善天然组织功能的生物替代物，来弥补器官短缺与移植需求之间的差距。这推动了具有复杂且解剖学上精确的外部几何结构的支架的直接制造，并实现了对内部结构的精确控制。三维生物打印是一种基于数字模型，通过逐层堆积的方法，生成各种尺寸和形状的三维结构的技术。三维仿生结构的构建在组织工程的发展中起着至关重要的作用。

设计过程中的若干关键方面会影响所生成结构的仿生功能。控制生物材料和基底温度的能力对于水凝胶的凝胶化机制及其力学性能的维持至关重要，从而影响细胞在水凝胶内的分布、增殖和分化。由于器官由多种细胞类型组成，多个分配装置对于构建异质性、类组织结构至关重要。对外部结构进行计算机辅助设计，可实现针对不同创面或组织定制化组织替代物的制造，这对于开发患者特异性替代物至关重要。内部结构同样重要，因为它通过将适当的细胞紧密接触地定位在一起，影响结构内的细胞-细胞相互关系，并允许细胞形成 体内-样细胞间连接。细胞的精确定位决定了它们之间如何相互通讯并形成网络，从而构建血管网络，并模拟其在天然组织中的生物活性。三维生物打印可实现细胞在生物墨水中的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定位机器人 (JR2000 XYZ)	Janome
分配器：SDAV 线性驱动 SmartDispensers	Fishman Corporation
光学传感器：	Keyensce
位移激光器：OD Mini	SICK
循环水浴：Polystat	Cole-Parmer	EW-12122-02
USB 相机：Dino-Lite Premier 5MP	AnMo Electrionics/YSC Technologies	AD7013MT
打印机兼容的计算机设计软件：JR-C Points	Janome		随 Janome 机器人购买附赠
计算机辅助设计绘图软件：Visual PathBuilder	RatioServ		可从以下网址下载：www.ratioserv.com/index.php/downloads
打印机用 3 cc 注射器：	Fishman Corporation	122051
22 G 分配器吸头	Fishman Corporation	Z520122
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	10035-04-8
氯化钠	Sigma-Aldrich	7647-14-5
猪明胶	Sigma-Aldrich	9000-70-8
二氧化钛	Sigma-Aldrich	13462-67-7
Protanal LF 20/40 海藻酸盐（海藻酸钠）	FMC BioPolymer	9005-38-3
盐酸	Sigma-Aldrich	7647-01-0
乙二醇	Mallinckrodt Baker, Inc	9300-01
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	7790-28-5
hADSC	Lonza	PT-5006	使用前保存于液氮中。
杜氏改良伊格尔培养基	Gibco Life Technologies	11965-092	使用前在 37 °C 水浴中预热。
胰蛋白酶/EDTA	Lonza	CC-5012	使用前在 37 °C 水浴中预热。
Calcein AM	Gibco Life Technologies	C3100MP	使用前避光保存于 -80 °C。
活/死哺乳动物细胞活力检测试剂盒	Invitrogen Life Technologies	L-3224	使用前避光保存于 -80 °C。
MES 水合物	Sigma-Aldrich	M2933
N-羟基琥珀酰亚胺	Sigma-Aldrich	130672
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)	Sigma-Aldrich	E1769	10 G
杜氏磷酸盐缓冲液，含钙，含镁	Life Technologies	14040133	使用前在 37 °C 水浴中预热。
杜氏磷酸盐缓冲液，无钙，无镁	Life Technologies	14190144	使用前在 37 °C 水浴中预热。
RGD 肽	International Peptides
Alexa Fluor 546 鬼笔环肽染色剂	Invitrogen Life Technologies	A22283	使用前保存于 -20 °C
(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐) (DAPI) 染色剂	Life Technologies	R37606	使用前保存于 -20 °C