Bioprinted蜂窝构造的可行性使用三分配器笛卡尔打印机

Summary

笛卡尔生物打印机的设计和制造允许以精确、可重复的几何形状沉积多材料，同时还允许控制环境因素。利用 3D 生物打印机，可以打印并轻松复制复杂且可行的结构。

Abstract

组织工程专注于构建非功能性或受损组织的替代品。三维生物打印在组织工程中的应用催生了打印细胞和基质以制造仿生组织结构的新方法。为三维生物打印开发的固体自由曲面制造 （SFF） 方法使用增材制造方法，通过逐层沉积细胞和水凝胶液滴。生物打印制造取决于生物材料在三维结构中的特定放置，打印结构应密切模拟天然组织中细胞和细胞外基质的复杂组织。本文重点介绍了 Palmetto 打印机（一种笛卡尔生物打印机）的使用，以及生产空间组织、可行结构的过程，同时允许控制环境因素。这种方法利用计算机辅助设计和计算机辅助制造来生成这些特定和复杂的几何形状。最后，这种方法允许通过可控打印参数优化制造结构的可重复生产。

Introduction

组织工程使用在功能替代品的开发生物和工程的原理来维持，恢复或提高天然组织和。产生按需三维仿生结构将有助于在组织工程中以及在基于细胞的传感器，药物/毒性筛选，组织或肿瘤模型和其他科学和技术进步的能力。三维组织工程构建的组织是制造方法的一个基本组成部分，因为它必须密切模仿细胞外基质的天然组织的高度组织的相互作用。

可生物降解的和成形的三维支架是在产生新的组织构建因为细胞迁移以形成一个二维的细胞层的关键因素，但缺乏在偏爱三维生长的能力。该支架用作小区的临时基础附着和增殖，因此它必须从材料具有可控孔隙率和生物降解性，和足够的机械IntegrIT公司构成。该支架材料不应该是细胞毒性或创建从主机有不良反应。水凝胶已被普遍使用在组织工程技术，并且由于它们的亲水性，水凝胶允许整个所有制结构流体和气体交换。通过结合不同的水凝胶，合成水凝胶的属性均可修改，以满足不同的应用需求。

传统的组织工程方法涉及创建所用细胞接种后fabricatio脱细胞多孔牺牲支架。许多技术已经被采用，例如纤维粘结，溶剂浇铸和熔融模塑，但被证明是用于组织工程应用最低限度地成功。纤维粘合方法允许纤维在特定的形状对齐，但它们仅能够促ducing非常薄的支架。溶剂浇铸方法产生高度多孔结构，然而最大产生膜仅为3毫米THIC。因此，使用这些技术制造的三维结构是不可行的。熔融模制技术生产三维支架被证明是成功的，但需要这样的高温下不能在生产PROCES掺入生物材料。支架接种后加工....

Protocol

1.制备明胶含有底物的藻酸盐水凝胶的三维生物印刷

1. 准备由Pataky 等 ¹¹描述，以避免具有高的内容相关联的存活率下降了钙/明胶底物法以下钙/明胶衬底。钙/明胶底物法如下所示。
   1. 结合氯化钙脱水物（1.5重量％），氯化钠（0.9重量％），和猪明胶（2重量％）在蒸馏水和煮沸2分钟，以创建一个100mM的明胶溶液。
2. 倒入5毫升明胶/钙溶液的入100毫米标准培养皿，漩涡的溶液周围，使均匀涂覆的表面上，并放置在一平的表面在冰箱到凝胶O / N（允许胶凝至少8小时后再使用）。
3. 为了增加基板表面的不透明度，加入二氧化钛（0.3％重量）的明胶/ _氯化钙溶液。搅拌10分钟。 AUToclave在液体循环明胶_/ TiO 2的溶液中30分钟以消毒它。
   1. 加入3毫升明胶_/ TiO 2的溶液中，以预先制备的明胶板的表面上。摇动混合物，以确保其均匀地在整个表面上扩散。允许在4℃冰箱O操作凝胶/ N（允许凝胶在使用前至少8小时）。基材必须在3天内使用。

2，海藻酸氧化

1. 氧化海藻酸钠生物油墨以下通过下述Bouhadir 等人 ³⁰的方法，部分氧化的藻酸盐。
   1. 使5％的氧化藻酸盐溶液，溶解1克藻....

Results

结果证实了生物印刷器能够精确地沉积在特定的三维位置细胞载货水凝胶和始终如一地利用计算机辅助软件。这些软件决定了放置每个液滴并控制许多参数的分配（ 图3,4）。的生物印刷器的重复性适当沉积的生物材料是根本其在组织工程应用的成功。

细胞活力，一个成功的技术，生物印刷的要求之一，分析1小时和8天后打印。高细胞活力是用于制造仿生构建必要的，是适当的生物油墨的直接表示。 RGD肽结合在一段时间通过促进细胞扩散过长提高细胞活力。荧光显微镜来定量细胞活力在印刷过程之后的结构。海藻酸钠生物油墨用精矿的15％和5％的氧化通货膨胀有天0生存能力98％，96％4天，和95％8天（ 图5）。这些结果表明的直写生物印刷器的沉积技术挤出细胞轻轻足以产生期间和打印过程后保持存活的构建体（图1，2）。高细胞活力表示5％的氧化和15％浓度的藻酸盐生物油墨是一个合适的载体用于细胞沉积和提供用于细胞存活的适当环境。在每个区域相似的细胞计数显示在藻酸盐生物油墨均匀细胞分布，打印分辨率的一.......

Discussion

组织工程的主要重点是通过开发能够恢复，维持或提高当地组织函数的生物替代品来弥补器官短缺和移植需求之间的差距。这导致了支架的具有复杂，解剖学上正确的外部几何形状，而在它的内geometr精确控制的直接制造。三维生物印刷是用于使用层 - 层approac从数字模型生成各种尺寸和形状的三维结构的方法。三维仿生构建体的制造起着组织工程的进步至关重要的作用。

有设计过程，影响所产生的构建体的仿生函数的关键方面。以控制生物材料和基板的温度的能力对于水凝胶的胶凝机制和它们的我的维护必要械性能，因此影响细胞分布，增殖和水凝胶内的分化。器官由许多细胞类型的，所以多个分配器可用于制备异构的，组织样结构是至关重要的。外部结构的计算机辅助设计允许生产定制组织替代不同的伤口或组织。这是患者特异性的替代品的发展至关重要。内部架构也是同样重要的，因为它通过将合适的细胞彼此紧密接触，并允许他们在体内形成样细胞-细胞连接的影响结构内的细胞-细胞之间的关系。细胞的精确位置决定了细胞如何沟通和网络互相形成血管网络，并模仿它们的生物活性的天然组织。三维生物印刷提供了生物油墨内均匀分散的细胞，以及对空间p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
定位机器人 （JR2000 XYZ）	Janome
分配器：SDAV 线性驱动 SmartDispensers	Fishman Corporation
光学光传感器：	Keyensce
位移激光器：OD Mini	SICK
循环水浴：Polystat	Cole-Parmer	EW-12122-02
USB 摄像头：Dino-Lite Premier 5MP	AnMo Electrionics/YSC Technologies	AD7013MT
打印机兼容计算机设计软件：JR-C 积分	Janome		购买 Janome 机器人
计算机辅助设计绘图软件：Visual PathBuilder	RatioServ		可在以下网址下载：www.ratioserv.com/index.php/downloads
打印机 3 cc 注射器：	Fishman Corporation	122051
22 G 分配器尖端	Fishman Corporation	Z520122
钙二水	合物 Sigma-Aldrich	10035-04-8
氯化钠	Sigma-Aldrich	7647-14-5
猪明胶	Sigma-Aldrich	9000-70-8
二氧化钛	Sigma-Aldrich	13462-67-7 二氧化钛 Sigma-Aldrich 13462-67-7
乙酰醛 LF 20/40 海藻酸盐（海藻酸钠）	FMC 生物聚合物	9005-38-3
盐酸	Sigma-Aldrich	7647-01-0
乙二醇	Mallinckrodt Baker， Inc	9300-01
高碘酸钠	Sigma-Aldrich	7790-28-5
hADSC	Lonza	PT-5006	储存在小瓶中的液氮中直至使用。
Dulbecco's 改良 Eagle's 中号	Gibco Life Technologies	11965-092	暖色 37 度;C 使用前清水。
胰蛋白酶/EDTA	Lonza	CC-5012	37 °C 温C 使用前清水。
钙黄绿素 AM	Gibco Life Technologies	C3100MP	在 -80 °C 直到使用。
活/死哺乳动物活力检测试剂盒	Invitrogen Life Technologies	L-3224	在 -80 &°g 的黑暗中储存;C 直到使用。
MES水合	物 Sigma-Aldrich	M2933
N-羟基琥珀酰亚胺	Sigma-Aldrich	130672
1-乙基-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）	Sigma-Aldrich	E1769	10 克
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，+钙，+镁	Life Technologies	14040133	37 °C温暖;C 使用前清水。
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，-钙，-镁	Life Technologies	14190144	37°C温暖;C 使用前清水。
RGD Peptides	International Peptides
Alexa Fluor 546鬼笔环肽染料	Invitrogen Life Technologies	A22283	商店高度为-20 °C 直到使用
（4'，6-二脒基-2-苯吲哚，二盐酸盐）（DAPI） 染色	Life Technologies	R37606	储存在 -20 度;C 直到使用