的内肌浆网钙光学标测 2+和的Langendorff灌注兔心脏跨膜电位

摘要

本文介绍了详细的协议和必要的跨膜电位_（V M）双光学测绘和免费内部肌浆网（SR）设备^钙在的Langendorff灌注兔心脏。此方法允许直接观察和第V _米量化和SR ^的 Ca 2+动力学在完整心脏。

摘要

肌浆网 （SR） Ca²⁺ 处理在正常的兴奋-收缩耦合中起关键作用，已知异常的 SR Ca²⁺ 处理在某些类型的心律失常中起重要作用。因为心律失常是空间上不同的紧急现象，所以必须在组织水平上进行研究。然而，直接探查完整心脏中 SR Ca²⁺ 的方法仍然有限。本文描述了在 Langendorff 灌注的兔心脏中跨膜电位_{（VM m}） 和游离内 SR [Ca²⁺] （[Ca²⁺] _SR） 的双光学映射方案。这种方法利用了低亲和力的 Ca²⁺ 指示剂 Fluo-5N，它在胞质溶胶中具有最小的荧光，其中细胞内 [Ca²⁺] （[Ca²⁺]_i） 相对较低，但在 [Ca²⁺] _SR 在毫摩尔范围内的 SR 腔中表现出明显的荧光。除了在心脏心外膜表面的空间上揭示 SR Ca²⁺ 特性外，这种方法还具有同时监测 V_m 的明显优势，允许研究 VM 和 SR Ca²⁺ 之间的双向关系以及 SR Ca²⁺ 在致心律失常现象中的作用。

引言

完整 Langendorff 灌注心脏中细胞内 Ca²⁺ 和跨膜电位 （V_m） 的双光学标测已成为心脏电生理学研究的支柱，包括心律失常和兴奋-收缩耦合的机制^1-4。这种方法为正常和异常电生理学提供了前所未有的知识，重要的是，为 V_m 和细胞内 Ca²⁺ 之间的双向关系提供了前所未有的知识。然而，使用高亲和力荧光指示剂（如 Rhod-2 和 Fluo-4）对细胞内 Ca²⁺ 进行光学映射仅报告细胞内 Ca²⁺ 的大量变化，无法区分这些变化是由于跨膜 Ca²⁺ 通量、释放和再摄取到细胞内储存，还是在大多数情况下，两者的某种组合。此外，高亲和力 Ca²⁺ 指示剂具有缓慢的开关动力学，可能无法准确报告 Ca²⁺ 浓度的快速变化⁵。

每个动作电位都会触发细胞内 Ca²⁺ 的增加，称为细胞内 Ca²⁺ 瞬时 （CaT）。在哺乳动物心脏中，大约 70 – 90% 的总 CaT 是由于通过兰尼碱受体 （RyR） 打开从肌浆网 （SR） 中释放 Ca²⁺⁶。在 SR 中，大约一半的总 Ca²⁺ 与钙螯合素 （CSQ） 和其他 SR 内缓冲液⁷ 结合，它们在 SR Ca²⁺ 稳态中起重要作用^8,9。游离 SR Ca²⁺ 的量决定了 SR Ca²⁺ 释放的驱动力以及 RyR 的门控，因此对细胞内 CaT 有显着影响。此外，SR Ca²⁺ 释放或再摄取的改变反过来会通过电生 Na⁺-Ca²⁺ 交换影响 V_m，这可能会产生致心律失常的后果。因此，除了 CaT 之外，监测游离 SR Ca²⁺ 还可以提供对收缩和电生理功能障碍的重要见解。

在过去的几年里，研究人员在监测离体心肌细胞和完整心脏上的单个位置的 SR Ca²⁺ 方面取得了重大进展。其中一种方法需要咖啡因的快速脉冲以打开 RyR，然后从细胞内 Ca²⁺¹⁰ 的立即升高中推断或计算 SR Ca²⁺ 含量。另一种有趣的方法是使用低亲和力 Ca²⁺ 指示剂，例如 Fluo-5N¹¹ 或 Mag-Fluo4¹²，它们与游离的 SR Ca²⁺ 结合。这些指示剂的解离常数 （K_d） 在 10 – 400 μM 范围内，因此与 SR 腔相比，在胞质溶胶中表现出最小的荧光，其中 Ca²⁺ 浓度 （[Ca²⁺]_SR） 在毫摩尔范围内。使用低亲和力 Ca²⁺ 指示剂，已在分离的心肌细胞水平上研究了 SR Ca²⁺ 循环的几个方面，包括 SR Ca²⁺ 释放分数和 Ca²⁺ 交替蛋白的机制^13,14。然而，为了充分理解完整心脏中 SR Ca²⁺ 循环的异质性以及 SR Ca²⁺ 在空间上不同的心律失常现象中的作用，需要对完整心脏心外膜表面的 SR Ca²⁺ 进行成像的方法¹⁵.

本文介绍了使用低亲和力 Ca²⁺ 指示剂 Fluo-5N 对完整 Langendorff 灌注兔心脏中游离 SR Ca²⁺ 和 V_m 进行双重光学映射的方法。除了在心脏心外膜表面的空间上揭示 SR Ca²⁺ 特性外，这种方法还具有同时监测 V_m 的优势，允许研究 V_m 和 SR Ca²⁺ 之间的双向关系。

方案

所有涉及动物的程序由加州大学戴维斯分校的动物护理和使用委员会批准，并坚持以指南实验动物卫生的国家机构发布的管理和使用。

1.准备

1. 准备提前和存储改良台氏液2浓缩（25X）的股票在4℃下:（1）股票我（在MM:氯化钠3205， _氯化钙 32.5，氯化钾117.5，氢化钠₂ PO ₄ 29.75， _氯化镁 26.25）和（2）股票II（毫米: _碳酸氢钠 500）。
   1. 新鲜制备下列组合物（以mM计）的2升的台氏溶液:氯化钠128.2， _氯化钙 2 1.3，氯化钾_4.7，MgCl 2的1.05，将NaH _{2 PO 4} 1.19， _碳酸氢钠 20，并结合1840年毫升去离子葡萄糖11.1（DI）水，80 ml的库存我，80毫升库存II和4克葡萄糖。不要直接混合股票我和股票II;添加米1840毫升DI，以避免沉淀。
2. 事先准备的兴奋 - 收缩解偶联剂II型肌球蛋白的储备溶液为10毫克/毫升的无水二 - 二甲亚砜（DMSO）和存储原液于4℃。
3. 制备储备溶液的荧光染料:（1）电压敏感染料RH237（1毫克/毫升在DMSO中）和（2）低亲和力钙指示剂的Fluo-5N调幅根据制造商的建议（2毫克/毫升在DMSO中）。使用准备立即以避免分解与承载能力后续损失。
4. 素再循环的Langendorff灌注系统与充氧_（95％O 2，5％的CO _2）台氏液。调整_的 O 2 / CO ₂的流动，以保持台氏溶液的pH值在7.4±0.05。使用在线的尼龙机织网过滤器（孔径:11微米），以连续地过滤灌注液。
   1. 素灌注系统在RT，随后的loadi荧光 - 5N上午NG是在室温下进行。为的Fluo-5N AM装载，用小体积循环灌注液（〜150毫升）中。染料加载后，用灌注液更大体积（1 - 2 L时， 参见图1C）。
5. 打开数据采集系统和连续监测心电图和灌注压的准备。准备压力监测系统:压力传感器连接到灌注线路和监控一个transbridge放大器的灌注压。调整基线灌注压为0毫米汞柱时心脏没有连接到灌注系统。
6. 将光盘映射摄像头，保证了_V M和SR ^钙离子信号之间的空间对齐。
   1. 首先，通过把尺子或物体与文成灌注菜集中的摄像机。打开相机映射到实时取景模式，并调整对焦，直到文本清晰和明确的。获得来自每个摄像机的单个帧的图像。
   2. 覆盖这些图像并调整顶部图像的透明度，使得两个图像是可见的。在图像中的文本应完全重叠。如果不完全一致，调整分色镜或每个摄像机的位置的角度，直到两个图像对齐。

2.收获，灌注和染料装兔心

1. 固定兔批准的兔子限制器。通过戊巴比妥钠（50毫克/千克）和肝素（1000 IU）的静脉内注射（耳缘静脉）深麻醉。
   1. 当兔子显示缺乏痛觉反射，可使正中皮肤切口，显露胸骨和肋骨。切通过与钝尖从xyphoid至胸骨柄手术剪胸骨。请注意不要损伤心脏，同时打开胸骨。传播肋骨暴露的心脏。
   2. 迅速切除被迅速切断所有船只和结缔组织整个心脏，肺块。立即直接tely将心脏，肺块入冰冷的台氏液。
2. 找到主动脉逆行灌注。切开升主动脉刚好接近主动脉弓的三个分支。导管插入主动脉到8G的插管连接到灌注系统。使用一块USP 0丝线缝合来固定到主动脉插管。
3. 仔细解剖气管，肺，从心脏心外膜脂肪。用锋利的镊子和剪刀剥离，找到二尖瓣和小心损坏或删除一个小叶，以防止在左心室溶液拥塞。
4. 在玻璃夹套灌注室面朝成像心脏的前表面淹没心脏水平。固定在插管到一块的Sylgard的与U形销上的菜硅底部，以防止映射（图1D）在心脏的运动。如果需要，插入一个小的昆虫针在心脏的STA顶点bilization。
5. 位置心电图（ECG）中的心脏的右侧和左侧的浴电极。完全淹没在浴中的电极，并确保它们不与心脏表面接触，以提供一个体积进行心电图类似于一个导联I配置。验证正常导我的心电图形态。调节流量（25 - 35毫升/分钟），以确保在主动脉压力维持在60 - 70毫米汞柱。
6. 关闭室内灯光，并添加0.3 - 的II型肌球蛋白原液（步骤1.2）灌注液（终浓度为10 - 20μM）0.6毫升
   1. 关掉房间的灯，以避免II型肌球蛋白的光灭活。如果需要的话，小聚光灯或头灯可以用来提供工作照明。
      注:II型肌球蛋白是肌球蛋白ATP酶抑制剂和兴奋收缩解偶联剂。因为将Fluo-5N装载需要延长（60分钟）RT（低温）条件（见步骤2.8 - 2.10），心脏能源生产可能会受到损害。钍erefore，除了II型肌球蛋白进入前灌注液染负荷可以减少能源需求^16，并在随后的光学记录¹⁷消除运动伪影。
7. 当心脏收缩已经停止（10 - 15分钟，核实主动脉压力记录），切换到小容量循环灌注系统（见步骤1.4.1）。
8. 准备和加载的Fluo-5N AM负载的解决方案:加入0.25g毫升的Fluo-5N AM储备液（1.3步）至0.25毫升温20％，聚醚F127。加入0.5毫升温台氏液的混合，拌匀，并添加到小批量循环灌流系统。
9. 持续监测灌注压和心电图，必要时调节流量。染料加载需要大约1小时，在室温。负荷后45分钟开始，打开循环水浴开始灌注系统和灌注液升温至37℃。
10. 的荧光 - 5N AM加载，SWI 60分钟后，TCH灌注到更大的卷循环灌注系统（见步骤1.4）。
11. 稀释50微升电压敏感染料RH237原液（步骤1.3）在1毫升温台氏液和，缓慢加入（超过〜5分钟）到注射口靠近所述插管。

3.光学测绘

1. 在染料加载的最后时刻，定位心脏和聚焦光学测绘相机，以确保视图中的相应领域的实验。
2. 如果需要的话，将一个双极起搏电极对心脏起搏的心外膜表面。
3. 放置灌注腔的表面上的塑料或玻璃盖玻片，以减少在液体表面可能存在由于灌注液的再循环运动伪影。
   注:作为替代盖玻片，用干净的塑料50毫米培养皿盖。
4. 聚焦光导板均匀地照射随e心脏的表面xcitation光。使用蓝色发光二极管（LED）光源和进一步过滤的光用一个475 - 495 nm的带通滤波器（ 图1A）。
5. 收集发射的荧光与macroscope和两个互补金属氧化物半导体（CMOS）光学测绘相机。分割所发射的光与分色镜在545nm纳米。
   1. 长通滤波器的较长波长部分，包含在V _m个信号 ，在700纳米。带通滤波器的更短的波长的部分，含有的SR ^的 Ca 2+信号，从502 - 534纳米（ 图1A）。光学数据采集的频率设定为0.5 - 1千赫。
6. 对于每一个光记录，首先发起所需的起搏协议，打开激发光，并收集1 - 4秒的数据。如果需要，同步起搏协议和数据采集。
   注意:这是不可能重新加载的Fluo-5N调幅，因此信噪比（SNR）将会增减本身在整个由于从SR染料渗漏的试验。限制实验协议，1 - 2小时，以确保高SNR值。
7. 以下实验中，用DI水冲洗灌注系统的DI水，70％的试剂酒精的序列中，并再次。
8. 过滤每个数据集具有根据制造商的方案使用市售软件包空间高斯滤波器（半径为3像素）。
9. 如果需要的话，在空间上对齐_V M和SR ^的 Ca 2+的数据集。如在步骤1.6，来自每个摄像机覆盖图像，并验证该心脏的解剖结构（即，冠状脉管，心房边缘或心室）或其他物品中的视图（即，套管，起搏电极）的字段完全重叠。如果不是，则数据集的空间对准是必要的。
10. 移的顶部透明图像中的X和Y方向，直到完全重叠，从而使靠的像素的数目的音符的图像必须被移位在每个方向。对应于顶部图像（无论是_V M或SR的Ca ^2+）整个数据集然后必须通过的像素的数目来确定在每个方向错开，以保证在V _米和SR ^的 Ca 2+数据集之间的精确对准。

结果

图1A示出了用于双重_V M和SR ^的 Ca 2+映射的光学配置的示意图。与此设置，有一个在V _米和SR ^的 Ca 2+信号（图1B）的完整光谱分离。用于将Fluo-5N染料加载的双回路灌注系统的示意图示于图1C。图1D示出了心脏的灌注菜水平方向。代表性_V M和过程中从对心脏的心外膜表面的不同位置连续起搏的SR ^的 Ca 2+光学迹线示于图2A中。来看这种设置的光电场为31毫米×31日毫米和心脏的视场中的取向示于图2B。激活图也示于图2B和通过选择每个像素和p的激活时间被构造在等时地图lotting这个值（注意〜8典型的延迟-的_V M和SR ^钙激活图10毫秒）。重要的是，键动作电位（AP）的性质如...

讨论

成功的关键的Fluo-5N染料加载是小容积循环灌流设置，其允许高的Fluo-5N浓度，而不需要大量的染料，加载时间（1小时）的长度，并执行装载在RT。如果载入在生理温度，细胞的酶活性迅速裂解当染料穿过细胞膜，捕集染料分子在细胞质中，而不是使它们穿过的SR膜的-AM标签进行。在RT，然而，酶活性被减慢和染料的足够量可以跨越两个细胞膜和SR膜-AM标记之前被裂解，捕捉在SR中的染料。

即使有最佳的负载条件，但是，信号幅度和分数荧光变化（ΔF/ F），这种方法会比与_V M传统光学测绘和细胞内^钙离子具有高亲和力的染料低。例如，对于这里使用的光学设置，由LED激发光，宏观的目标，大的过滤器和分色镜（5厘米×5厘米），和CMOS照相机，分数的荧光变化的（ΔF/ F）是1的量级- 2％，为的Fluo-5N信号和2 - 3％，为RH237 ^信号 15。分数荧光会，当然，取决于具体的光学配置，光源，和一个特定的设置的摄像机，但即使在最佳条件下的Fluo-5N信号是比通常观察到的细胞内Ca录音显著低级²⁺具有高亲和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	Tyrode 溶液的组分
CaCl2 （2H2O）	Fisher Scientific	C79-500	Tyrode 溶液的组分
KCl	Fisher Scientific	S217-500	Tyrode 溶液的组分
MgCl2 （6H2O）	Fisher Scientific	M33-500	Tyrode 溶液的成分
NaH2PO4 （H2O）	Fisher Scientific	S369-500	Tyrode 溶液的成分
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	Tyrode 溶液的成分
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1	Tyrode 溶液的成分
95% O2 5% CO2	AirGas	碳水化合物	用于 Tyrode 溶液的氧合和 pH 值
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760	激发-收缩解偶器
RH237	Biotium	61018	电压敏感染料
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	低亲和力 Ca2+ 指示剂;替代品：Invitrogen F-14204;加载必须在室温下进行
Pluronic F127	Biotium	59004	用于 Ca2+ 指示剂加载;使用前加热至溶液澄清
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	用于溶解 blebbistatin 和染料
过滤	EMD Millipore	NY1104700	11 μm 在线过滤器
压力传感器	WPI	BLPR2	用于测量灌注压力
Transbridge 传感器放大器	WPI	SYS-TBM4M	用于传输/放大压力信号;PowerLab 也可与适当的 BioAmp
PowerLab 26T	ADInsturments		，用于连续记录压力和心电图信号
THT Macroscope	SciMedia		宏观光学设置。细节： 0.63 倍物镜（NA = 0.31），2 倍聚光物镜，合成视场 = 3.1 cm x 3.1 cm，焦深 = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		光学映射相机
精密 LED 聚光灯	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED 光源