兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca2+及跨膜电位的光学标测

摘要

本文介绍了在经Langendorff灌注的兔心脏中进行跨膜电位（V_m）和肌浆网内游离钙离子（SR Ca²⁺）双光学标测所需的详细方案及设备。该方法可实现对完整心脏中V_m和SR Ca²⁺动态变化的直接观察与定量分析。

摘要

肌浆网（SR）Ca²⁺调控在正常的兴奋-收缩耦联中起关键作用，而异常的肌浆网Ca²⁺调控已被证实参与某些类型心律失常的发生。由于心律失常是具有空间特异性的涌现现象，因此必须在组织水平上进行研究。然而，目前仍缺乏在完整心脏中直接探测肌浆网Ca²⁺的方法。本文介绍了在Langendorff灌注兔心脏中对跨膜电位（V_m）和肌浆网内游离[Ca²⁺]（[Ca²⁺]_SR）进行双光学标测的技术方案。该方法利用低亲和力Ca²⁺荧光探针Fluo-5N，该探针在细胞质中荧光信号微弱，因为细胞内[Ca²⁺]（[Ca²⁺]_i）相对较低；但在[Ca²⁺]_SR处于毫摩尔浓度范围的肌浆网腔内则表现出显著荧光。除了能够空间性地揭示心脏心外膜表面的肌浆网Ca²⁺特征外，该方法还具有同时监测V_m的独特优势，从而可研究V_m与肌浆网Ca²⁺之间的双向关系，以及肌浆网Ca²⁺在致心律失常现象中的作用。

引言

在完整的小鼠离体Langendorff灌注心脏中，同时进行细胞内Ca²⁺和跨膜电位（V_m）的双光学标测，已成为心脏电生理学研究中的核心技术手段，广泛应用于心律失常机制及兴奋-收缩耦联的研究^1-4。该方法极大地推动了对正常与异常电生理活动的认识，尤其深化了对V_m与细胞内Ca²⁺之间双向关系的理解。然而，使用高亲和力荧光探针（如Rhod-2和Fluo-4）进行细胞内Ca²⁺的光学标测仅能反映细胞内Ca²⁺的整体变化，无法区分这些变化是源于跨膜Ca²⁺流动、细胞内储存池的释放与再摄取，还是多数情况下两者的共同作用。此外，高亲和力Ca²⁺探针具有较慢的结合与解离动力学特性，可能无法准确反映Ca²⁺浓度的快速变化⁵。

每个动作电位都会引发细胞内 Ca²⁺ 浓度的升高，称为细胞内 Ca²⁺ 瞬变（CaT）。在哺乳动物心脏中，总 CaT 的约 70–90% 是由于肌浆网（SR）中的兰诺定受体（RyRs）开放，导致 Ca²⁺ 从肌浆网释放所致⁶。在肌浆网内，大约一半的总 Ca²⁺ 与钙结合蛋白（calsequestrin, CSQ）及其他肌浆网内缓冲蛋白结合⁷，这些成分在维持肌浆网 Ca²⁺ 稳态中发挥重要作用^8,9。肌浆网内游离 Ca²⁺ 的浓度决定了 Ca²⁺ 从肌浆网释放的驱动力以及 RyR 的门控状态，因此对细胞内 CaT 具有显著影响。此外，肌浆网 Ca²⁺ 释放或再摄取的改变，反过来可能通过生电性的 Na⁺-Ca²⁺ 交换影响膜电位（V_m），从而产生致心律失常的后果。因此，除了监测 CaT 外，对肌浆网内游离 Ca²⁺ 的监测也能为收缩功能障碍和电生理功能障碍提供重要的信息。

在过去几年中，研究人员在监测肌浆网钙释放（SR Ca）方面取得了显著进展²⁺ 在分离的心肌细胞及完整心脏的单一位置进行测量。其中一种方法需要使用快速的咖啡因脉冲来打开兰尼碱受体（RyRs）和肌浆网（SR）钙²⁺ 随后通过细胞内 Ca 浓度的即时升高推断或计算出含量²⁺¹⁰另一种引人入胜的方法利用低亲和力 Ca²⁺ 指示剂，例如 Fluo-5N¹¹ 或 Mag-Fluo4¹²，可结合游离的肌浆网钙离子²⁺。这些指示剂的解离常数（K_d) 在10 – 400 μM 范围内，因此与肌质网腔相比，其在细胞质中的荧光信号极弱，因为在肌质网腔中 Ca²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_SR) 处于毫摩尔范围。使用低亲和力的 Ca²⁺ 指示剂，SR钙的多个方面²⁺ 在分离的心肌细胞水平上已对循环过程进行了研究，包括肌浆网（SR）Ca²⁺ 释放及Ca的机制²⁺ 交替现象^13,14然而，为了充分理解肌浆网钙释放的异质性本质²⁺ 完整心脏中的钙循环及肌浆网钙的作用²⁺ 在空间上不同的无节律现象中，用于成像肌浆网钙的研究方法²⁺ 在完整心脏的心外膜表面进行记录是必需的¹⁵.

本文介绍了在完整的小兔离体Langendorff灌注心脏中，利用低亲和力Ca²⁺荧光探针Fluo-5N对肌浆网（SR）游离Ca²⁺和膜电位（V_m）进行双光学标测的方法。该方法不仅能够空间性地揭示心脏心外膜表面SR Ca²⁺的特征，还具有同时监测V_m的优势，从而可研究V_m与SR Ca²⁺之间的双向关系。

方案

所有涉及动物的实验程序均经加州大学戴维斯分校动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理与使用指南》。

1. 准备

1. 提前配制两种浓缩（25倍）改良Tyrode’s溶液，并于4 °C保存：（1）储备液I（单位为mM：NaCl 3,205，CaCl₂ 32.5，KCl 117.5，NaH₂PO₄ 29.75，MgCl₂ 26.25）；（2）储备液II（单位为mM：NaHCO₃ 500）。
   1. 新鲜配制2 L以下成分的Tyrode’s溶液（单位为mM：NaCl 128.2，CaCl₂ 1.3，KCl 4.7，MgCl₂ 1.05，NaH₂PO₄ 1.19，NaHCO₃ 20，葡萄糖11.1），方法为将1840 ml 去离子水（DI）、80 ml 储备液I、80 ml 储备液II以及4 g葡萄糖混合。切勿直接混合储备液I与储备液II；应分别加入1840 ml 去离子水中，以避免沉淀产生。
2. 提前用无水二甲基亚砜（DMSO）配制浓度为10 mg/ml的兴奋-收缩解偶联剂blebbistatin储备液，并将该储备液置于4 °C保存。
3. 配制荧光染料储备液：（1）电压敏感性染料RH237（1 mg/ml 溶于DMSO）；（2）低亲和力钙指示剂Fluo-5N AM（2 mg/ml溶于DMSO），按生产商推荐方法操作。配制后应立即使用，以避免因分解导致染色能力下降。
4. 用充氧（95% O₂，5% CO₂）的Tyrode’s溶液预灌注循环Langendorff灌流系统。调节O₂/CO₂流量，使Tyrode’s溶液的pH维持在7.4 ± 0.05。使用在线尼龙编织网滤器（孔径：11 µm）对灌流液进行持续过滤。
   1. 在室温（RT）下启动灌流系统，因为后续Fluo-5N AM的负载在室温下进行。进行Fluo-5N AM负载时，使用较小体积的循环灌流液（约150 ml）。染料负载完成后，改用较大体积的灌流液（1–2 L，参见图1C）。
5. 开启数据采集系统，准备对心电图（ECG）和灌流压力进行连续监测。准备压力监测系统：将压力传感器连接至灌流管路，并使用跨桥放大器监测灌流压力。在心脏未连接灌流系统时，将基础灌流压力调至0 mmHg。
6. 校准光学标测相机，确保膜电位（V_m）与肌浆网Ca²⁺信号之间的空间对齐。
   1. 首先通过将标尺或带有文字的物体放入灌流皿中对相机进行调焦。将标测相机切换至实时成像模式，并调节焦距直至文字清晰锐利。从每台相机采集单帧图像。
   2. 将这些图像叠加，并调节上方图像的透明度，使两幅图像均可见。图像中的文字应完全重合。若未完全对齐，则调节二向色镜的角度或每台相机的位置，直至两幅图像完全对齐。

2. 兔心脏的收获、灌注和染料负载

1. 将兔子固定在经批准的兔用固定装置中。通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）和肝素（1,000 IU）进行深度麻醉。
   1. 当兔子痛觉反射消失后，沿中线做皮肤切口，暴露胸骨和肋骨。使用钝头手术剪从剑突向胸骨柄方向剪开胸骨，注意在打开胸骨时避免损伤心脏。撑开肋骨以暴露心脏。
   2. 迅速切断所有血管和结缔组织，完整切除心脏-肺组织块，并立即将该组织块放入冰冻的台氏液中。
2. 定位主动脉以进行逆向灌流。在主动脉弓三个分支近端处剪断升主动脉。将主动脉插管至连接灌流系统的8号套管，并使用一段USP 0号丝线缝合固定主动脉与套管。
3. 仔细分离气管、肺和心外膜脂肪组织，保留心脏。使用锐利镊子和解剖剪找到二尖瓣，并小心破坏或移除一个瓣叶，以防止左心室灌流液淤积。
4. 将心脏水平置于玻璃夹层灌流室中，使心脏前表面朝上以便成像。使用U形针将套管固定在盛有Sylgard的培养皿硅胶底部，以防止记录过程中心脏移动（图1D）。如需要，可在心尖插入一根小型昆虫针以增强稳定性。
5. 将心电图（ECG）电极置于灌流槽内心脏左右两侧。确保电极完全浸入灌流液中，且不与心脏表面接触，以获得类似于I导联配置的容积传导心电图。确认I导联心电图形态正常。调节灌流流速（25–35 ml/min），使主动脉压力维持在60–70 mmHg。
6. 关闭室内灯光，并向灌流液中加入0.3–0.6 ml 的blebbistatin储备液（步骤1.2）（终浓度为10–20 µM）。
   1. 关闭室内灯光以避免blebbistatin发生光失活。如有必要，可使用小型聚光灯或头灯提供操作照明。
      注：Blebbistatin是一种肌球蛋白ATP酶抑制剂，可实现兴奋-收缩解偶联。由于Fluo-5N染料加载需要较长时间（60分钟）的室温（低温）条件（见步骤2.8–2.10），心脏能量生成可能受到影响。因此，在染料加载前向灌流液中添加blebbistatin可降低能量需求¹⁶，并在后续光学记录中消除运动伪影¹⁷。
7. 当心脏收缩停止后（约10–15分钟，通过主动脉压力记录确认），切换至小容量循环灌流系统（见步骤1.4.1）。
8. 配制并加载Fluo-5N AM染色液：取0.25 ml Fluo-5N AM储备液（步骤1.3），加入0.25 ml 温热的20% Pluronic F127溶液。再加入0.5 ml 温热的台氏液，充分混匀后加入小容量循环灌流系统中。
9. 持续监测灌流压力和心电图，必要时调节流速。染料加载在室温下约需1小时。染料加载开始45分钟后，开启循环水浴，逐步将灌流系统和灌流液升温至37 °C。
10. 完成60分钟的Fluo-5N AM染色后，切换至大容量循环灌流系统（见步骤1.4）。
11. 取50 µl 电压敏感性染料RH237储备液（步骤1.3），用1 ml 温热的台氏液稀释，缓慢（约5分钟内）注入靠近套管的注射口。

3. 光学图谱

1. 在染料负载的最后阶段，调整心脏位置并聚焦光学成像相机，以确保实验所需的适当视野。
2. 如需要，将双极起搏电极放置于心脏心外膜表面以进行起搏。
3. 在灌流室表面放置塑料或玻璃盖玻片，以减少因灌流液再循环而在液面产生的运动伪影。
   注意：可选用洁净的50 mm塑料培养皿盖替代盖玻片。
4. 调节导光管，使激发光均匀照射心脏表面。使用蓝色发光二极管（LED）光源，并通过475–495 nm带通滤光片进一步过滤光线（图1A）。
5. 使用宏变焦显微镜和两个互补金属氧化物半导体（CMOS）光学成像相机采集发射荧光信号。通过545 nm分色镜将发射光分为两束：
   1. 对包含V_m信号的长波长部分使用700 nm长通滤光片；对包含SR Ca²⁺信号的短波长部分使用502–534 nm带通滤光片（图1A）。将光学数据采集频率设置为0.5–1 kHz。
6. 每次光学记录时，首先启动所需的起搏程序，打开激发光源，采集1–4秒的数据。如需要，可同步起搏程序与数据采集。
   注意：Fluo-5N AM无法重新加载，因此由于染料从肌浆网（SR）中泄漏，信噪比（SNR）将在整个实验过程中逐渐降低。为确保较高的SNR值，实验流程应限制在1–2小时 内完成。
7. 实验结束后，依次使用去离子水、70%试剂级乙醇和去离子水清洗灌流系统。
8. 使用商业软件包，按照制造商提供的操作说明，对每个数据集应用空间高斯滤波器（半径为3像素）进行滤波处理。
9. 如有必要，对V_m和SR Ca²⁺数据集进行空间对齐。参照步骤1.6，叠加两个相机获取的图像，确认心脏的解剖结构（即，冠状血管、心房或心室边缘）或视野中的其他物体（即，插管、起搏电极）是否完全重合。若未完全重合，则需对数据集进行空间对齐。
10. 沿x轴和y轴方向移动上方的透明图像，直至实现精确重叠，并记录图像在每个方向上需要移动的像素数。随后，必须将对应于该上方图像的整个数据集（V_m或SR Ca²⁺）在各自方向上整体移动相应像素数，以确保V_m与SR Ca²⁺数据集之间的精确对齐。

结果

图1A 展示了双V光学构型的示意图_m 和肌浆网钙²⁺ 成像。在此设置下，V 的光谱完全分离_m 和SR钙²⁺ 信号（图1B用于Fluo-5N染料负载的双循环灌流系统的示意图如图所示 图1C. 图1D 显示心脏在灌注皿中的水平方向。代表性 V_m 和SR钙²⁺ 心脏心外膜表面不同位置连续起搏期间的光学信号轨迹如图所示 图2A该装置的光学视场为31 mm × 31 mm，心脏在视场中的方位如图所示。 图2B激活图谱也显示在 图2B 并通过对每个像素的激活时间进行选择，将该值绘制在等时图上（注意V之间典型的延迟约为8-10毫秒）_m 和肌浆网钙²⁺ 激活图）。重要的是，关键的动作电位（AP）特性，如动作电位上升时间（从幅度的10%到90% [...

讨论

成功加载Fluo-5N染料的关键在于使用小体积循环灌流装置，该装置可在无需大量染料的情况下实现高浓度Fluo-5N的加载、加载时间（1小时）以及在室温（RT）下进行加载。若在生理温度下进行加载，当染料穿过细胞膜时，细胞内的酶活性会迅速切割–AM基团，导致染料分子被困在细胞质中，无法穿过肌浆网（SR）膜。然而，在室温下，酶活性减缓，足够量的染料可在–AM基团被切割前同时穿过细胞膜和肌浆网膜，从而使染料被 trapping 在肌浆网内。

然而，即使在最佳加载条件下，采用这种方法获得的信号幅度以及荧光变化比率（ΔF/F）仍低于使用高亲和力染料进行传统光学映射膜电位（V_m）和细胞内 Ca²⁺ 所达到的水平。例如，在本实验所使用的光学系统中，激发光源为LED，配备大视野物镜、大型滤光片和二向色镜（5 cm × 5 cm）以及CMOS相机，Fluo-5N信号的荧光变化比率（ΔF/F）约为1–2%，RH237信号则约为2–3%¹⁵。当然，荧光变化比率取决于特定的光学配置、光源和相机系统，但即使在最优条件下，Fluo-5N信号仍显著...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	台氏液组分
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500	台氏液组分
KCl	Fisher Scientific	S217-500	台氏液组分
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500	台氏液组分
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500	台氏液组分
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	台氏液组分
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1	台氏液组分
95% O2 5% CO2	AirGas	carbogen	用于台氏液的氧合与pH调节
布雷比汀（Blebbistatin）	Tocris Bioscience	1760	兴奋-收缩解偶联剂
RH237	Biotium	61018	电压敏感性染料
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	低亲和力Ca2+指示剂；替代品：Invitrogen F-14204；必须在室温下进行负载
Pluronic F127	Biotium	59004	用于Ca2+指示剂负载；使用前加热至溶液澄清
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	用于溶解布雷比汀和染料
滤器	EMD Millipore	NY1104700	11 μm在线滤器
压力传感器	WPI	BLPR2	用于测量灌注压力
Transbridge信号放大器	WPI	SYS-TBM4M	用于压力信号的转换与放大；也可使用配备适当BioAmp的PowerLab系统
PowerLab 26T	ADInstruments		用于连续记录压力和心电图信号
THT宏观成像系统	SciMedia		宏观光学装置。详细参数：0.63倍物镜（NA = 0.31），2倍聚光物镜，最终视场为3.1 cm × 3.1 cm，焦深约1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		光学标测相机
精密LED点光源	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED光源