利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

摘要

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。

摘要

近年来，重编程技术的进步使我们能够将体细胞转化为人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。利用患者特异性的hiPSCs进行疾病建模，可研究疾病发病机制的潜在机理，同时也为疾病治疗策略的开发提供了平台。 体外 药物筛选和基因治疗以改善治疗方案。近年来，关于iPSC的研究论文数量不断增加（超过7000篇），充分表明hiPSC在再生医学中具有广阔的应用前景。已成功用于生成hiPSC的细胞类型涵盖多种不同谱系，包括皮肤成纤维细胞、造血细胞和表皮角质形成细胞。尽管目前许多实验室常规采用皮肤活检和血液采集作为获取体细胞以生成hiPSC的来源，但毛发角质形成细胞的采集与后续分离培养则较少被使用。来源于毛发的角质形成细胞为获取患者细胞样本提供了一种非侵入性方法。本文概述了一种从拔取的毛发中分离角质形成细胞的简便且非侵入性方法，并提供了角质形成细胞的培养维持以及利用附加体型载体进行重编程以生成无整合的hiPSC的技术步骤。

引言

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）的发现彻底改变了再生医学领域，为获得患者特异性的干细胞提供了一种可行的方法^1-3。hiPSCs已成功从多种体细胞类型中获得，包括成纤维细胞^4,5、造血细胞^6,7、尿液中的肾上皮细胞⁸以及角质形成细胞^9,10。迄今为止，皮肤成纤维细胞和造血细胞仍是生成患者特异性iPSCs最常用的细胞来源。这可能是因为皮肤活检和采血属于常规医疗操作，且许多国家已建立了大量的患者血液或皮肤样本生物库。

与需要侵入性提取方法的血细胞和皮肤成纤维细胞相比，角质形成细胞是一种易于获取的细胞类型，可用于诱导多能干细胞（hiPSC）的生成。角质形成细胞是富含角蛋白的上皮细胞，构成皮肤的外部表皮屏障，也存在于指甲和毛发中¹¹。特别是，角质形成细胞可存在于毛囊的外根鞘（ORS）中，这是一种外部细胞层，与内根鞘（IRS）细胞共同包覆毛干（¹²，图1）。由于毛发采集是一种简单操作，无需医务人员协助，患者可自行采集并寄送毛发样本至实验室，这将极大促进用于hiPSC生成的患者样本收集。与成纤维细胞相比，表皮角质形成细胞还具有更高的重编程效率和更快的重编程动力学，进一步增强了其作为hiPSC起始细胞的优势^9,13。此外，也可利用毛囊内的其他细胞群体生成hiPSC，包括位于毛囊基底部的真皮乳头细胞^14,15。

既往关于利用毛发来源细胞生成诱导多能干细胞（iPSC）的报道通常采用逆转录病毒或慢病毒介导的重编程方法^9,14,15。然而，这些病毒方法在重编程过程中会导致外源性转录因子基因整合到宿主基因组中，带来安全隐患。相比之下，使用附加体型载体是一种可行的非病毒重编程方法，可生成无基因组整合的iPSC⁴。我们此前已建立了一种简单、经济且非病毒的方法，能够高效地利用附加体型载体将角质形成细胞重编程为人诱导多能干细胞（hiPSC）¹³。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，用于生成角质形成细胞来源的hiPSC，包括从拔取的毛发中分离角质形成细胞、角质形成细胞的扩增与培养，以及后续重编程生成hiPSC的完整流程。

方案

采集人体毛发样本需获得所在机构人体研究伦理委员会的伦理批准，并应遵守机构的相关指南。

1. 从拔下的毛发中分离角质形成细胞

1. 解冻细胞外基质（ECM）溶液（即， Matrigel) 冰上孵育过夜。
2. 使用预冷的移液器吸头，加入 200 µl 将ECM溶液加至12 ml 预冷的DMEM/F12培养基。用1 ml培养基包被12孔板 将稀释的ECM溶液加入每个孔中。将包被好的培养板在37 °C孵育过夜。使用前用预热的DMEM/F12培养基洗涤包被好的培养板。
3. 从个体头部采集原代人发时，将手指靠近毛发根部，以快速而流畅的动作拔取毛发。检查每根采集的毛发，确认其含有完整的毛囊，并在解剖显微镜下判断毛发的生长阶段。图1).
   1. 从每位个体收集5-10根生长期毛发以提取角质形成细胞。拔取的毛发应尽快处理，以确保成功分离角质形成细胞。
      注意： 图1 展示了毛发生长周期不同阶段的毛发形态。生长期（anagen）毛发处于生长阶段，其毛发全长可见被一层上皮外层（即外根鞘，ORS）所包围。而休止期（telogen）毛发代表处于静止阶段的毛发，无可见的外根鞘，但在毛根部位有明显的细胞团块覆盖，称为休止期隆起（telogen bulge）。
4. 将毛发样本放入含有10 ml的培养皿中 用抗生素混合液洗涤5分钟 室温下
5. 使用灭菌的剪刀和镊子剪去多余的毛干，保留带有完整毛囊及约0.5–1 cm毛干的毛发片段。
6. 使用镊子将1根毛发片段小心转移至每孔ECM包被的板中。
7. 使用1 ml 用移液器向毛发样本中加入约3滴无血清替代培养基（Knockout Serum Replacement, KSR）（约100–200 µl）。
   注意：将毛发碎片保持与培养板表面紧密接触，以利于其贴附及后续角质形成细胞的生长。此步骤中若加入过多培养基，可能导致毛发碎片漂浮，从而降低毛发成功贴附的几率。
8. 将毛发样本置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育₂ 让毛囊附着过夜。次日，轻轻加入另外3滴KSR培养基（约100–200 µl），以保持毛囊样本湿润。
9. 每日观察毛发样本，以确认毛囊已成功附着。通常毛囊附着情况在1至3天内可见。粗毛通常比细毛更容易附着，因为细毛更易漂浮，从而阻碍附着过程。
   1. 毛发附着到包被板后，加入 500 µl 向孔中加入KSR培养基。添加培养基时需格外小心，因为毛发样本可能尚未牢固附着。此后，每2天更换一次培养基。
      注意：3-7 天后应可见从毛发片段的外根鞘区域长出的角质形成细胞。图2A-B)。在传代细胞之前，让角质形成细胞培养最多14天，具体操作见下一节。

2. 角质形成细胞的维持与传代

1. 使用包被基质试剂盒预包被6孔板。加入680 µl 试剂盒中的稀释液加入每孔，随后加入6.8 µl 加入包被基质溶液。轻轻振荡培养板，确保包被基质溶液在板上均匀分布。
2. 将包被好的培养板置于37℃孵育30分钟 室温下孵育。在接种角质形成细胞之前，去除包被基质溶液。
3. 用500 µl将角质形成细胞解离成单细胞悬液 每孔加入 0.25% 胰蛋白酶，作用 2–5 分钟 37 °C下，加入500 µl终止胰蛋白酶活性 含血清的培养基例如， 胎牛血清（FBS）培养基），并收集至无菌15 ml离心管中 移液管。使用无菌镊子移除毛发片段。
4. 使用血细胞计数板确定收获的细胞数量。
5. 离心细胞3分钟 在200 × g条件下离心。用PBS洗涤细胞，并重复离心。吸除PBS，将细胞沉淀重悬于新鲜的角质形成细胞培养基中。
6. 接种 4 × 10⁴ 将角质形成细胞接种至经细胞外基质包被的培养板的一个孔中，加入角质形成细胞培养基。将角质形成细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。₂ (图2C每天更换培养基，当细胞培养物汇合度达到约80%时进行传代，具体时间可能因角质形成细胞的传代次数和增殖速率而异，大约需要2–7天。应扩增所获得的角质形成细胞，以利用标准的慢速冷冻法建立足够的冻存储备。¹⁶.
   注意：所述培养条件可支持具有典型鹅卵石样形态的均一角质形成细胞群体的扩增图2C偶尔可在培养物中观察到少量已分化的角质形成细胞，这些细胞具有较大且扁平的形态，并已丧失复制潜能。角质形成细胞的表征可通过免疫染色进行，使用抗细胞角蛋白14的抗体，方法如前所述。 ¹⁷建立的角质形成细胞系在传代1-3次后，应使用市售试剂盒检测支原体污染。

3. 使用附加体型载体从角质形成细胞生成人诱导多能干细胞

1. 用0.1%明胶（2 ml/孔）预包被6孔板，明胶包被时间至少20分钟。 室温下
2. 用于重编程实验时，应使用传代不超过第6代的角质形成细胞。用1 ml单细胞悬液消化角质形成细胞 每孔加入 0.25% 胰蛋白酶，作用 2–5 分钟 在37 °C下，用1 ml使胰蛋白酶失活 含血清的培养基例如， FBS 培养基）并收集至 15 ml 离心管中 管
3. 离心细胞 3 分钟 在200 × g条件下离心并用角质形成细胞培养基重悬细胞。接种1 × 10⁵-1.5 × 10⁵ 每孔角质形成细胞置于明胶包被的培养板中过夜。
4. 次日（第0天），检查培养板，确保细胞融合度达到50–60%。
   注意：如果角质形成细胞的融合度小于约 50%，转染后可能生长不良。
5. 第0天，使用8 µl的比例，对角质形成细胞进行附加体型重编程载体的转染 转染试剂与2 µg总质粒DNA混合。
   1. 取每种质粒（pCXLE-eGFP、pCXLE-hOct3/4-shP53F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL）各0.5 µg，溶于100 µl中 减血清培养基（例如， OPTI-MEM
      注意：质粒pCXLE-eGFP用于监测角质形成细胞中的转染效率，但并非成功重编程所必需。
   2. 加入 8 µl 将转染试剂加入稀释后的DNA中，轻轻弹击管壁混匀。室温下静置DNA反应混合物15分钟，避免扰动。
   3. 更换为新鲜的角质形成细胞培养基。
   4. 轻轻将DNA反应混合物加入角质形成细胞培养物中，并在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育₂ 4小时
      注意：不建议在角质形成细胞中进行长时间转染（如过夜），因为转染后其存活率较低。
   5. 4 小时后 转染后，将角质形成细胞培养基更换为新鲜培养基。
6. 第1天（转染后1天），更换角质形成细胞培养基，并在荧光显微镜下通过估算表达eGFP的细胞百分比来检测转染效率。通常 > 使用本方案对原代角质形成细胞进行转染，可观察到60-70%的转染效率。
7. 第2天，按照步骤3.5所述重复转染。连续两次转染通常可达到 > 90% 转染效率。角质形成细胞培养通常在第二次转染结束时达到汇合。
   1. 为每种重编程反应准备一皿10 cm的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。有丝分裂失活的MEF饲养层的制备方法参照先前描述 ¹⁸.
   2. 用5 ml预包被一个10 cm培养皿 0.1% 明胶中孵育至少 20 分钟。接种 4 × 10⁶ 每10 cm培养皿中加入经有丝分裂失活的MEF，置于含FBS的培养基中。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜，使其充分沉降并贴壁。₂.
8. 第3天，按照步骤3.2和3.3所述，用0.25%胰蛋白酶消化收集角质形成细胞。将角质形成细胞重悬于KSR培养基中，并将6孔板中1个孔的90%角质形成细胞接种至含KSR培养基的10 cm MEF饲养层培养皿中。
9. 从第4天开始，每天更换KSR培养基。
   1. 或者从第18天起，每隔一天更换一次培养基。
      注意：未重编程的角质形成细胞将停止增殖，而具有明确边界、类似于人胚胎干细胞（hESCs）的hiPSC克隆将在第14至21天出现。
10. 从第21天开始，通过手动解剖分离hiPSC克隆。避免选择紧密聚集的hiPSC克隆，仅挑选与其他克隆明显分离的hiPSC克隆。
    注意：hiPSC 克隆可更早进行挑选，  但早期时间点的菌落较小，边界清晰的菌落可能并不明显。 不同患者的角质形成细胞重编程效率可能存在差异，且该效率还受角质形成细胞的传代次数或增殖速率等因素影响。
    1. 使用26G针头在解剖显微镜下对hiPSC集落进行手动解剖。将hiPSC集落切割成大小约为300–600 µm的小块。将一个hiPSC集落切割后的组织块转移至新的MEF饲养层培养板（2.5 × 10⁴ cells/cm²）中。⁴ MEF/cm²) 以建立hiPSC的克隆系。最初将每个hiPSC克隆系培养于12孔板或器官培养皿中的一个孔内，随后扩增至6孔板培养体系。
    2. 在饲养层细胞（MEF）上使用KSR培养基维持已建立的hiPSC克隆系。当培养物达到70–80%融合度，且hiPSC克隆直径约为1.5 mm时，根据制造商说明书，采用标准的酶法传代方法（Accutase、Dispase或Collagenase IV）对hiPSC进行传代。
11. 表征已建立的hiPSC细胞系，以确认其多能性及其分化为三胚层代表性细胞的能力 体外 和/或 体内^13,19此外，应使用市售试剂盒对已建立的hiPSC细胞系常规进行支原体检测，以确保无病原体污染。常规监测hiPSC细胞系的基因组稳定性  通过核型分析或基于芯片的拷贝数变异（CNV）分析。

结果

毛发经历三个不同的生长周期阶段：生长期（anagen）、退化期（catagen）和休止期（telogen）^20,21。生长期的毛囊包含多层上皮组织，这些层次包括外根鞘（ORS）、内根鞘（IRS）和毛干（图1）。生长期毛发最终会转变为退化期，此阶段以外根鞘细胞凋亡和毛干分化终止为特征。最后，退化期毛发进入休止期，此时细胞凋亡停止，休止期毛囊处于静止状态，并形成典型的休止期隆起结构^20,21。

图1展示了休止期毛发与生长期毛发的形态。我们通常使用生长期毛发来分离角质形成细胞。根据本方案，在毛发接种后最早第3天即可观察到角质形成细胞的外向生长（图2A），并会持续增殖（图2B）。根据我们的经验，部分生长期毛发可能无法成功贴壁或未见角质形成细胞外向生长；因此，建议从每位个体至少采集5–10根生长期毛发，以确保角质形成细胞分离成功。随后，角质形成细胞可传代至新的培养板，并可维持多次传代（图2C

讨论

生成患者特异性hiPSC为在病变细胞类型中研究发病机制提供了一种独特的方法 体外，并为药物筛选提供了一个平台，以鉴定能够挽救疾病表型的新分子。利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行疾病建模的方法已在多种疾病中取得有前景的成果，包括长QT综合征、亨廷顿病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症 ²²美国、欧洲、澳大利亚、中国、韩国和日本已有多项计划正在推进，旨在建立大规模的患者特异性hiPSC文库 ^23,24.

本文描述了一种从毛发来源的角质形成细胞建立人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案，该方案有望促进并加速构建大规模的疾病特异性hiPSC文库。本方案具有两个优势：首先，该方案采用的附加体型系统可利用六种重编程因子的混合物（OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、靶向p53的shRNA）以相对较高的效率获得无整合的hiPSCs⁴。与逆转录病毒或慢病毒介导的重编程方法相比，附加体载体的使用可避免在重编程过程中外源转基因意外整合到基因组中。因此，许多研究项目倾向于采用无整合的重编程方法（如附加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素混合液：
250 ng/ml 抗真菌剂两性霉素B	Sigma	A2942-20ml	抗生素混合液用PBS配制。
1X 青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
PBS（-）	Invitrogen	14190-144
无血清替代培养基（Knockout Serum Replacement, KSR）			使用 Stericup（Millipore，#SCGPU05RE）过滤 KSR 培养基，使用前新鲜加入 bFGF。
20% 敲除血清替代物 (KSR)	Invitrogen	10828-028
含谷氨酰胺的DMEM/F12培养基	Invitrogen	10565-042
1× MEM非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050
0.5× 青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
0.1 mM β-巯基乙醇	Invitrogen	21985
bFGF（10 ng/ml，新鲜添加）	Millipore	GF003
角质形成细胞培养基：
EpiLife 加 60 µM 钙	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1× 人角质形成细胞生长补充剂（HKGS）	Invitrogen	S-001-5
胎牛血清（FBS）培养基：			使用 Stericup（Millipore，#SCGPU05RE）过滤 FBS 培养基，过滤后使用。
10% 胎牛血清（FBS）	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x 青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
2 mM L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056
细胞外基质（ECM）：
Matrigel	康宁	354234	分装 Matrigel 原液并保存于 -80°C 按照制造商说明’s 操作说明。Matrigel 的储存浓度因批次略有差异（~9 mg/ml）。我们建议使用 200µl 用于包被12孔板的Matrigel（约150µg/孔
包被基质试剂盒	Invitrogen	R-011-K
质粒：			请注意，pCXLE-eGFP 仅用于监测转染效率，重编程过程并不需要。
-          pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-          pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-          pCXLE-hSK	Addgene	27078
-          pCXLE-hUL	Addgene	27080
转染试剂 Fugene HD	Promega	E231B
明胶（来自猪皮）	Sigma	G1890	用蒸馏水配制0.1%明胶溶液，使用前高压灭菌。
低血清培养基：OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层			MEF 可通过丝裂霉素 C 处理或辐照灭活，具体方法如先前所述16。
26G针头	Terumo	NN2613R
6孔板（组织培养处理）	BD 生物科学	353046
12孔板（组织培养处理）	BD 生物科学	353043
10 cm 培养皿（组织培养处理）	BD 生物科学	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	使用浓度为 10 mg/ml
胶原酶IV	Invitrogen	17104-019	使用浓度为 1 mg/ml
TRA-160 抗体	Millipore	MAB4360	使用浓度为5 µg/ml
OCT4 抗体	Santa Cruz	SC-5279	5时使用 µg/ml
NANOG 抗体	R&D Systems	AF1997	10时使用 µg/ml
MycoAlert 检测试剂盒	Lonza	LT07-418