新生儿期母体分离小鼠模型中肛周感觉敏感性及前列腺肥大细胞活化的评估

摘要

我们正在测量经历早期生活应激范式——新生儿期母体分离的雄性C57BL/6小鼠前列腺中的会阴部机械敏感性及肥大细胞活化情况，以建立慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的临床前模型。

摘要

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的终生患病率为14%，是50岁以下男性最常见的泌尿系统诊断疾病，然而它却是最不被了解且研究最少的慢性盆腔疼痛障碍。相当一部分慢性盆腔疼痛患者报告曾经历过早年生活压力或虐待，这些经历可能显著影响下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的功能与调节。肥大细胞活化在CP/CPPS患者的尿液和前列腺按摩液中均被发现增强，而该过程部分受到HPA轴下游激活的调控。新生期母体分离（NMS）已被用于啮齿类动物模型中研究早年生活压力的影响达二十多年，包括对HPA轴功能和内脏敏感性的改变。本文提供了一项详细的实验方案，介绍如何使用NMS作为雄性C57BL/6小鼠中CP/CPPS的临床前模型。我们描述了实施NMS的操作方法、评估生殖器周围机械性异常性疼痛以及肥大细胞活化的组织学证据的方法。此外，我们还提供了证据表明，早期心理应激可对小鼠雄性泌尿生殖系统产生长期影响。

引言

慢性盆腔疼痛本身并非一种疾病，而是一个术语，用于描述被诊断为肠易激综合征（IBS）、间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/PBS）、外阴痛或慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的患者所经历的持续性自发性疼痛和/或诱发性疼痛。这些综合征常合并存在，且具有许多共同特征，例如均无明确的相关病理改变或已知的潜在病因，尽管已有研究表明免疫系统、中枢神经系统及周围神经系统的功能障碍可能参与了这些疾病的发生与进展^1-3。患有慢性盆腔疼痛的患者更可能出现其他非盆腔相关的功能性疼痛障碍及情绪障碍症状，包括焦虑、抑郁和惊恐障碍^4-6，这些症状与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能改变相关^7-10。早年生活压力或创伤是导致HPA轴异常及相关的慢性疼痛综合征的重要危险因素^10,11，因此，相当一部分功能性盆腔疼痛障碍患者报告曾经历过虐待或忽视等不良童年事件^12-14。

在过去的二十年中，新生期母鼠分离（NMS）动物模型被广泛用于研究生命早期应激的影响，该模型在断奶前特定时期将幼鼠从母鼠身边移开一段时间。通常情况下，NMS 可通过直接影响下丘脑内的基因表达以及干扰边缘系统结构的下游调控，增强下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的激活，从而导致类似焦虑的行为^15-18。已有研究表明，HPA 轴功能的紊乱可导致 NMS 啮齿类动物模型出现结直肠^19-22

方案

本方案中描述的所有实验均符合美国国立卫生研究院（NIH）指南，以及堪萨斯大学医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）规定的相关指南。

1. 新生儿期母体分离（NMS）

1. 每天监测怀孕母鼠的分娩情况。
   注意：幼崽出生的当天记为P0。
2. 在P1天，将母鼠从原笼中移出，并放入一个干净的次级容器中。
3. 用戴有洁净手套的双手揉搓一把原笼垫料，以保留原笼的气味。
4. 将1–2 cm厚的原笼垫料加入一个洁净且适当标记的2 L玻璃烧杯中。同时加入原笼中所含额外丰富化垫料材料约一半的量，e.g., 巢垫（nestlet）、皱纸（crinkle paper），一同放入玻璃烧杯中。
5. 将同一窝的所有幼崽逐个轻柔地放入同一个烧杯中。
6. 立即将烧杯放入温度维持在33 ^oC、湿度50%的培养箱中，持续180分钟。
7. 将母鼠从次级容器中移出，并将其放回原笼。将原笼放回动物房内指定的饲养位置。
8. 对每窝接受NMS处理的幼崽重复此操作，每次均需使用洁净的手套和次级容器。
9. 在180分钟分离期结束时，按先前移出的相同顺序将各窝幼崽放回其原笼中。
10. 取出当天早些时候被分离的第一窝幼崽的原笼。将母鼠从原笼中移出，并放入一个干净的次级容器中。
11. 将第一个烧杯从培....

结果

经历新生儿母体分离（NMS）的小鼠表现出与慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）相关的行为主征。在使用一系列强度递增的冯·弗雷单丝纤维进行测试时，8周龄的NMS小鼠（n = 4）与未受干预的对照组小鼠相比，表现出明显的会阴区机械性异常性疼痛（n = 5，图2）。表现为诱发阳性行为反应的机械缩足阈值显著降低（p < 0.01；Student t检验），该反应记录为对单丝刺激出现迅速的抽动或跳跃，或出现舔舐或啃咬单丝的行为。

暴露于NMS的小鼠也表现出CP/CPPS的组织学证据。前列腺组织的冷冻切片经酸性O-联苯胺蓝染色，以观察肥大细胞内储存的类胰蛋白酶颗粒图3A-D显示激活迹象的肥大细胞百分比， 例如， 弥散性异染性，细胞边界外存在颗粒图3D），与未处理的对照组小鼠相比，在8周龄NMS小鼠的前列腺组织中显著升高p < 0.0001，学生t检验， 图3E无论颗粒化状态如何，幼.......

讨论

本方案提供了采用新生儿期应激（NMS）诱导成年雄性小鼠出现慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）相关症状的方法。成年期的NMS小鼠表现出显著的生殖器周围机械性异常性疼痛，以及前列腺组织中肥大细胞脱颗粒的证据。使用NMS建立CP/CPPS临床前模型是一种新颖的方法，因为它模拟了CP/CPPS患者常报告的早期生命应激^12-14，同时采用非侵入性诱导方式，而非更常用的化学或免疫诱导的前列腺炎症^34,36-39。此外，已有研究表明，小鼠的NMS可导致共病症状，包括焦虑样行为和快感缺失行为的改变、排尿频率增加以及后爪感觉过敏（¹⁶；数据未显示），这与CP/CPPS患者表现出的共病性躯体、情绪及内脏功能障碍相似^4-6。

使用新生期母体分离（NMS）在小鼠中诱导慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的主要优势在于，它通过心理干预引发生理变化。CP/CPPS患者的病因具有异质性，大多数情况下并不涉及前列腺的既往感染或直接损伤^1-3。尽管如此，已发表的CP/CPPS动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
妊娠 C57BL/6 雌性小鼠	Charles River	027	应每日监测定时或非定时妊娠雌鼠，以观察其在本单位内分娩情况。
2 L 玻璃烧杯	Sigma-Aldrich	CLS10002L	每窝新生小鼠在整个 21 天分离期间应始终置于同一烧杯中。
VWR 强制通风培养箱，基础型	VWR International	414005-124	培养箱应维持在 33°C 和 50% 湿度。
触觉测试感觉评估仪，20 套装（Semmes-Weinstein Von Frey 麻醉计用于触觉评估）	Stoelting	58011	以下单丝应被用于会阴部敏感性评估：1.65 g、2.36 g、2.83 g、3.22 g、3.61 g、4.08 g、4.31 g 和 4.74 g。
动物饲养盒（可容纳 12 只小鼠或 6 只大鼠）	IITC	435	务必在单个丙烯酸动物饲养盒顶部放置重物，以防止小鼠逃逸。
小鼠和大鼠用网架（可容纳 12 只小鼠或 6 只大鼠）	IITC	410	将网架放置于稳固的台面上，以便于操作。
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5493	将 10x PBS 储存液稀释为 1x PBS。
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	需要配制 4% 多聚甲醛溶液，用于小鼠心脏灌注及组织后固定，为肥大细胞染色做准备。
蔗糖	Sigma-Aldrich	S5016	将固定组织在 30% 蔗糖溶液中于 4°C 下过夜进行冷冻保护。
庚烷	Sigma-Aldrich	246654	将庚烷置于干冰上冷却，以冻结组织。
标准冷冻模具	VWR International	4557	用于协助在冷冻切片前冻结前列腺组织
Tissue-Tek OCT 包埋剂	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus 显微载玻片	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich	198161	经生物染色剂委员会认证，适用于肥大细胞的异染性染色。
乙醇，绝对乙醇（200 证明）	Fisher Scientific	BP2818-4	分子生物学级，Fisher Bioreagents；在观察肥大细胞前，需要使用 95% 和 100% 溶液对染色后的冷冻切片进行脱水。
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888	酸化 NaCl 溶液应在染色冷冻切片前新鲜配制。
GeneMate 无菌 50 ml 离心管	BioExpress	C-3394	一次性试管，用于混合甲苯胺蓝组分或将载玻片浸入 1xPBS 中。
可容纳 10 张载玻片的 Coplin 染色缸，带磨砂玻璃盖	Fisher Scientific	08-815	最多可容纳 10 张标准尺寸 3 x 1 英寸（75 x 25 mm）载玻片，背对背放置。分别使用不同的染色缸盛装甲苯胺蓝工作液、95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯。
二甲苯（组织学用）	Fisher Scientific	X3P	组织脱水后需用二甲苯进行透明处理。
显微载玻片盒，100 片装	VWR International	82003	可用于载玻片的储存和运输。
Fisherbrand 显微载玻片盒	Fisher Scientific	22-363-400	此类载玻片盒通常足够小，可放入冷冻切片机中。
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	甘油是一种传统的封片介质。
封片介质，Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	封片介质可牢固地将盖玻片粘附于载玻片上。
矩形显微盖玻片，1 号	VWR International	48393-106	在脱水和透明处理后的组织上加盖盖玻片，以保护样本。
光学显微镜	Nikon		我们实验室使用的 Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i 已停产，由 Eclipse Ni-E 取代。