本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。
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摘要
摘要
患者来源的异种移植（PDX）模型在癌症研究中日益受到重视，被广泛用于临床前药物评估、生物标志物鉴定、生物学研究以及个体化治疗策略的开发。循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤转移过程中发挥关键作用，并已从多种肿瘤类型的患者中成功分离。近期，CTC已被用于建立乳腺癌和前列腺癌的PDX实验模型。本文详细描述了我们课题组建立的从CTC衍生前列腺癌PDX模型的技术方法。相较于传统PDX模型，该方法的优势在于无需依赖手术标本获取，并可在疾病的不同阶段建立实验模型。通过密度梯度离心，继而进行红细胞裂解及流式细胞术去除CD45阳性单个核细胞，可从转移性肿瘤患者外周血样本中富集CTC。随后将富集的CTC注射至免疫缺陷小鼠体内，所形成的异种移植瘤可用于功能学研究，或收获后进行分子特征分析。该方法的主要局限性在于CTC富集中采用的阴性筛选策略。尽管存在这一局限，从CTC建立PDX模型仍为前列腺癌研究提供了一种全新的实验平台。
引言
患者来源的异种移植模型（PDX）是目前癌症研究中日益流行的实验模型。该模型可用于生物标志物和生物学通路的表征、药物疗效的临床前评估，以及为个体化癌症治疗创建“替身”模型1,2。此前，其他研究团队已通过将单细胞肿瘤悬液或完整肿瘤组织移植或注射到免疫缺陷小鼠体内，建立了PDX模型1。这些PDX 模型需要通过外科手术从接受手术的患者体内获取新鲜的实体肿瘤、恶性腹水或胸腔积液，这一过程不仅成本高昂，而且会增加患者发生医源性并发症的风险。
癌症研究领域的一项重要近期进展是循环肿瘤细胞的检测、分离与表征。这些肿瘤细胞从原发性肿瘤组织脱落，进入血液循环，在转移和复发过程中发挥关键作用，而转移与复发是癌症相关死亡最常见的原因3。对多种实体瘤来源的循环肿瘤细胞（CTC）进行评估与表征，已为疾病的诊断、预后判断以及残留病灶监测提供了重要的临床信息3。目前已有多种方法可用于高效分离CTC，这些方法主要依赖于CTC的物理特性、生物标志物表达或功能特征4。现有的宏观尺度CTC分离技术包括密度梯度离心法、滤膜孔径物理过滤法以及基于表面分子的分离法。其中应用最广泛的CTC分离方法是基于抗体捕获CTC的技术。可通过正向或负向筛选细胞表面标志物，从外周血中分离CTC。在外周血中对CTC进行正向筛选通常采用上皮标志物（例如，EpCAM），该标志物在CT....
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方案
本方案已在本机构实施，并获得了机构研究伦理委员会的批准，符合所有机构、国家和国际关于人类福祉的指南。
1. 晚期前列腺癌患者外周血的采集
注意：选择转移性前列腺癌患者。获取患者的书面知情同意，并记录患者的临床特征，包括分离时的年龄、既往化疗和激素治疗情况。转移性疾病的患者外周血中可能存在最高浓度的循环肿瘤细胞 。
- 在获得知情同意并遵循经机构审查委员会批准的适当方案后采集血样。整个操作过程中需佩戴乳胶手套并穿上实验服。
- 将25 G 蝶形针与导管连接至针柄。使用酒精棉片清洁上臂与前臂之间肘正中静脉区域，然后在患者上臂绑扎止血带。
- 将蝶形针插入肘正中静脉，推动采血管进入针柄以开始采血。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管收集约10 ml 血液，以防止凝血。
- 从患者身上移除蝶形针，并用无菌纱布垫在静脉穿刺部位施压1分钟。随后用无菌绷带覆盖该部位。
2. 单个核细胞的分离
注意：从步骤1收集的血液除单核循环肿瘤细胞（CTCs）外，还将含有外周血单个核细胞（PBMCs）（例如， 淋巴细胞和单核细胞）。
- 用5 ml血清移液管将全血移入50 ml....
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结果
本方案将通过分离的CD45阴性前列腺癌循环肿瘤细胞（CTC）建立PDX模型。根据本方案中采用的阴性筛选方法，必须使用DAPI染色排除死细胞。通过流式细胞术检测到的CD45阴性细胞比例存在差异，具体取决于患者的肿瘤负荷（图1A）。对未分选细胞进行CD45和DAPI（用于识别细胞核）的免疫荧光染色，可观察到CD45阴性细胞，如白色箭头所示（图1B）。在图1C中，可见小鼠双侧 flank 出现皮下结节样密度影。每个结节样密度代表异种移植瘤的生长，其自小鼠背部肌肉组织突出，质地较硬，可与正常组织明显区分。从细胞植入到异种移植瘤形成的时间间隔可能差异较大，具体取决于患者样本中CTC的负荷量、植入细胞数量以及CTC的生物学侵袭性。由CTC建立的前列腺癌PDX模型在苏木精-伊红染色以及针对前列腺特异性细胞标志物（如雄激素受体（AR）和前列腺特异性膜抗原（PSMA））的免疫组化染色中，均能重现人类前列腺肿瘤的特征（图1D）。
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讨论
本文描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植（PDX）模型的方法。使用CTCs建立PDX 与现有方法相比，模型具有若干潜在的重要优势。首先，通过外周血可便捷地收集循环肿瘤细胞（CTCs），从而能够从同一患者在不同疾病阶段建立实验模型。其次，与需要通过手术获取肿瘤细胞的现有方法相比，血液采集是一种更安全且成本较低的肿瘤细胞分离方法。
已报道多种循环肿瘤细胞（CTC）富集方法，但由于经费和资源限制，许多方法并非所有实验室均可采用。我们旨在本实验室建立一种可充分利用流式细胞分选术（FACS）的检测方法，该技术对许多实验室而言便捷、经济且易于获取。该方法的一个潜在局限性在于其对稀有细胞的检测灵敏度不足，这可能限制本方案在肿瘤负荷较低患者中的应用。若干其他技术可通过利用上皮细胞的物理或生物学特性来克服这一局限性，从而提高此类稀有细胞群体的检出与分离效率4。本方案所描述的CTC富集方法采用阴性筛选策略：去除表达CD45+的白细胞，保留CD45-的CTC。在进行流式细胞.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢西奈山医学中心流式细胞术共享资源平台的Jordi Ochando博士在流式细胞术分析方面的协助。我们感谢西奈山医学中心显微成像共享资源平台的Rumana Huq博士在成像方面的技术支持。作者感谢TJ Martell基金会对本项目的资助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 35 µm 细胞滤器 | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml 聚苯乙烯圆锥形离心管 | Crystalgen | 23-2263 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7757 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| 带细胞滤器帽的 12 mm x 75 mm 聚苯乙烯试管 | BD Falcon | 352235 | |
| BD Vacutainer 紫色抗凝血采集管（含 EDTA） | |||
| BD 带推钮回缩针头的蝶翼式采血套装（23 号） | |||
| BD Vacutainer 一次性使用采血针 holder | |||
| 一次性乳胶止血带 | |||
| 乳胶或非乳胶手套 | |||
| 酒精棉片 | |||
| 2 英寸 × 2 英寸棉纱垫 | |||
| 粘性绷带 | |||
| 25 G 针头 | |||
| 1 ml 注射器 |
参考文献
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinica....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/01/2015. Citeable Link.
A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo
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