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伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

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DOI：

10.3791/53183

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2015年11月30日

 ,  ,  , 
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。

摘要

斑马鱼模型是研究神经肌肉疾病的一种新兴体系。在神经肌肉疾病的研究中，肌膜的完整性是一个关键的疾病决定因素。迄今为止，许多神经肌肉疾病均表现出肌纤维退化且肌膜完整性异常；这种情况在肌营养不良症中最为常见。伊文思蓝染料（Evans Blue Dye, EBD）是一种活体可渗透细胞的染料，能够快速进入退化、受损或凋亡的细胞；相比之下，具有完整细胞膜的细胞则不会摄取该染料。EBD注射通常被用于评估神经肌肉疾病小鼠模型中的肌肉完整性。然而，此类EBD实验在分析前通常需要进行肌肉解剖和/或切片处理。相比之下，在斑马鱼中，EBD的摄取可在活体、完整标本中直接观察。本文中，我们展示了一种在活体斑马鱼中进行EBD注射与分析的简单且直接的方法。此外，我们还介绍了一种共注射策略，以提高EBD分析的效率。总体而言，本视频文章概述了在神经肌肉疾病斑马鱼模型中进行EBD注射与表征的完整流程。

引言

肌营养不良症是一组具有特定组织病理学特征的常见且异质性的人类肌肉疾病1,2。这类严重疾病通常伴随的症状包括肌肉无力、肌肉变性、运动能力丧失以及早亡1,3。肌营养不良症的主要致病机制是稳定肌膜、锚定跨膜复合物以及介导跨膜细胞信号传导的蛋白质缺失4-6。例如，作为肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物主要骨架蛋白的肌营养不良蛋白（dystrophin）完全缺失，会导致杜氏肌营养不良症中肌肉细胞膜的不稳定7。由于大多数肌营养不良症源于参与细胞外基质与肌膜细胞骨架连接的蛋白质发生突变，因此在细胞水平上的一个普遍现象是肌膜完整性的丧失8,9。对肌营养不良症主要致病机制的认识，是多年来利用动物模型系统开展研究的成果2,10-15。然而，尽管该领域已取得进展，目前仍缺乏有效的治疗或管理各类肌营养不良亚型的疗法。可行疗法受限的主要原因包括以下几个关键因素：1）基因治疗策略的困难；2）新发疾病病例频率高，且缺乏可转化的动物模型；3）缺乏严格的策略来评估潜在治疗药物的生理效应，且缺少明确且可重复的结局评估指标。

为了克服其中一些局限性，包括我们实验室在内的众多研究团队正在采用斑马鱼作为研究人类神经肌肉疾病的模型系统2。迄今为止，斑马鱼已被证明是疾病研究中一种有价值的工具。该模型已被用于发现并验证新的人类致病突变16,17，阐明尚未明确的致病机制17,18，以及发现新的治疗策略12,19。这些进展部分得益于斑马鱼模型的经典优势，例如其光学通透性、易于进行遗传操作以及可大量繁殖的特点20。此外，斑马鱼也已被证实适用于大规模药物筛选21，这是一种发现新型治疗手段的宝贵方法22-24。在肌肉疾病研究方面，这些优势进一步结合了通过解离方法分离单个斑马鱼骨骼肌纤维的能力25，以及利用一种称为双折射的光学现象在活体（in vivo）中观察肌纤维结构的能力26，从而可快速评估宏观肌肉的完整性。尽管已有这些可用的技术手段，仍需持续开发新的工具以推动研究进展。

我们及其他研究者已改进了一种在斑马鱼模型中进行伊文思蓝染料（EBD）注射与分析的实验方案。EBD 是一种活性染料，可穿透细胞膜，被受损、变性或凋亡的细胞摄取，随后可在荧光显微镜下观察到27。迄今为止，EBD 分析已广泛用于研究小鼠骨骼肌和心脏疾病模型中的肌膜完整性8,9,27。然而，在哺乳动物样本中，收获的肌肉组织通常需要繁琐的切片或解剖步骤才能进行分析。而在斑马鱼中，可直接对大量活体且完整的个体进行分析。在本视频文章中，我们将展示在活体斑马鱼幼鱼中进行 EBD 注射与分析的方法，并以杜氏肌营养不良症突变品系 sapje 斑马鱼中 EBD 摄取的代表性图像为例进行说明15,28。此外，我们还提出了一种共注射策略，可提高 EBD 样本的定量分析能力。

方案

1. 琼脂注射平板的制备（时间：45 分钟）

  1. 将2%至3%的琼脂糖在E3培养基中煮沸，然后在实验台上稍作冷却。注意：制备的注射平板数量决定了所需琼脂糖的用量。每个注射平板大约需要35 ml琼脂糖溶液。
  2. 煮沸后，让琼脂糖冷却至达到所需温度（例如., 45 °C）按照注塑模具制造商的说明进行操作。
  3. 将约 35 ml 冷却的琼脂糖倒入 100 mm 培养皿中。
  4. 将首选注射模具的一端放入溶液中，然后将模具的其余部分平放在琼脂糖溶液上（这有助于减少气泡的产生）。
  5. 让琼脂糖溶液在室温或4℃下凝固 °约30分钟，温度为C
  6. 使用刮勺将模具的一端与凝固的琼脂糖分离，然后缓慢移除模具的其余部分。

2. 伊文思蓝染料（EBD）注射液的配制（时间：30 分钟）

  1. 用1× Ringer’s溶液（155 mM NaCl；5 mM KCl；2 mM CaCl2；1 mM MgCl2；2 mM Na2HPO4；10 mM HEPES；10 mM 葡萄糖；调pH至7.2）配制1%的EBD储备液，可在室温下保存。
  2. 用1× Ringer’s溶液配制荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（分子量10,000 kDa）的储备液，浓度为25 mg/mL，并于-20 °C保存。
  3. 通过将EBD稀释至0.1%直接加入FITC-葡聚糖储备液中来制备注射混合液（即，对于最终工作体积为100 µl的情况：将10 µl的1% EBD加入90 µl的FITC-葡聚糖储备液中混合）。
  4. 充分涡旋震荡注射混合液（应变为绿色），并将装有混合液的管子用铝箔包裹以避光保存。

3. EBD 注射准备（时间：约 30 分钟）

注意：本实验方案最适合使用受精后3至7天（dpf）的幼虫。

  1. 将注射板预热至室温（RT）。
  2. 在金属板和支架上安装显微操作仪，并将其置于用于注射的显微镜旁，搭建注射装置。打开气动显微注射控制器。注意：不同实验室所采用的注射系统可能有所不同，但这不应影响分析结果。
  3. 用约 2–4 µl 的 EBD 混合液反向填充注射针头。
  4. 校准注射体积至约 5 nl 的 EBD 混合液。注意：注射体积的校准取决于所用校准方法。活塞驱动式注射器可直接设定指定注射体积，而气体压力注射器则需通过千分尺测量液滴体积进行校准。
  5. 用 1× Ringer 溶液润湿注射板，并去除孔中的多余液体。
  6. 在注射开始前，用 1× Ringer 溶液稀释的 0.04% 间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（三卡因）对幼虫进行预处理，以使其 immobilize（固定）。注意：确保幼虫完全不动至关重要，因为任何残余运动都会使准确注射变得困难。
  7. 使用玻璃移液管将麻醉后的幼虫放入琼脂注射板的孔中。确保幼虫完全位于孔内并侧卧。注意：每孔中放置的幼虫数量由实验人员自行决定。
  8. 幼虫放入孔中后，去除多余的 Ringer 溶液以减少幼虫在孔内的移动，但保留少量溶液以防止幼虫脱水。

4. 斑马鱼幼鱼的心包注射伊文思蓝染料（时间：取决于注射幼鱼数量，预计 1–3 小时）

  1. 将含有幼鱼的注射板放置在体视显微镜下，准备进行注射操作。
  2. 将含有EBD混合液的注射移液针置于斑马鱼幼鱼上方。
  3. 通过旋转注射板调整其位置，使注射针靠近幼鱼心脏，并与前后轴呈约45°腹侧角。
  4. 将注射针插入公共主静脉（CCV），进针部位为卵黄前部的静脉区域，即静脉开始转向背侧的位置（图1）。注意：使用最高达40倍的放大倍数可能有助于清晰观察CCV。
  5. 注入5 nl的EBD混合液，并保持注射针位置不动5–8秒，以尽量减少EBD混合液的立即外漏。注意：成功的注射可在心脏腔室内观察到染料着色（图1）。若未在心脏中观察到EBD混合液，可再注射5 nl以促进染料摄取；或者，也可弃用该胚胎。
    注意：在某些情况下，心脏可能会停止跳动。若发生此情况，请继续监测幼鱼20–40秒。通常随着染料在循环系统中的移动，心脏会恢复跳动。
  6. 继续对下一个幼鱼进行操作并重复上述步骤。
  7. 注射后立即观察血管中是否存在FITC-葡聚糖，以确认成功注射的胚胎（图2）。

5. 孵育及EBD吸收（时间：4-6小时）

  1. 注射完所需数量的幼虫后，将已注射的幼虫放回含有1X任氏液（不含三卡因）的100 mm培养皿中。
  2. 用铝箔纸包裹培养皿。注意：将注射后的幼虫置于黑暗环境中可显著提高存活率，并确保信号强度的最大一致性。在幼虫离开培养箱期间，用铝箔纸包裹尤为重要。
  3. 在28.5 °C下孵育幼虫4–6小时，以确保足够的EBD摄取。

6. 肌肉中EBD显影（时间：取决于注射的幼虫数量和显微镜类型，预计0.5-3小时）

  1. 成像前，使用 0.04% 三卡因麻醉幼虫以防止其移动。
  2. 在红色荧光下观察幼虫，以确定骨骼肌中是否发生 EBD 摄取（图 3）。

结果

将EBD注射混合物注入CCV中 sapje 3 dpf 的纯合突变体及野生型同胞。注入后充满心腔的样本（图1B) 随后通过绿色荧光下观察血管内的 FITC-葡聚糖，以分析注射是否成功。图2).

经过4小时的孵育后，使用荧光显微镜在体节水平观察EBD的摄取情况。野生型同胞个体在任何可见的肌纤维中均未出现EBD荧光（图3A），而sapje纯合突变体则表现出EBD摄取，表明肌膜存在损伤15（图3B）。

斑马鱼胚胎发育阶段的显微镜图像，突出显示组织分化变化。
图1. 将EBD注射混合物注入斑马鱼胚胎的公共主静脉（CCV）。（A）未注射的胚胎。箭头指示CCV注射的理想位置。（B）成功注入CCV。染料进入心脏腔室（箭头），并开始通过血管系统被泵送。（C）不成功的CCV注射将导致部分或全部染料进入胚胎的卵黄囊（箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示斑马鱼肌纤维中蛋白质分布的荧光显微镜图像。
图 2. 可通过在注射后立即观察绿色荧光下贯穿血管系统的FITC-葡聚糖分布情况（在EBD摄取前），对胚胎进行筛选以识别注射成功的个体。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示正常肌纤维（A）和伴有炎症的受损肌纤维（B）的肌肉组织显微图像。
图 3：EBD 会被细胞膜受损的肌纤维摄取。（A）野生型同胞个体，肌纤维中无 EBD 荧光信号。（B）Sapje 纯合突变体，多个肌纤维内可见 EBD 荧光（箭头所示）。所有幼鱼均注射了 EBD 注射混合液，并在 3 dpf 时于 4 小时孵育后进行分析。在注射 CCV 前，根据肌纤维脱离情况对同胞个体与突变体进行分选。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

斑马鱼正成为研究神经肌肉疾病的一种强大工具2,29。迄今为止，斑马鱼系统已被用于验证新的肌肉疾病致病突变16,17,30，阐明新的致病机制18，并鉴定潜在的新型治疗药物12,24。这些共同努力已确立了斑马鱼在模拟人类神经肌肉疾病方面的实用性。然而，尽管斑马鱼和哺乳动物模型已取得诸多进展，但在广泛的神经肌肉疾病谱系中，患者可接受的治疗选择仍然有限。因此，针对这一类破坏性疾病，开发疗法的需求极为迫切。与治疗需求并行的是对持续实验创新的相应需求，以及对新动物模型和潜在治疗策略进行严格验证的必要性。

EBD 分析常用于小鼠模型，以研究脑、心脏和骨骼肌中的组织与细胞损伤27,31。尤其值得注意的是，EBD 被广泛应用于多种肌营养不良亚型的小鼠模型中，用以显示肌膜不稳定性和损伤的严重程度8。利用 EBD 揭示肌膜损伤是支持性参数之一，可用于确立动物模型与人类疾病状态之间的相似性9。由于 EBD 在小鼠模型中的强大应用价值，包括我们实验室在内的多个研究团队已将其发展并应用于神经肌肉疾病相关的斑马鱼模型。鉴于 EBD 分析的适用性，该技术正被积极用于验证斑马鱼模型与人类疾病状态的一致性11,15,22,24,32。肌膜受损的幼鱼会摄取 EBD，从而在肌纤维内呈现红色荧光。若荧光出现在肌纤维间隙而非单个肌纤维内部，则可能提示肌纤维在无肌膜损伤的情况下从基底膜上脱落，这一现象也具有重要的诊断价值。EBD 分析的应用潜力不仅限于动物模型的验证。我们实验室的最新研究已表明，EBD 分析在验证潜在新型治疗药物方面具有重要价值24。通过检测潜在治疗手段是否能够减少或消除神经肌肉疾病模型中的 EBD 摄取，可判断其是否具有治疗效应8。此类分析有助于阐明治疗药物的作用机制，并进一步拓展 EBD 分析的应用范围。

与许多技术一样，EBD 分析在实验设计和操作过程中也存在若干需要注意的事项。例如，由于组织随着年龄增长而增厚，识别球状心静脉（CCV）可能具有挑战性。此外，在心包注射前及注射过程中，幼虫容易受损，从而降低实验样本数量，并增加需要准备大量幼虫的需求。进一步地，操作和注射过程中对幼虫造成的物理损伤可能导致假阳性结果，因为受损的肌肉组织可摄取 EBD。为了克服其中一些困难，本视频文章介绍了一种共注射策略，可在注射后立即识别成功注入染料的幼虫，从而在后续分析之前实现简便且可靠的筛选。通过共注射 FITC-葡聚糖，可在 EBD 被肌纤维摄取之前确认其是否进入血管系统，以此作为注射成功的对照。这一点尤为有用，因为若 EBD 未被肌纤维摄取，其荧光在数小时后会在幼虫体内变得高度弥散，难以检测。此外，若未能准确注射至 CCV 而将 EBD 注入卵黄或体腔，经过孵育后可能产生类似于对照胚胎的弥散性红色荧光，但受损肌纤维摄取染料的可能性较低。综上所述，这些注意事项表明，EBD 注射需要耐心和反复练习，才能获得稳定且可靠的结果。

总之，我们介绍了一种在斑马鱼幼鱼中进行EBD分析的实用且简便的方法。迄今为止，斑马鱼作为模式生物系统，特别是作为人类疾病模型的应用，正在迅速扩展。这一扩展部分归因于实验技术的持续发展与改进，这些技术进一步提升了斑马鱼系统现有的优势。EBD注射技术为研究人员提供了一种额外而有力的工具，可用于验证和研究斑马鱼肌肉疾病模型。该技术的持续应用与优化有望帮助揭示新的治疗策略以及致病机制。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

我们谨此致谢 特伦特·沃夫（Trent Waugh） 技术协助。我们还感谢病童医院儿科系和治愈先天性肌营养不良症（CMD）组织为本项目提供的慷慨资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖，分子量 10,000SigmaFD10S
伊文思蓝染料SigmaE2129
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐SigmaA5040
100 mm 培养皿FischerbrandFB0875712注射模具底座
薄壁玻璃毛细管World Precision InstrumentsTW100F-4用于注射针头
琼脂糖BioshopAGA001注射模具
显微注射模具Adaptive Science ToolsTU-1注射模具
氯化钠BioshopSOD001林格氏液
氯化钾BioshopPOC888林格氏液
六水合氯化镁SigmaM2670林格氏液
一水合磷酸二氢钠SigmaS9638林格氏液
HEPESSigmaH4034林格氏液
葡萄糖BioBasicGB0219林格氏液
氯化钙SigmaC1061林格氏液

参考文献

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