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利用相关显微技术研究完整细胞中表皮生长因子受体的化学计量比

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DOI：

10.3791/53186

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2015年9月11日

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

本文内容

摘要

本方案描述了在COS7成纤维细胞上表皮生长因子受体（EGFR）的标记，以及随后对处于水合状态的完整细胞进行相关联的光学显微镜与电子显微镜成像。标记物包含荧光量子点。该方案可用于在单分子水平上研究EGFR的化学计量关系。

摘要

本方案描述了在COS7成纤维细胞上对表皮生长因子受体（EGFR）进行标记，并对处于水合状态的完整细胞进行荧光显微镜与环境扫描电子显微镜（ESEM）的关联成像。通过两步标记法将荧光量子点（QDs）与EGFR偶联，实现了高效且特异的蛋白标记，同时避免了标记物诱导的受体聚集。荧光显微镜提供了EGFR在细胞内分布位置的概览图像。利用扫描透射电子显微镜（STEM）探测器，以纳米级分辨率检测量子点标记。所得的关联图像提供了在完整水合细胞自然环境中EGFR分布情况以及单分子水平上的化学计量信息。ESEM-STEM图像显示，该受体以单体、同源二聚体以及小簇形式存在。使用两种不同的量子点进行标记，即 一种发射波长为655 nm，另一种为800 nm，结果呈现出相似的特征性分布。

引言

最近引入了一种新方法，利用扫描透射电子显微镜（STEM）1-3 或结合荧光显微镜与STEM的关联成像技术4-7，在液态环境下对完整细胞中带有标记蛋白的样本进行成像。该方法能够在完整细胞的天然质膜中，在单分子水平上研究膜蛋白及蛋白复合物的空间分布及其化学计量关系。本文描述了一种两步特异性标记受体蛋白的实验方案，即使用荧光量子点（QDs）8进行标记，并结合相关联的光学显微镜与环境扫描电镜-扫描透射电子显微镜（ESEM-STEM）进行成像分析。以表皮生长因子受体（EGFR）为例，该膜蛋白属于蛋白激酶超家族。当配体结合后，受体被激活并与其他活化的EGFR形成二聚体，进而触发信号级联反应，驱动细胞增殖9。导致EGFR异常表达或活性的突变在多种癌症中起关键作用10。在完整细胞中研究该膜受体的空间排列，可提供有关其功能及可能功能改变的重要背景信息11-14。然而，利用生化方法或传统显微技术直接在（亚）细胞水平上探测EGFR单体、二聚体及聚集体的分布仍具挑战性15。我们的方法能够以数纳米的空间分辨率对EGFR进行可视化，从而确定蛋白复合物中各蛋白分子的位置。最重要的是，所获得的化学计量分布信息反映了蛋白质在完整细胞内天然状态下的真实情况。

为了实现标记物与受体之间的短距离，我们通过其配体EGF直接对EGF受体（EGFR）进行标记，利用生物素-链霉亲和素（biotin-streptavidin）连接至量子点（QD）。该标记物既可通过荧光显微镜也可通过电子显微镜检测。我们此前已将此标记方法用于微流控腔室中液相环境下的COS7细胞相关成像1,16,17。然而，由于每个量子点结合多个链霉亲和素分子，该标记方式可能诱导受体聚集，导致标记效率降低或实验成本较高，并且无法准确推断被研究蛋白的化学计量关系。通过采用本文所介绍的两步标记法，可完全避免标记诱导的受体聚集，从而获得仅有一个链霉亲和素-量子点（STR-QD）与生物素化EGF结合的探针。首先将细胞与生物素化EGF孵育，随后进行固定。固定步骤决定了蛋白质相关过程停止的时间点（取决于固定速度）。之后作为标记方案的第二步加入STR-QD。由于蛋白质在固定后其细胞膜上的动态运动受到抑制，因此不会发生聚集。此外，STR-QD溶液是实验中最昂贵的组分，采用该方法可将其以优化的低浓度使用；并且标记的第二步对时间要求不严格，i.e.，量子点可在数分钟内完成偶联。

为了研究表皮生长因子受体（EGFR）在完整细胞中的化学计量分布，将细胞样品制备在硅微芯片上18。经过两步量子点标记并记录荧光显微图像后，用纯水冲洗细胞，并在水合状态下使用环境扫描电镜-扫描透射模式（ESEM-STEM）进行成像19。所获得的关联成像结果提供了关于细胞内EGFR分布及其在水合细胞自然环境中的化学计量信息。近期一项研究采用类似方法分析了乳腺癌细胞中的HER2蛋白7。

方案

1. 标记与固定试剂的制备

  1. 使用经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制标记缓冲液（BSA-GEL-PBS）。加入1% BSA（牛血清白蛋白V型，无生物素）和0.2%明胶（GEL，来自冷水鱼皮），充分涡旋或振荡混合。
    注意：可在4 °C保存约5天。
  2. 使用经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制洗涤缓冲液（BSA-PBS）。加入1% BSA，充分涡旋或振荡混合。注意：可在4 °C保存约5天。
  3. 用200 mM硼酸储备液配制50 mM硼酸盐缓冲液（BB），用200 mM四硼酸钠将pH调至8.3。注意：可在4 °C保存约12个月。
  4. 用0.2 M二甲胂酸钠储备液配制0.1 M二甲胂酸缓冲液（CB），调节pH至7.4，并添加0.1 M蔗糖。
    注意：开启后的储备液可在4 °C保存约5天。
  5. 在PBS中配制0.1 M甘氨酸溶液（GLY–PBS）。
    注意：可在4 °C保存约2个月。
  6. 使用新配制或新开瓶的16% PFA（电子显微镜级）储备液，在CB中配制3%多聚甲醛溶液（3% PFA）。
    注意：开启后的储备液可在4 °C保存约5天。
  7. 使用新配制（或新开瓶）的25%戊二醛（GA，电子显微镜级）储备液，在CB中配制2%戊二醛溶液（2% GA）。
    注意：开启后的储备液可在4 °C保存约5天。
  8. 配制300 nM EGF-生物素标记溶液
    1. 将6 µM EGF-生物素储备液用BSA-GEL-PBS稀释，每微芯片使用100–200 µl。数小时内使用完毕。
  9. 配制10 nM STR-QD标记溶液
    1. 将链霉亲和素-QD储备液在8,000 × g下离心4分钟，取上清液并用BB缓冲液稀释10倍。可使用不同类型的量子点（QD），例如QD655或QD800。再用BSA-GEL-PBS稀释至终浓度，每微芯片使用75–100 µl。数小时内使用完毕。

2. 氮化硅薄膜芯片的制备

  1. 使用洁净室擦拭纸和高效液相色谱（HPLC）级乙醇清洁用于光学显微镜的载玻片。
  2. 在低尘环境的层流工作台中，打开一个直径为100 mm的培养皿，将清洁后的载玻片放入其中，并保持培养皿敞开。
  3. 使用洁净的镊子（优先选用碳纤维或其他涂层处理的镊子），依次从储存盒中夹取4–10个带有薄（50 nm）氮化硅膜的微芯片，并将其放置在载玻片上。夹取时应轻触微芯片的侧面，避免接触由薄氮化硅膜构成的脆弱上表面。务必始终保持膜面朝上，切勿触碰膜面。
    注意：微芯片应为矩形，且边缘平整并与覆盖氮化硅膜的表面垂直，以便于夹持。
  4. 盖上培养皿盖，将其转移至通风橱。取一张新的洁净室擦拭纸，放置在培养皿旁。准备两个洁净的200 ml玻璃烧杯，其中一个加入50–70 ml HPLC级丙酮，另一个加入相似体积的HPLC级乙醇。先将微芯片从载玻片转移至洁净室擦拭纸上。
  5. 从擦拭纸上将微芯片逐个转移至盛有丙酮的第一个烧杯中，以去除保护性抗蚀层。静置2分钟，期间轻轻晃动烧杯数次，确保微芯片充分清洗。
  6. 将微芯片直接转移至盛有乙醇的烧杯中，避免其干燥。静置2分钟，然后将烧杯转移回层流工作台。取一张新的洁净室擦拭纸。
  7. 将微芯片转移至擦拭纸上，静置数分钟使其干燥。随后将微芯片放回培养皿中的载玻片上，盖上培养皿，送至等离子清洗仪。
  8. 将带有微芯片的载玻片放入等离子清洗仪中，运行5分钟的清洗程序，使氮化硅膜表面变为亲水性。
    注意：本实验所用等离子清洗仪的推荐参数为：70 mTorr，O2气体流速11.5 sccm，Ar气体流速35.0 sccm，射频（RF）功率50 W，反射RF最大5 W。
  9. 将带有微芯片的载玻片放回培养皿中并盖好盖子。此后需注意保持微芯片无菌状态。
  10. 在光学显微镜下检查微芯片的窗口区域，观察是否存在膜破裂或残留颗粒物。
  11. 将培养皿转移至层流工作台。
  12. 在层流工作台中放置以下物品：含有灭菌的0.01%聚-L-赖氨酸溶液（PLL，分子量150,000–300,000，经无菌过滤并经细胞培养测试）、HPLC级水、添加10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、不含血清的DMEM、新的洁净室擦拭纸、无菌24孔板（也可使用12孔板）、无菌96孔板、无菌移液枪头、移液器以及平头圆角镊子。
  13. 取24孔板，在其中一个孔中加入PLL，两个孔中加入HPLC级水，每孔体积约为1 ml。取96孔板，为每个微芯片准备两个含血清DMEM的孔和一个无血清DMEM的孔，每孔体积约为200 µl。
  14. 此后操作微芯片时，均应使用无菌尖端的镊子。可通过短暂火焰灼烧后冷却镊子尖端来实现无菌处理。
  15. 首先将微芯片从载玻片转移至洁净室擦拭纸上。
    然后将最多六个微芯片从擦拭纸逐个转移至含PLL的孔中，孵育5分钟。
    注意：若实验涉及更多微芯片，可在24孔板中增加额外的PLL孔。
  16. 随后，将微芯片逐个依次放入第一个盛水孔中漂洗，再转移至第二个盛水孔中继续漂洗。每次在水中停留时间不得超过约1分钟，以防止PLL被洗脱。
  17. 最后将微芯片分别放入96孔板中含DMEM的孔中。将96孔板置于CO2培养箱中，直至细胞悬液制备完成。

3. 微芯片上细胞的制备

  1. 对COS7细胞进行传代培养，制备浓度约为5 × 10⁵个/mL的细胞悬液5 细胞/毫升。确保细胞为单分散状态。
  2. 将细胞悬液的一滴加入含微芯片的96孔板的每个微芯片中，静置5分钟。
  3. 使用倒置显微镜开始观察芯片的窗口区域，以选择合适的时机将其转移至含有无血清DMEM的新孔中。
    注意：每 2,500 µm² 约有一个细胞时，可达到理想的细胞密度2 区域，相当于在150 × 400 µm窗口面积内分布的24个COS7细胞。细胞密度过高可能阻碍细胞充分铺展。需注意，细胞沉降到SIN膜上后，需3–5分钟才能形成足够的黏附力，以防止在转移至新孔时发生脱落。
  4. 当有足够数量的细胞黏附在窗口上时，将微芯片转移至下一个孔中。始终保持微芯片的细胞面朝上，并避免触碰该侧面。
  5. 转移后，再次检查每个微芯片窗口。如果被冲洗掉的细胞过多，导致残留细胞数量不足，需重新吹打细胞悬液（以分散新形成的细胞团块），并重复步骤 3.1–3.5。
  6. 当所有转移的微芯片窗口区域均有足够贴壁细胞时，将芯片转移至含有无血清DMEM的最后一个孔中. 将96孔板重新放回CO₂培养箱2 培养箱中孵育数小时，最好过夜，使细胞恢复并充分贴壁铺展。

4. EGFR 标记、固定及荧光显微镜观察

  1. 以下步骤使用 96 孔板和 24 孔板。将各孔预先加入相应溶液，每枚微芯片使用一整行或一整列。24 孔板在通风橱内用于 CB、PFA 和 GA 的固定步骤。转移微芯片时始终确保细胞面朝上，避免触碰该表面。
  2. 将微芯片放入含有新鲜 BSA-GEL-PBS 的孔中进行清洗，随后将 96 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
  3. 在 37 °C 下用 300 nM EGF-生物素溶液孵育 3 分钟。由于细胞将开始内吞 EGF 标记的 EGFR，因此应尽快进入步骤 4.4。
  4. 用 PBS 清洗 3 次，再用 CB 清洗 1 次（此时 96 孔板已恢复至室温）。
  5. 在 3% PFA 中孵育 10 分钟。
  6. 用 CB 清洗芯片 1 次，再用 PBS 清洗 3 次。
  7. 在 GLY-PBS 中孵育 2 分钟，随后用 PBS 清洗 2 次（每次 1 次）。
  8. 在 10 nM STR-QD 溶液中孵育 10 分钟。
  9. 用 BSA-PBS 清洗 4 次。
  10. 将一枚微芯片浸入预先加入室温 BSA-PBS 的玻璃底 35 mm 培养皿中。
  11. 采集 QD 标记细胞的微分干涉差（DIC）图像和荧光图像。
    1. 使用 40X 干镜获取 QD655 标记细胞的概览图像。使用油镜（例如 63X）以最有效地收集发射荧光信号；在成像 QD800 标记细胞时尤其需要。
    2. 使用激发光波长范围为 340 至 380 nm、可收集波长高于 420 nm 发射光的滤光立方体，适用于大多数 QD（本实验中为滤光立方体 A）。
    3. 尽量降低光照强度，避免过强光线损伤样品。曝光时间至少设置为 300 毫秒，以确保捕获所有 QD 的信号，注意 QD 荧光具有闪烁特性。
    4. 调节光照强度和放大倍数，在最小化光照强度的同时获得明亮且无明显图像噪声的图像。
      注意：若对同一区域连续采集图像序列，可使用较短的曝光时间。这些图像序列可进行最大投影处理，从而实现信号平均并降低最终图像的噪声。
  12. 将已完成成像的微芯片（细胞面朝上）放回装有 BSA-PBS 的 96 孔板孔中。
  13. 用 CB 清洗微芯片 1 次。
  14. 在 2% GA 中孵育 10 分钟。
  15. 用 CB 清洗 1 次，再用 BSA-PBS 清洗 3 次。
  16. 将微芯片储存于新 96 孔板中预先加入 BSA-PBS 的孔内，以备后续 ESEM 成像使用。每枚微芯片对应的四孔中均加入 HPLC 级水。
    注意：样品可在 4 °C 下保存数周，但最佳结果是在两天内完成全部成像流程。量子点（QD）会缓慢从样品上脱落，因此建议在 ESEM 成像前不超过 10 天。
    注意：荧光图像应保存以供后续分析。可通过定位 SiN 窗口的角点并测量细胞相对于角点的位置，将荧光图像中的细胞位置与电镜图像精确对应。
    注意：建议打印高质量的荧光图像，并在采集 ESEM 图像时作为定位参考。

5. 全细胞的湿式环境扫描电镜-扫描透射电子显微成像

  1. 准备用于湿式STEM的环境扫描电子显微镜
    1. 安装气相二次电子探测器（GSED）以及带有STEM探测器的帕尔贴冷台（位于样品下方）。
    2. 开启载台冷却水的流动，并将温度设置为 3 °C。
    3. 将载物台的 x-y 坐标设为零，并将工作距离调整至约 6 mm。
  2. 在ESEM成像过程中，将带有微芯片的96孔板保持低温，例如置于泡沫塑料箱中的冷冻冷却元件上。
  3. 将96孔板从冷却容器中取出，放置在已预冷的ESEM-STEM样品台附近。在其旁边放置一张新的洁净室纸巾。
  4. 将微芯片（细胞面朝上）浸入装有HPLC级水的孔中，快速浸入并取出，重复四次，每次约一秒钟，进行快速冲洗。
  5. 用洁净的无尘纸短暂吸干芯片背面，然后将芯片放入预冷的载物台上。确保细胞保持湿润，可通过表面是否有反光来判断（干燥会导致表面无光泽）。
  6. 用3 µl冷却的HPLC级水润湿样品表面（确保移液枪头不接触表面），并将样品固定在载物台上。
  7. 在载物台上靠近样品的位置，再放置三个3 µl的水滴。
  8. 关闭样品室
  9. 在800至1,500 Pa之间循环压力五次，对样品室进行 purge。循环结束后保持压力为800 Pa。
  10. 打开电子束（30 kV），在最低放大倍数下使用两个探测器观察样品， 即， GSED以及STEM探测器来寻找芯片窗口的位置。
    注意：如果水层过厚，窗口可能不可见。此时，开始将压力降至760 Pa，并等待数分钟。窗口将首先在GSED下可见。
  11. 通过移动样品台将SiN膜窗口置于图像中央，并将压力降至750–720 Pa。
    注意：当水层足够薄时，也可用STEM探测器观察到窗口。
  12. 从现在开始，使用STEM探测器的暗场模式来记录图像。首先，获取一到两张显示整个窗口区域内所有细胞的图像。
  13. 将这些ESEM图像与光学显微镜图像进行比较，定位SiN窗口的角部。
  14. 通过比较两种显微成像模式的放大倍数、旋转角度及可能存在的镜像关系，对齐两者的坐标系。在两幅图像中定位相同的细胞。
  15. 选择含有极微小颗粒或具有细微结构的细胞区域，以调整成像参数，例如齐焦高度、精细聚焦以及透镜像散的校正。工作放大倍数应至少为50,000倍，使用约0.6 nA的电子束探针电流，像素驻留时间为30 µs，图像尺寸为1024 × 884像素。
    注意：只要避免增加电子剂量，也可采用其他设置。
    注意：即使操作非常洁净，芯片表面实际上总会含有一些微粒污染物，因为该实验流程并非在无尘室环境中进行。
  16. 为记录量子点标记细胞的STEM图像，请参考荧光图像并选择一个目标细胞。
    注意：最好从显示强量子点信号的细胞开始。
  17. 记录该细胞的STEM概览图像。
  18. 转至细胞边界可见的周边区域，放大至50,000倍。
  19. 记录显示单个量子点的图像，像素驻留时间设置为20–30 µsec。为避免辐射损伤，每个区域仅在高倍放大下成像一次。
    注意：通常在此阶段，需要对焦点和像散进行一些微调。
  20. 在记录了足够数量的高倍图像后，缩小倍数，获取另一张STEM概览图像，以显示刚刚用高倍镜记录的区域，这些区域在图像中呈深色矩形。
    注意：这些概览图像将用于关联环境扫描电镜（ESEM）图像与荧光图像，并确定高倍率图像在细胞环境中的精确位置。
  21. 前往下一个感兴趣的细胞，先采集一张概览图像，然后记录一系列高倍镜图像，最后再采集一张概览图像。
  22. 在环境扫描电镜（ESEM）成像结束后，开始对样品室排气前，应先将压力升至850–900 Pa。
    注意：增加压力有助于提高回收表面仍保持湿润的微芯片的几率；然而，这种情况并不总能实现。从未干燥过的样品可在 BSA-PBS 中恢复，并可根据需要在后续时间点再次用于 ESEM 检测。

结果

图1 和 2 展示在完整且充分水合的COS-7细胞中，由QD655标记的膜结合型EGFR的代表性图像。DIC图像见于 图1 a 显示了细胞膜表面形貌，对应的荧光图像在 图1b 显示EGF-Biotin孵育3分钟后EGFR的分布情况。 图1A 和 B 由40倍空气物镜拍摄的两张图像分别拼接而成。被EGF激活的EGFR分布在细胞整个表面。在大多数细胞中，荧光信号略有增强（图1B可在细胞边缘观察到，表明EGFR局部出现频率增加20对照实验采用类似方案进行，验证了EGFR标记的特异性（数据未显示）。这些对照包括：1）不预先用EGF-biotin孵育细胞的标记对照， 即， 仅与 STR-QDs 孵育，以及与非生物素化的 EGF 和 STR-QDs 孵育。

用矩形标记的三个细胞进一步通过环境扫描电子显微镜-扫描透射电子显微镜（ESEM-STEM）进行了研究。图1C-E 所示的 ESEM-STEM 图像展示了这些细胞的低倍概览。这些透射图像反映了处于水合状态的完整细胞，细胞表面覆盖有一层薄水膜，并置于带有氮化硅（SiN）观察窗的硅微芯片上。显微镜的真空腔室内含有水蒸气，通过调节样品温度与压力之间的平衡，以维持覆盖在细胞表面的一层液态水。由于细胞的形态及其在 SiN 膜窗上的位置，各个细胞可被清晰识别。低倍 ESEM-STEM 图像揭示了细胞边缘向邻近细胞延伸的细丝状伪足等精细结构，以及较薄细胞区域内部的一些结构。较厚的细胞中央区域（包括细胞核）呈现白色，这是因为所用能量（30 keV）的电子无法穿透这些区域。

在较薄的周边区域记录了高分辨率的环境扫描电子显微镜-扫描透射电子显微镜（ESEM-STEM）图像。先前的研究6已确定，在薄液层中细胞的薄区域，纳米颗粒的ESEM-STEM空间分辨率可达3 nm。所示的四幅高分辨率图像（图2A-D）是在图1C-E中标示的小矩形位置处采集的。所用的放大倍数足以分辨出单个量子点（QD），这些量子点呈明亮的子弹状棒形结构，每个均与单个表皮生长因子受体（EGFR）结合。QD655的典型尺寸为6 × 14 nm2。

图2A （对应于细胞上所示矩形区域） 图1C显示量子点标记位于一条对角线方向穿过图像的膜皱褶上。该膜结构的EGFR密度高于周围膜区域。在多个位置，两个标记彼此靠近，其中距离分别为20和24 nm的两组示例以箭头标示。这些成对的标记被解释为属于EGFR二聚体。 图2B 以细胞边缘为例（图1D左矩形区域中可见EGFR单体和二聚体。 图 2C (图1C，右矩形）记录了一个荧光信号较低区域的图像， 即， EGFR 密度较低。然而，此处也发现了 EGFR 以二聚体形式存在。此外，还存在两个由 10 或 11 个 EGFR 组成的簇（见椭圆标记）。 图 2D 显示了膜折叠的另一个示例（图1E）以及一些单体和二聚体，还包括包含5-6个EGFR的小簇。

作为可从该数据获得信息类型的一个示例，针对图2中所有标记位置确定了对相关函数21 g(x)。请注意，此分析不属于本实验方案的一部分，相关程序已在其他文献中描述6,7。g(x)用于衡量在参考粒子特定径向距离x处发现另一个粒子的概率。当g(x) = 1时，表示粒子呈随机分布；若g(x)大于1，则表明存在聚集现象。在图2A-D的四幅图像中，共自动检测到210个标记的位置，并采用5 nm的分箱尺寸和带宽为10 nm的平滑滤波器计算g(x)。g(x)曲线（图3）显示量子点（QD）中心到中心的优选距离为25 nm。因此，表皮生长因子受体（EGFR）并非随机取向，而是有相当一部分位于此优选距离上。根据一个近似的分子模型6（图3插图），我们估计量子点与EGF结合口袋之间的中心到中心距离约为14 nm，而连接在EGFR二聚体上的两个量子点之间的中心到中心距离约为27 nm（由于连接臂具有一定的柔性，该值可能在数纳米范围内有所变化）。因此，所观察到的标记优选距离与本方法精度范围内EGFR二聚体的预期标记距离一致。g(x)曲线在距离达300 nm范围内均大于1，表明存在聚集体，这与实验数据一致。该分析表明，本方法可用于研究EGFR的化学计量关系。

图4 显示的结果与图2相似，不同之处在于本实验使用EGF-QD800进行标记，并采用63倍油浸物镜采集荧光图像。该数据证实，当使用在近红外光谱区发射的量子点（QDs）对EGFR进行标记时，同样可观察到这些典型结果。图4A 为一个代表性细胞的荧光图像，图4B 为同一细胞在环境扫描电镜-扫描透射模式（ESEM-STEM）下的概览图像，图4C 是在细胞上膜边界处（见图4B中矩形区域）拍摄的150,000倍放大图像。与图2A和D类似，这些图像捕捉到了定位于膜折叠处的量子点标记EGFR，显示了单体、二聚体以及成簇的受体。需要注意的是，电子致密的量子点核心看起来略小且更圆，与发射波长为655 nm的量子点核心相比，这与其较小的核心尺寸22（约5 nm）一致。

Cell imaging, fluorescence microscopy, subcellular localization, red stain, high magnification analysis.
图1. 完全水合的COS-7细胞上EGF-QD655标记的EGFR的微分干涉相差成像、荧光成像及环境扫描电镜-扫描透射成像相关分析. (A细胞在氮化硅膜窗口区域生长的微分干涉差（DIC）图像，呈现出细胞质膜的拓扑形貌。B荧光图像显示位于中央氮化硅膜窗口（由虚线矩形标出）上的细胞。C-E) 从矩形标记的细胞区域获取的三张低倍ESEM-STEM图像 A 和 B这些细胞概览图像用于确定后续采集的高分辨率图像的精确位置。四个高分辨率图像的位置（如图所示） 图2A-D用白色矩形标记。 请点击此处以查看此图的放大版本。

纳米颗粒分析；电子显微镜图像；500 nm 比例尺；科学研究
图 2. 高分辨率 ESEM-STEM 图像显示膜结合型 EGFRs。（A）对应于图 1B中标记区域的 75,000X 放大倍数下的显微图像。可见多个单体，若干二聚体由箭头标示。（B）和（C）分别为图 1C中左侧和右侧膜区域在 50,000X 放大倍数下采集的图像，EGFRs 的簇状结构已标出。（D）为在图 1D标记位置以 50,000X 放大倍数记录的图像。请点击此处查看该图的高清版本。

分子距离的静态平衡图；示意图；纳米结构的光谱分析。
图3. 根据图2A-D中检测到的全部210个标记的粒子间距离所确定的径向距离x的对相关函数g(x)。 在25 nm处的峰表明，量子点中心到中心的距离出现的概率远高于随机分布，其中g(x) = 1表示随机概率。虚线为视觉引导线，代表随机分布的g(x)。插图显示了EGFR二聚体的近似分子模型，其中结合了EGF，并通过生物素连接了链霉亲和素包被的量子点。链霉亲和素、EGF和EGFR的模型来源于RCSB蛋白质数据库中的CPK模型（编号分别为1stp（链霉亲和素）、1EGF（EGF）、1NQL、2JWA、1M17、1IVO和2GS6（EGFR）），由Jmol版本12.2.15生成。生物素模型根据RCSB配体浏览器版本1.0绘制。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞结构的荧光显微镜图像；c）电子衍射图样分析。
图 4. 使用 EGF-QD800 标记并结合相关荧光与 ESEM-STEM 成像的典型 COS-7 细胞。 （A）荧光图像，（B）低倍率下的 ESEM-STEM 全貌图像。（C）在 b 图矩形区域位置以 150,000X 放大倍率记录的高分辨率图像。检测到单体、二聚体及成簇的 EGFR，与使用 EGF-QD655 标记的结果相似。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

研究完整细胞中膜蛋白（如EGFR）的空间分布和化学计量比，可为其功能及可能的功能变化提供重要的背景信息11-14。使用常规生化方法直接在亚细胞水平上研究单体、二聚体和簇状结构的分布具有挑战性，因为这些方法会丢失蛋白在细胞内的定位信息，或无法反映细胞间的差异15。本文所述的标记与显微技术能够在数纳米尺度上可视化蛋白复合物，从而在单个完整细胞的背景下研究其化学计量关系4-7。而（超分辨率）光学显微镜23无法实现这一目标，因其分辨率不足以区分参与蛋白复合物的分子。荧光共振能量转移（FRET）是一种基于群体平均的技术24，由于能量转移的作用距离较短，未必能检测到二聚体及更高阶的簇状结构25。邻近连接检测法26实际上并不测量距离，因此无法区分高蛋白密度的细胞区域（因随机接近而产生大量检测信号）与具有相似蛋白密度但存在蛋白复合物且标记物间具有特定间距的区域。要实现可视化蛋白复合物组分所需的高分辨率，需依赖透射电子显微镜（TEM）。然而，对完整细胞进行常规TEM观察受限于必须制备穿过质膜的薄样本/切片27，或导致质膜撕裂或脱落28,29，从而形成随机的小片膜结构。因此质膜无法被整体成像，导致可能至关重要的细胞背景信息缺失。

研究细胞内蛋白质化学计量比的其他实验挑战源于所采用的蛋白质标记方法。常用的免疫标记存在一个难点：只有使用单价探针时，受体与标记物之间才能实现一对一的化学计量比；而当需要使用一抗和二抗时，则无法达到这一要求。为了获得有关蛋白质化学计量比的信息，要求探针在一端唯一地结合受体上的一个表位，而在另一端具有一个荧光探针或高原子序数纳米颗粒的结合位点。其次，由于抗体尺寸较大30，其标记所能达到的精确定位被限制在30 nm范围内，因此无法区分相邻的单个蛋白质、同源二聚体或更大的聚集体，至少对于EGFR家族的受体而言是如此。文献中已报道有更小的特异性标记物，甚至可用于细胞内标记31，但这些标记物尚未被广泛应用。整个标记物（EGF-生物素-链霉亲和素-QD）的长度与EGFR分子尺寸相近，足够小，因而能够检测到二聚体。此外，所述的两步标记法可避免标记过程诱导受体发生聚集。

我们的方法并不十分困难，难度不比标记蛋白的荧光显微镜观察高太多。然而，实验必须极为谨慎地进行，因为步骤较多，其中任何一个步骤出错都可能导致整个实验失败。微芯片的操作并不比透射电镜载网更繁琐，但建议先用空白芯片进行一些训练。对完整水合细胞进行环境扫描电镜-扫描透射成像（ESEM-STEM）可能是其中最具挑战性的部分，需要至少一名技术熟练的操作人员并经过数天练习，才能达到约3 nm的分辨率，以实现对量子点（QDs）的可视化。待测样品在电子束照射下存在辐射损伤的风险。应密切监控压力和温度，以维持水层的存在。此外，不同细胞之间的水层厚度可能有所差异。建议如其他文献所述6，使用样品上方的气态电子探测器监测水层的存在。细胞区域应仅成像一至两次，以避免损伤。

该方法的一个主要局限性在于缺乏关于超微结构的高分辨率信息。要研究蛋白质结构和细胞超微结构，还需借助其他技术，例如冷冻透射电子显微镜15。其次，由于辐射损伤问题，利用延时显微镜在活细胞中研究多种蛋白质之间的动态相互作用目前不可行，该研究需要最先进的光学显微镜技术23。目前，我们的方法无法确定二聚体的绝对水平，因为标记效率未知，但我们预计未来将补充此类数据。尽管如此，仍可判断二聚体是否存在。文献已表明，即使标记效率仅为15%左右，也足以以足够的统计学显著性检测到二聚体32。

通过配体、特异性抗体的生物素化Fab片段或其他小分子连接物，并采用所述的两步标记方案，可轻松研究其他膜结合受体7。由于我们已证明可使用两种不同颜色（尺寸）的量子点（QDs），且先前的研究中已应用金纳米颗粒标记6，因此在同一实验中对多种蛋白质进行标记似乎是可行的。研究多种蛋白质化学计量关系的关键挑战在于确保不同蛋白种类的标记效率相近，或至少根据各自的标记效率对获得的相对化学计量比进行归一化处理。然而，本研究中使用的两种不同量子点在标记效率上似乎并无显著差异（见图2和图4）。该方法结合了量子点的两步标记、相关荧光显微镜以及环境扫描电镜-扫描透射成像（ESEM-STEM），为在完整细胞的完整质膜中研究膜蛋白之间的复杂相互作用提供了一种切实可行的技术路径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 E. Arzt 通过 INM 提供的支持，感谢 M. Koch 在环境扫描电子显微镜（ESEM）方面的帮助，以及 DENS Solutions 公司提供的微芯片。本研究部分得到了2013年莱布尼茨竞赛项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
倒置荧光显微镜LeicaAF6000 + DMI6000B
环境扫描电子显微镜（ESEM）FEI CompanyQuanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + 葡萄糖 + 丙酮酸钠Gibco31966-021
DPBS (1x) - 无氯化钙 - 无氯化镁Gibco14190-144
胎牛血清，性能增强型（FBS）Gibco16000-036
CellstripperMediatech, Inc.25-056 Cl
水，用于高效液相色谱的Chromasolv Plus级Sigma-Aldrich34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBSCarl Roth1058.1
乙醇，Rotisolv HPLC级Carl RothP076.2
白蛋白第五组分，无生物素（BSA）Carl RothO163.2
明胶，来源于冷水鱼皮Sigma-AldrichG7041-500G
甘氨酸Carl RothT873.1
表皮生长因子Molecular ProbesE3477生物素-XX偶联物（生物素化EGF）
四硼酸钠十水合物Sigma-AldrichS9640-500G
硼酸Sigma-AldrichB6768-500G
Qdot 655 链霉亲和素偶联物Molecular ProbesQ10121MP
Qdot 800 链霉亲和素偶联物Molecular ProbesQ10173MP
硅微芯片，带有厚度为50 nm、尺寸为50 µm x 0.40 mm的氮化硅膜DENS Solutions定制生产

参考文献

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