转化癌症研究依赖于人体组织的提取。大量工作已投入到优化组织提取方法中 离体 分析。在此，我们描述了可从有限样本中获得最大数据输出的组织处理方法。
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摘要
摘要
出于人类福祉的医学研究因需要人体组织和受试者而受到极大限制。然而，在获得人体样本的使用同意后，必须极其谨慎地处理这些珍贵的样本，以最大程度地保持器官、组织和细胞的完整性。遗憾的是，组织处理本身必然涉及将组织从宿主体内取出，这一变化可能引起显著的细胞应激，并对后续分析产生重大影响。这些应激可能导致样本不再能代表其原始取材部位的状态。因此，在处理这些样本时必须严格遵守既定方案，以确保其代表性。同时还必须考虑后续所需的检测类型，以确保采用最适宜的样本处理技术。本文概述了一种组织获取、处理及对处理后组织进行多种分析的方案，旨在从有限的组织样本中最大化地获得下游研究成果。
引言
医学研究极大地受益于对人类细胞系和动物模型的研究。细胞系能够更好地控制系统中的组分，并可使用来自合适生物体的细胞。尽管使用人类细胞更具代表性，但它仅能提供与健康和疾病相关的机制的极度简化的快照，因为细胞系可能无法重现其他细胞、间质成分以及可能影响反应的器官所带来的作用1。另一方面，动物模型虽然在模拟人类疾病和遗传异质性方面并非完全准确，但在大多数模型中能够整合整个动物系统的输入，从而提供更深入的见解2,3。
尽管存在不足，这两种方法各有优势，且互为补充。然而，主要目标仍然是在完整机体的多器官系统中研究人类细胞和器官。因此，转化医学研究在推动对从患者体内提取的人体器官和组织的研究方面已取得显著进展，以更深入地理解疾病背后的机制。转化医学研究的优势在于能够在整个机体及相应细胞中研究治疗效果和疾病影响，从而在细胞实验与动物实验之间实现最佳结合4。
转化医学研究也并非没有缺陷。从患者体内获取的标本一旦离开宿主，便会立即暴露于缺血及其他原本受到保护的外界因素中。这可能导致应激诱导的分子和遗传变化，从而在后续研究中引入偏差。因此，人们已投入大量努力，通过严格的方法提取和处理组织，以最大程度地保持器官和细胞的完整性，用于下游研究5。重要的是，在选择人源样本处理方法时，必须仔细考虑未来的应用方向，因为某些方法可能对特定的细胞组分和信号通路造成损害，而对其他组分则影响较小。
对于涉及人体组织的任何研究，都必须解决监管问题。继塔斯基吉报告和贝尔蒙特报告发布之后，人们逐渐认识到，生物医学研究具有内在风险，常常导致不可避免的伦理困境6。人们意识到需要制定国家标准，因此联邦政府设立了机构审查委员会（IRB），以维护《贝尔蒙特报告》所提出的原则（尊重个人、有利、公正）。
任何机构的IRB都是由医生、研究人员和社区成员组成的委员会，负责保护研究参与者。它要求从所有生物医学研究的参与者处获得自愿同意，并将此同意记录在知情同意书中。知情同意过程旨在向参与者提供充分的信息，以便其能够做出是否参加研究或继续参与的知情决定。因此，知情同意文件必须具有良好的可读性，且应使用易于理解的语言撰写（6th 至 8th 目标人群应能理解知情同意书的内容（阅读水平应适合相应年级）。必须尽量减少胁迫或不当影响的可能性，并给予受试者充足的时间考虑是否参与。受试者还应被允许在研究过程中的任何阶段随时行使撤回同意的权利，且不会因此受到处罚。自愿的知情同意是受试者参与研究的必要前提条件，同时也具有法律效力。7.
根据保护人类受试者的法规 21 CFR 50.25（http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html8），必须向研究参与者告知研究的目的、研究中涉及的程序、参与的替代方案、所有可预见的风险和不适（不仅包括身体伤害，还包括可能的心理、社会或经济方面的损害、不适或不便）、研究对社会以及可能对个体带来的益处、受试者预计参与研究的时间长度、在有疑问或发生与研究相关的伤害或紧急情况时可联系的人员、声明参与是自愿的，拒绝参与不会导致任何后果，也不会导致任何利益的丧失（例如，不会影响参与者因其诊断而本应享有的常规临床护理），最后还需说明受试者享有保密权，并有权在任何时候退出研究而不会产生任何后果。在研究过程中撤回同意的参与者所提供的组织样本不得保存，必须立即销毁。对于某些因实际情况无法在不修改必要要素的情况下开展的研究项目，或某些必要要素不适用的研究，可由机构审查委员会（IRB）批准豁免一项或多项知情同意要素。必须格外注意确保数据的保密性。《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）是一项联邦法律，禁止在未经参与者书面同意的情况下使用或披露“受保护的健康信息”（PHI）。PHI 包括但不限于以任何形式或媒介传输或保存的健康信息，以及可用于识别个人身份的各类信息字段9。
本研究旨在概述组织处理过程中必须遵循的方案——包括组织获取、储存，并强调遵守这些严格规范的重要性，以最大限度地减少组织在取出后因受到各种应激因素影响而可能产生的偏差。我们还力求简要介绍可对这些样本进行的下游检测或分析方法（图1），以便读者能够根据自身需求，合理判断并选择最合适的检测方法。
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方案
伦理声明：本方案已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心批准。
1. 标本获取
- 从多余的肿瘤组织及相关正常组织中采集科研用组织样本10-12。将标本置于湿冰上保存，以避免自溶。
- 将手术过程中移除的所有组织、医疗器械和异物送至病理科进行必要检查，以协助完成病理诊断。
- 按照适用的科研及组织库管理政策和程序处理用于研究的组织。
注：生物样本采集需要病理科医生、病理技师、组织技术员和组织获取专业人员之间的协调配合。
2. 病理学质量保证（QA）
- 作为早期质量保证措施，完善并核实患者记录，并咨询病理学家以审查诊断性患者记录（病理报告、组织切片等）和组织样本。根据感兴趣的形态学特征（如肿瘤百分比、坏死程度、组织-肿瘤交界区等）对组织样本进行评估。此步骤符合生物样本库最佳实践标准10-12。
- 在生物样本的整个保存期间，完成初步审查后，定期对生物样本库数据和研究样本进行复查。
- 将组织病理学及其他检测的结果和注释与相应样本关联，并通过专有的生物样本库软件系统向研究人员提供这些数据。
注意：质量保证流程可确保生物样本库在临床和技术操作方面的完整性。 - 开展遗传学和分子检测，以验证并表征样本的临床适用性。
- 收集并分析使用这些样本开展实验室实验的研究人员所提供的反馈数据。采用条形码技术追踪样本。该电子追踪系统亦被生物样本库最佳实践所推荐10-12。
3. 标本/组织处理
- 新鲜组织样本应始终保存在湿冰上，并尽快进行处理，以尽量减少因组织样本脱离其自然环境而引起的变化。正常组织与肿瘤组织样本应分开处理，以避免交叉污染。
注意：根据研究方案，生物样本处理可能涉及将样本收集到一种或多种类型的培养基中。 - 开始操作前，准备好无菌的培养皿、手术刀以及针头或镊子用于组织处理。确保已准备好试管并做好标记，按顺序摆放，以缩短样本处理时间（图2）。
- 所有相关组织信息，例如患者姓名、编号、治疗情况、手术日期及其他与研究相关的必要信息，应可在机构组织数据库中便捷获取。实验室中仅可保留有限的患者信息，且应以纸质或电子表格形式保存。
注意：仅收集与研究性质相关联的生物样本信息，例如基础生物医学研究、临床研究、转化研究等。对于疾病特异性信息，生物样本库工作人员应依据当前文献和监管机构的要求收集必要的数据，以确保正确诊断和有意义的研究。这包括但不限于肿瘤分级和癌症分期信息。 - 应提前规划所有拟进行的后续实验，以确定每种分析所需的组织切片大小及切除位置。理想情况下（尽管难以完全实现），所有分析应能代表整个组织切片，以反映组织异质性，并减少下游分析的偏差。按照 图2 所示，提前将所有所需物品摆放到位。
- 将组织样本平放在打开的培养皿中，紧贴表面。
注意：仅允许授权的生物样本库工作人员处理已识别样本并查阅已识别的健康数据。研究人员只能访问经签署的知情同意书允许且经机构审查委员会（IRB）规定许可的患者标识信息。所有样本必须充分标记，至少应包含唯一的组织识别编号和组织类型。标签中不得包含任何个人健康信息（PHI），以符合《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）规定。 - 从各个角度检查样本，以更好地了解其结构和尺寸。用针头将样本固定在培养皿底部，然后沿其最大且最具代表性的轴线进行对半切开。
- 切取一小块组织，放入含有1 ml RNA稳定液的无菌1.5 ml微量离心管中。该样本可在后续操作过程中置于冰上，并在需要前于4 °C保存。
注意：处理RNA时应始终佩戴手套，并使用无RNA酶的滤芯吸头，以降低RNA降解和污染的风险。 - 在培养皿盖内放置一个打开且预先标记好的活检盒。切取厚度不超过3至5 mm的组织切片，并转移至活检盒中。将活检盒置于10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定至少72小时。在石蜡包埋前，将活检盒转移至70%乙醇中长期保存。
注意：活检盒的标记应使用铅笔或推荐的专用记号笔，因为在后续处理过程中使用二甲苯会擦除普通标记。 - 切取一块组织放入组织模具中，用最佳切割温度（OCT）包埋剂覆盖组织切片，并立即在-20 °C下冷冻，用于冰冻切片。该组织切片可在-20 °C下保存，直至准备进行冰冻切片。
- 切取一块或多块组织，转移至含有MACS缓冲液（1×磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%胎牛血清（FBS）、2 mM乙二胺四乙酸（EDTA））的50 ml离心管中，用于后续流式细胞术分析。对于流式细胞术，较大的样本可能更合适，因为在肿瘤解离、细胞固定和必要时的透化过程中可能会损失细胞。通常，该部分可在处理完其他所有组织块后最后取材。剩余的代表性肿瘤样本可用于流式细胞术。可选地，该离心管可在4 °C过夜保存，或在消化成单细胞悬液后立即用于流式细胞染色（见第4步——流式细胞染色）。
- 将剩余组织切成不超过0.5 mm × 0.5 mm的最大尺寸的小块，转移至冻存管中，并立即在液氮中速冻。这些速冻样本可用于未来的分析及合作研究。
注意：操作液氮时需格外小心，直接接触可能导致严重损伤。应佩戴带侧护罩的安全眼镜或面罩以保护眼睛。同时应佩戴防冻手套，防止因飞溅或直接接触造成液氮冻伤。手套应合身，但也要足够宽松，以便在液氮溅入时能迅速脱下。
4. 流式细胞术染色
- 组织匀浆化
- 用DMEM（40 ml）、DNase I（50 U/ml）和Collagenase I（2 mg/ml）配制消化液。将新鲜或过夜保存的肿瘤组织置于培养皿盖内的MACS缓冲液中，并加入消化液浸没组织。
注意：存在不同的消化方法，每种方法均有其优势（即细胞表面蛋白表达、活力）。请确保您已选择适合预期下游应用的正确方法。 - 用针将肿瘤固定在培养皿底部，用手术刀从外向中心切割，直至肿瘤呈糊状。将肿瘤混合物转移至50 ml离心管中，密封后放入塑料袋以防止泄漏。将离心管置于培养箱中，37 °C、225 rpm旋转孵育1小时。
- 将肿瘤细胞悬液通过70 µm细胞筛过滤。在4 °C下以250 × g离心5分钟。用1 ml FACS缓冲液（500 ml PBS，1 ml 0.5 M EDTA母液，10 ml FCS或FBS）重悬细胞沉淀。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并重悬于浓度为1×10⁶个/mL的溶液中7 细胞/毫升。每孔转移100 µl（106 在96孔圆底板中进行染色。
- 用DMEM（40 ml）、DNase I（50 U/ml）和Collagenase I（2 mg/ml）配制消化液。将新鲜或过夜保存的肿瘤组织置于培养皿盖内的MACS缓冲液中，并加入消化液浸没组织。
- 存活率与抗体染色
- 每孔加入 200 µl 活性染色液并混匀。4 °C 避光孵育 30 分钟。在 250 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟，弃上清液。
- 加入推荐/已滴定浓度（按制造商说明）的抗体混合物，用于检测表面抗原，每200 µl FACS缓冲液中进行。4 °C避光孵育30分钟。以250 × g在4 °C离心5分钟，弃上清液。
- 用200 µl FACS缓冲液洗涤，250 x g、4 °C离心5 min，吸除上清液。将细胞重悬于200 µl FACS缓冲液中，进行流式细胞仪检测与分析。
注意：若进行细胞内流式细胞术染色，应在步骤4.2.2与4.2.3之间进行固定和透化处理及细胞内染色。若进行细胞因子染色，应按照推荐方法在染色前对细胞进行预激活，并在激活过程中使用如莫能菌素等抑制细胞内蛋白质转运与分泌的抑制剂，以确保可溶性因子的保留。固定后的细胞可在4 °C避光条件下短期保存（一周）后再上机进行流式细胞仪检测。
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结果
下图展示了对经处理的黑色素瘤肿瘤组织进行广谱免疫表型分析的流式细胞术设门策略。染色当天，组织样本在37 °C、225 RPM振荡条件下，经胶原酶I和DNase I孵育消化60分钟。消化完成后，细胞悬液经70 µm细胞滤网过滤以去除碎片，随后使用荧光标记的流式细胞术抗体对细胞进行染色，以实现免疫细胞表型分析。下文（图3）展示了在MACS缓冲液中于4 °C保存过夜（O/N）的组织样本的设门策略及多种标志物的染色结果。如图所示，按照上述方法处理并置于MACS缓冲液中4 °C过夜保存的样本，细胞死亡率极低。此外，该图表明，采用上述方法处理组织可实现对黑色素瘤肿瘤中免疫细胞亚群的多色广谱表型分析。
图1. 可从人血液和组织样本中开展的分析。
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讨论
最终，样本处理方法的选择应由预期的研究假设以及计划进行的技术检测来决定（图1）。以下部分将简要概述可在此类组织切片上实施的潜在检测方法。该概述并非详尽无遗，而是旨在通过描述各项技术并列出其优缺点，帮助指导样本处理方法及后续检测方案的选择。
流式细胞术染色可对新鲜解剖的组织切片或在4 °C条件下于MACS缓冲液中保存过夜的组织碎片进行。流式细胞术能够对从组织样本中提取的细胞群体进行高特异性的表型分析，可在单个细胞中同时检测多达17种细胞表面标志物以及细胞内蛋白、细胞因子和蛋白酶。此外，某些流式细胞仪具备单细胞放大功能，可用于确定蛋白在细胞内的定位，而不仅限于信号的阳性和强度分析。最后，质谱流式细胞术（mass cytometry）可在同一样本中定量检测超过35种蛋白，但其缺点是细胞必须裂解，因此无法进行后续培养、分选或整体分析14。该技术可实现多种标志物和蛋白的分析，并在单细胞水平上进行详细表征。然而，流式细胞术需要对组织进行均质化处理，导致组织结构的丧失，且必须使用新鲜组织以尽量减少细胞表型的变化。重要的是，用于流式细胞术的组...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了约翰·G·和玛丽·斯特拉·肯尼迪纪念基金会（资助号 #0727033）和黑色素瘤研究联盟的慈善捐助支持。作者谨此感谢德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构组织库（ITB）在组织样本的协调分配与收集以及促进转化研究方面所做的贡献，同时感谢伊格纳西奥·威斯塔巴博士、维克多·普列托博士、MD安德森癌症中心病理科以及黑色素瘤登月计划项目。最后，作者谨向所有受黑色素瘤影响的患者及其家属表示诚挚的感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 针头 | BD | 305167 | |
| 不锈钢一次性手术刀 | Miltex | 4-410 | |
| 组织培养皿 | Corning | 353003 | |
| 活检盒 | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA稳定溶液 | Ambion | AM7021 | |
| 1.5 ml 离心管 | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430290 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | StatLab 医疗产品公司 | 28600-5 | |
| 福尔马林容器 | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| 最佳切割温度包埋剂（OCT） | Sakura Finetek | 4583 | |
| 组织-Tek 冷冻模具 | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| 胶原酶 I | Roche | 11088793001 | |
| 70μm 细胞滤筛 | BD Bioscience | 352350 | |
| 96孔圆底板 | Corning | 3799 | |
| 活/死细胞染色液 | Life Technologies | L34957 |
参考文献
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