本视频旨在演示如何进行 从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中自动化提取DNA及数字滴定PCR (ddPCR) 分析用于在临床环境中检测稀有突变。在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中检测突变，证明了 ddPCR 在 FFPE 样本中的临床应用价值。
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摘要
摘要
数字滴定PCR（ddPCR）是一种高灵敏度的PCR方法，利用水-油乳液系统进行检测。通过使用液滴生成器，将提取的核酸样本分割成约20,000个纳米级的水包油液滴，PCR扩增在各个独立液滴中进行。ddPCR方法可用于检测序列突变、拷贝数变异以及涉及靶向基因的特定结构重排。本文展示了ddPCR作为一种强大技术，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中精确定量罕见的BRAF V600E突变的应用，这对于识别癌症患者具有重要意义。总之，ddPCR技术有望在多种类型的FFPE样本中精确分析不同基因的特定罕见突变。
引言
关键调控基因中遗传突变的积累会改变细胞正常的程序，如细胞增殖、分化和存活，从而导致癌症1。RAS-RAF-MAP激酶通路介导细胞对生长信号的响应。致癌性BRAF突变可能源于 BRAF 基因的驱动突变，这可能导致BRAF癌蛋白过度活化2。 BRAF 基因的突变还会导致通过MEK和ERK的下游信号通路过度活化3，进而引起细胞生长和增殖失控，不再依赖于生长 因子介导的调控4-6。
目前已有多种工具可用于DNA突变谱分析，例如通过微滴式数字PCR（ddPCR）对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的参考标准细胞系中的 BRAF V600E突变进行定量分析。ddPCR是一种基于PCR的绝对定量方法，相较于传统的定量实时PCR（qPCR）具有更高的准确性7,8。ddPCR在检测DNA模板中稀有突变方面也具备更强的分辨能力和准确性，有助于开展更具信息量的癌症研究与诊断9。与传统qPCR相比，ddPCR的其他优势还包括在分析低拷贝数模板时具有更高的灵敏度和精确度10-12。本文展示了一种从FFPE参考标准细胞系中自动提取DNA，并通过ddPCR检测BRAF V600E突变是否存在的一整套实验方案。同时描述了数据分析软件的使用方法以及结果的图形化呈现方式。整个操作流程相对简便，具体耗时主要取决于待分析样本的数量以及可用的传统PCR仪和ddPCR仪的数量。
以下方案描述了使用组织制备系统（Tissue Preparation System, TPS）在全自动仪器上对BRAF V600E阳性福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系（HD598、HD593、HD617、HD273及野生型（WT））进行处理的标准操作流程。随后，采用数字液滴PCR（ddPCR）系统对提取的DNA样本进行BRAF V600E突变检测。在所有样本完成检测并将数据导入数据分析软件后，进行靶向突变分析。根据所研究样本/组别的数量，数据分析可能需要一至数小时。该方法的实验部分要求在将 DNA 和 移液操作精确地加入96孔板的过程中保持操作准确性，而数据分析则通过软件完成。
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方案
1. 从FFPE参考标准细胞系中提取DNA
注意：本实验中，使用FFPE组织DNA提取试剂盒，按照下述方案从FFPE参考标准细胞系（HD598、HD593、HD617、HD273及野生型（WT））中提取DNA。通过遵循生产商提供的总DNA提取说明，实现了DNA的自动化提取。
- 根据既定操作流程，使用切片机和原始的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，在进行DNA提取与分析前手工制备新鲜切片。确保所分析的组织切片样本总厚度不超过10 µm，单张切片的表面积不超过600 mm2。
1.2 TPS 实验方案
注意：表1中所示体积为处理48个样本所需的最小体积，所示操作步骤遵循TPS指南。实验开始前，通过离心将FFPE样本在e管中沉淀。 在自动程序中以600 × g离心，以避免样品损失。
- 打开自动DNA提取仪和计算机。启动运行控制软件，并将自动加载托盘插入TPS甲板加载区域。
- 按照 图 1 所示，将试剂分别加入对应的试剂槽中。
- 将4个样本（BRAF WT、BRAF V600E 50%、5% 和 1%）放入样本载体架中。
- 将吸头盒放入第2列和第3列的试剂槽中，并检查每个吸头内是否含有一个以上的滤芯，否则将导致运行中止。
- 通过倒置3–5次确保裂解缓冲液和洗涤缓冲液充分混匀，并将其加入第4列对应的试剂槽中（图 1）。
- 倒置数次或轻微涡旋混匀后，将洗脱缓冲液、磁珠和FFPE缓冲液加入第5列的小试剂槽中，按指示留出一个空位（图 1，表 1）。
- 将一个2 ml 深孔板（DWP）放置于板载体上（图 1）。
- 开始运行前执行以下最后步骤：
- 打开所有试管和试剂槽的盖子。确认液体废液瓶有足够的容量。确认固体废液瓶为空且内衬有生物危害袋。确认吸头弹出板位于废液组件中央。
- 关闭前盖。
- 启动软件，打开NA_Prep_Main_MLSTARlet.med文件。
- 点击“开始”。仪器状态将从空闲切换为运行中。
- 输入本次运行的样本数量。选择本次运行所需的方法（DNA = 0）。输入首个高容量吸头的位置，若所有托盘均装满则选择“1”。输入首个标准容量吸头的位置，若所有托盘均装满则选择“1”。
注意：随后仪器将自动执行各步骤，无需用户干预。详细工作流程见 图 2。实验完成后，试剂废液和吸头将被注入废液组件中。 - 采用荧光定量法对纯化的基因组DNA进行定量。
注意：浓度不低于3.3 ng/µl 的DNA样本将用于ddPCR分析（第2节）。
2. DNA突变谱分析：数字PCR方案
注意：DNA突变谱分析的实验方案包括3个主要步骤：1）液滴生成，2）常规PCR扩增，3）液滴读取，以及4）DNA突变谱分析。
2.1. 液滴生成
注意：建议使用 ddPCR 超混合液进行 ddPCR，因为该混合液含有生成液滴所需的试剂。
- 为避免污染，请遵循标准预防措施，例如佩戴手套、使用洁净的PCR操作台、洁净的移液器以及低蛋白结合力的离心管。
- 确保人基因组DNA样本的最低浓度为3.3 ng/µl。注意：纯化后DNA样本的浓度将根据突变频率检测百分比的分析结果而有所不同。
- 在96孔PCR板中配制反应体系。将反应组分解冻并平衡至室温（RT）。通过将2X ddPCR超级混合液（10 µl）、20倍引物（正向和反向，900 nM）和探针（250 nM）与每份纯化的DNA样本（66 ng/2 µl）混合，并用蒸馏水补足至20 µl （按照液滴生成仪操作说明书进行）。
- 充分涡旋混匀以确保均一性，并短暂离心使液体沉降至管底后再进行分装。将20 µl 反应液加入到微滴生成卡盒中用于生成液滴。
- 按照制造商推荐的操作流程运行液滴生成仪：
- 将卡盒插入支架中，确保卡盒的缺口位于支架的左上方。向中间孔加入含有样本的20 µl 反应混合液，向底部孔加入70 µl 生成油。
- 将密封垫圈覆盖在卡盒顶部，并确保垫圈两端牢固地固定在支架上；否则将无法产生足够的压力以完成液滴生成。
- 按下仪器顶部的绿色按钮打开液滴生成仪，插入卡盒。当支架处于正确位置时，电源指示灯（右前方）和支架指示灯（中间右方）均显示为绿色。
- 再次按下仪器顶部按钮关闭舱门，启动液滴生成过程。注意：按下按钮后，歧管会自动定位至出口孔上方，将油和样本通过微流控通道吸入，在此过程中形成液滴。液滴流入液滴收集孔并逐渐积聚。液滴指示灯（右侧）在10秒后开始闪烁绿色，表示液滴生成正在进行中。
- 当液滴生成完成后，三个指示灯均变为稳定的绿色；按下按钮打开舱门，从仪器中取出支架。取下支架上的一次性密封垫圈并丢弃。注意：卡盒的上部孔中含有生成的液滴，中部和下部孔几乎为空，仅残留少量油。
2.2. PCR 准备
- 每个样本中移取 40 µl 将液滴内容物从上样孔转移至推荐的96孔PCR板中的单个孔，具体操作参见仪器制造商的使用说明。注意：建议使用多通道移液器转移乳化液滴。为尽量减少转移过程中液滴的剪切，建议缓慢轻柔地吸取液滴。
- 将液滴转移至PCR板后，立即用铝箔密封，以防蒸发。使用可穿刺的铝箔板封膜，确保其与PCR板封膜仪及液滴读取仪的针头兼容。按照PCR板封膜仪使用说明书中的操作步骤进行封膜。
- 将封板仪的温度设置为 180 °C，时间设置为 5 秒。
- 触摸箭头以打开托盘门。将支撑块放置在托盘上，使96孔面朝上。将96孔板置于支撑游戏副本上，并确保所有孔板孔位与支撑块对齐。
- 用一张可穿刺的箔膜密封96孔板。将96孔板固定在支撑块上并覆盖可穿刺箔膜密封后，按下密封按钮，托盘将自动闭合并开始热封。
- 热封完成后，门会自动打开；从加热模块中取出反应板进行热循环，然后移除加热模块。
- 确保用封板膜完全密封板上的所有孔，检查每个孔上方的膜是否有明显凹陷。密封完成后，即可进行热循环。
- 液滴去除后，按压卡盒架上的卡扣以打开卡盒架。取出空卡盒并丢弃。
- 按照文中详述的参数进行常规PCR扩增 表2.
2.3 液滴读取（按照制造商推荐的方案）
注意：在液滴中对核酸靶标进行PCR扩增后，液滴读取仪使用双色检测系统对每个液滴进行单独分析13。我们通常设定检测FAM和VIC报告荧光染料。
- 点击“冲洗系统”以启动液滴读取仪，并使其准备好进行数字PCR分析。
- 将反应板装入液滴读取仪，然后点击“开始”。液滴读取仪会依次吸取每个样本，将液滴单个化，并使其单列通过一个双色检测器。检测器读取液滴信号，以统计阳性与阴性样本的数量。
- 当液滴读取完成后，打开门并从仪器中取出板架。从板架中取出96孔PCR板并丢弃。
- 为确保正确维护，根据需要更换液滴读取仪用油并清空废液容器。向废液瓶中加入50 ml 的10%次氯酸钠溶液，以防止微生物生长。
2.4 DNA突变谱分析（按照生产商推荐的实验方案）
注意：使用数据分析软件对PCR阳性与PCR阴性液滴进行计数，以数字形式对目标 BRAF V600E DNA突变进行绝对定量。
- 单击“设置”以输入有关样本、检测和实验的信息。
- 在“设置”窗口中加载一个酶标板文件（filename.qlp），然后单击“分析”以打开并分析数据。数据分析界面分为三个窗口：结果表、孔位选择器和处理后数据/图形显示。
- 在“处理后数据”窗口中，每个靶标的浓度数据会显示在酶标板图的相应孔位中，并在“结果表”中进行列表。单击“浓度”可查看浓度图中的数据可视化结果。
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结果
在我们的数字滴定PCR（ddPCR）分析中，研究了BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系。液滴读取仪连接至运行数据分析软件的笔记本电脑。每个液滴根据其荧光强度被判定为阳性或阴性。制造商提供的软件还允许用户自定义阈值，以确定阳性与阴性液滴之间的界限。通过样本中阳性与阴性液滴的数量，可计算出目标分子的浓度，单位为拷贝数/µl。
通过检测荧光信号并将其处理为二维散点图显示，使用定制软件为每个液滴终点簇绘制适当的门控区域，并统计各门控区域内液滴的数量。如图3A所示，所有样本中位于截断线（粉红色线）以上的蓝色点所代表的液滴（FAM荧光信号）为BRAF V600E突变阳性。在BRAF野生型（NTC；第2泳道）样本中出现的蓝色点可能源于非特异性信号（假阳性）。假阳性信号（BRAF WT）已与其他突变样本进行归一化处理。如图3B所示，野生型BRAF液滴由绿色点表示（VIC荧光信号）。在两个图中，底部的灰色点被...
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讨论
本文重点介绍了利用数字微滴式PCR（ddPCR）技术及从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系样本中提取DNA，用于特定基因突变检测的适用性。本研究采用TPS自动化DNA提取方法，该方法易于适应、自动化操作，并可同时处理多达48个不同样本，适用于大规模实验且可降低变异程度。本工作中DNA提取的一个局限性在于，每个FFPE样本均具有独特性，在表面污染物、微生物群落和/或人类遗传背景方面彼此存在差异。总体而言，提取所得DNA的质量与产量，以及全基因组DNA扩增的成功率，依赖于提取前、提取过程中及提取后多个参数的影响。这些参数包括组织类型和数量、用于组织保存的固定剂类型、固定时间、石蜡包埋块的保存年限及储存条件，以及待分析DNA片段的长度16。从组织中去除石蜡是成功提取DNA最关键的步骤，未完全溶解的石蜡会导致样本质量下降。在微滴生成过程中，必须注意避免气泡形成——这是成功检测突变的另一个关键步骤。考虑到不同样本群体之间可能存在的样本间差异，以及实验目的的不同，可能需要对实验流程进行某些调整，以获得理想的实验结果。
另一个优势是，本方案中采用自动化系统进行D...
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披露
Myung Ryuri Oh、Si Eun Kim 和 Young Deug Kim 是 ABION CRO 的员工。
致谢
本研究由R资助&D 计划 韩国科学与信息通信技术部资助的国家研究基金会（NRF） & 未来规划（资助编号：2013M3C8A1075908）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD 仪器 | Siemens | 10701001 | 自动化 DNA 提取仪器 |
| QX200 微滴生成仪 | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 微滴读取仪 | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| 具备升降温速率调节功能的传统 PCR 仪 | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR 板封膜仪 | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft 软件 | Bio-Rad | ||
| DNA 提取试剂盒 | |||
| VERSANT 组织处理试剂盒 1 号 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT 组织处理试剂盒 1 号 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE 吸头 | Siemens | ||
| ddPCR 突变分析 | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X 浓度 |
| DG8 微滴生成卡盒 | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| 微滴生成用油 | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| 密封垫圈 | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| 微滴读取用油 | Bio-Rad | BR-186-3004 |
参考文献
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