采用数字滴定PCR检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的BRAF V600E突变

摘要

本视频旨在演示如何进行 从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中自动化提取DNA及数字滴定PCR (ddPCR) 分析用于在临床环境中检测稀有突变。在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中检测突变，证明了 ddPCR 在 FFPE 样本中的临床应用价值。

摘要

数字滴定PCR（ddPCR）是一种高灵敏度的PCR方法，利用水-油乳液系统进行检测。通过使用液滴生成器，将提取的核酸样本分割成约20,000个纳米级的水包油液滴，PCR扩增在各个独立液滴中进行。ddPCR方法可用于检测序列突变、拷贝数变异以及涉及靶向基因的特定结构重排。本文展示了ddPCR作为一种强大技术，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中精确定量罕见的BRAF V600E突变的应用，这对于识别癌症患者具有重要意义。总之，ddPCR技术有望在多种类型的FFPE样本中精确分析不同基因的特定罕见突变。

引言

关键调控基因中遗传突变的积累会改变细胞正常的程序，如细胞增殖、分化和存活，从而导致癌症¹。RAS-RAF-MAP激酶通路介导细胞对生长信号的响应。致癌性BRAF突变可能源于 BRAF 基因的驱动突变，这可能导致BRAF癌蛋白过度活化²。  BRAF 基因的突变还会导致通过MEK和ERK的下游信号通路过度活化³，进而引起细胞生长和增殖失控，不再依赖于生长 因子介导的调控^4-6。

目前已有多种工具可用于DNA突变谱分析，例如通过微滴式数字PCR（ddPCR）对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的参考标准细胞系中的 BRAF V600E突变进行定量分析。ddPCR是一种基于PCR的绝对定量方法，相较于传统的定量实时PCR（qPCR）具有更高的准确性^7,8。ddPCR在检测DNA模板中稀有突变方面也具备更强的分辨能力和准确性，有助于开展更具信息量的癌症研究与诊断⁹。与传统qPCR相比，ddPCR的其他优势还包括在分析低拷贝数模板时具有更高的灵敏度和精确度^10-12。本文展示了一种从FFPE参考标准细胞系中自动提取DNA，并通过ddPCR检测BRAF V600E突变是否存在的一整套实验方案。同时....

方案

1. 从FFPE参考标准细胞系中提取DNA

注意：本实验中，使用FFPE组织DNA提取试剂盒，按照下述方案从FFPE参考标准细胞系（HD598、HD593、HD617、HD273及野生型（WT））中提取DNA。通过遵循生产商提供的总DNA提取说明，实现了DNA的自动化提取。

1. 根据既定操作流程，使用切片机和原始的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，在进行DNA提取与分析前手工制备新鲜切片。确保所分析的组织切片样本总厚度不超过10 µm，单张切片的表面积不超过600 mm²。

1.2 TPS 实验方案

注意：表1中所示体积为处理48个样本所需的最小体积，所示操作步骤遵循TPS指南。实验开始前，通过离心将FFPE样本在e管中沉淀。 在自动程序中以600 × g离心，以避免样品损失。

1. 打开自动DNA提取仪和计算机。启动运行控制软件，并将自动加载托盘插入TPS甲板加载区域。
2. 按照 图 1 所示，将试剂分别加入对应的试剂槽中。
   1. 将4个样本（BRAF WT、BRAF V600E 50%、5% 和 1%）放入样本载体架中。
   2. 将吸头盒放入第....

结果

在我们的数字滴定PCR（ddPCR）分析中，研究了BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系。液滴读取仪连接至运行数据分析软件的笔记本电脑。每个液滴根据其荧光强度被判定为阳性或阴性。制造商提供的软件还允许用户自定义阈值，以确定阳性与阴性液滴之间的界限。通过样本中阳性与阴性液滴的数量，可计算出目标分子的浓度，单位为拷贝数/µl。

通过检测荧光信号并将其处理为二维散点图显示，使用定制软件为每个液滴终点簇绘制适当的门控区域，并统计各门控区域内液滴的数量。如图3A所示，所有样本中位于截断线（粉红色线）以上的蓝色点所代表的液滴（FAM荧光信号）为BRAF V600E突变阳性。在BRAF野生型（NTC；第2泳道）样本中出现的蓝色点可能源于非特异性信号（假阳性）。假阳性信号（BRAF WT）已与其他突变样本进行归一化处理。如图3B所示，野生型BRAF液滴由绿色点表示（VIC荧光信号）。在两个图中，底部的灰色点被.......

讨论

本文重点介绍了利用数字微滴式PCR（ddPCR）技术及从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系样本中提取DNA，用于特定基因突变检测的适用性。本研究采用TPS自动化DNA提取方法，该方法易于适应、自动化操作，并可同时处理多达48个不同样本，适用于大规模实验且可降低变异程度。本工作中DNA提取的一个局限性在于，每个FFPE样本均具有独特性，在表面污染物、微生物群落和/或人类遗传背景方面彼此存在差异。总体而言，提取所得DNA的质量与产量，以及全基因组DNA扩增的成功率，依赖于提取前、提取过程中及提取后多个参数的影响。这些参数包括组织类型和数量、用于组织保存的固定剂类型、固定时间、石蜡包埋块的保存年限及储存条件，以及待分析DNA片段的长度¹⁶。从组织中去除石蜡是成功提取DNA最关键的步骤，未完全溶解的石蜡会导致样本质量下降。在微滴生成过程中，必须注意避免气泡形成——这是成功检测突变的另一个关键步骤。考虑到不同样本群体之间可能存在的样本间差异，以及实验目的的不同，可能需要对实验流程进行某些调整，以获得理想的实验结果。

另一个优势是，本方案中采用自动化系统进行D.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hamilton MICROLAB STARlet IVD 仪器	Siemens	10701001	自动化 DNA 提取仪器
QX200 微滴生成仪	Bio-Rad	772BR1119
QX200 微滴读取仪	Bio-Rad	771BR1497
具备升降温速率调节功能的传统 PCR 仪		621BR17718
PX1 PCR 板封膜仪	Bio-Rad	770BR1575
QuantaSoft 软件	Bio-Rad
DNA 提取试剂盒
VERSANT 组织处理试剂盒 1 号	Siemens	10632398
VERSANT 组织处理试剂盒 1 号	Siemens	10632399
CO-RE 吸头	Siemens
ddPCR 突变分析
ddPCR Supermix	Bio-Rad	BR186-3010	2X 浓度
DG8 微滴生成卡盒	Bio-Rad	BR186-4008
微滴生成用油	Bio-Rad	BR-186-3005
密封垫圈	Bio-Rad	BR186-3006
微滴读取用油	Bio-Rad	BR-186-3004