利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

摘要

早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内 短暂性全身缺氧-缺血及羊膜内脂多糖（LPS）给药模拟绒毛膜羊膜炎，以及感染性刺激与胎盘灌注不足对中枢神经系统发育的相关影响。

摘要

早产儿脑病（EoP）是一个涵盖与早产相关的中枢神经系统（CNS）异常的术语. 为了更好地推进转化研究目标，并揭示与早产相关的脑损伤的新型治疗策略，早产（EoP）的临床前模型必须包含在人类中观察到的产前全身性损伤的相似机制，并涉及母体-胎盘-胎儿系统的多个组成部分。理想情况下，模型应在成年动物中产生类似范围的功能缺陷，并重现多种病理生理特征。为模拟人类系统性胎盘灌注障碍、胎盘低灌注以及与早产早期病原体诱导炎症相关的绒毛膜羊膜炎，我们建立了一种产前短暂性全身缺氧缺血（TSHI）联合羊膜腔内注射脂多糖（LPS）的动物模型。在妊娠Sprague Dawley大鼠中，于胚胎第18天（E18）通过子宫动脉阻断诱导TSHI，可导致胎盘低灌注程度与胎儿中枢神经系统（CNS）损伤严重程度呈梯度相关。当联合羊膜腔内注射LPS时，胎盘炎症加剧，CNS损伤加重，并伴随白质异常、步态障碍及影像学异常。产前TSHI及TSHI+LPS损伤模型满足EoP模型的多项标准，包括重现宫内损伤、导致神经元、少突胶质细胞和轴突丢失、亚板层丧失，以及在成年动物中出现与极早产儿相似的功能缺陷。此外，该模型可用于解析不同类型损伤所诱导的炎症反应机制。 产前短暂性全身缺氧缺血，羊膜腔内脂多糖注射，早产，胎盘低灌注，绒毛膜羊膜炎，中枢神经系统损伤，白质损伤，功能缺陷，动物模型

引言

据估计，美国有超过12%的婴儿在妊娠37周前出生¹，早产所致的围产期脑损伤（PBI）是导致永久性残疾的重要原因。早产所致的PBI，也称为早产儿脑病（EoP），会影响整个中枢神经系统（CNS）。CNS损伤常始于in utero，并因绒毛膜羊膜炎等产前过程以及缺氧和败血症等产后并发症而加重。由全身性损害引起的PBI会改变神经发育，导致脑性瘫痪、癫痫、认知发育迟缓以及多种影响情绪调节、记忆和执行功能的神经精神障碍^1,2。尽管已有大量研究进展，但对于早产引起的CNS损伤在细胞和分子层面的后果如何转化为早产儿多种神经系统后遗症，目前仍了解有限。这一知识空白阻碍了对CNS损伤严重程度的实时诊断以及新兴干预措施的合理剂量制定。此外，针对这一脆弱患者群体的适龄治疗策略仍不明确。

宫内炎症在极早产中非常常见，涉及复杂的胎儿-母体-胎盘炎症级联反应³。宫内感染常为亚临床表现。胎盘中特定的急性炎症病理表现，即组织学绒毛膜羊膜炎，是胎儿炎症反应的主要决定因素，并与早产相关的脑损伤同时发生^3-5。事实上，胎儿炎症反应对早产儿的远期预后具有明确的临床意义。出生时小于胎龄（SGA）或曾发生感染的婴儿，尤其容易出现神经功能缺陷^3,4。绒毛膜羊膜炎是早产后的常见病理诊断^6,7，组织学检查显示，约70%极早产儿的胎盘存在炎症征象⁴。此外，绒毛....

方案

波士顿儿童医院和新墨西哥大学健康科学中心的机构动物照护与使用委员会已批准所有实验程序。

注意：在开始操作前，需将所有外科器械和外科敷料进行密封、灭菌并高压灭菌。此外，准备术后用药的无菌小瓶，包括0.125%布比卡因和0.1 mg/kg丁丙诺啡。同时无菌配制脂多糖（LPS）溶液：将0.04 mg/ml LPS（0111:B4）溶于含稀释伊文思蓝染料的无菌生理盐水中。

1. 麻醉

1. 使用由3%异氟烷、70%氮气和30%氧气组成的混合气体，对妊娠18天（E18）的Sprague Dawley大鼠进行麻醉诱导。
2. 将大鼠从诱导室中取出，仰卧置于设定为37 °C的无菌手术循环水毯上。通过鼻罩给予麻醉气体，并将异氟烷浓度降至2%。
3. 轻轻在每只眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。在手术过程中持续监测动物的体温、呼吸频率和心率。母体生理状态应在整个操作过程中保持稳定。

2. 手术准备与刷手

1. 使用小型动物剪毛器去除下腹部区域的所有毛发。以矩形模式剃毛，注意避免划伤乳头或产生剃刀疹，以免对日后活产仔鼠哺乳造成刺激。
2. 用无菌棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇对腹部皮肤进行消毒。重复擦洗操作，使聚维酮碘和70%乙醇各自交替使用3次。待其自然干燥。
3. 通过夹捏....

结果

在E18进行TSHI+LPS处理后，苏木精-伊红染色显示胎盘（图1）和大脑（图2）均出现显著的组织病理学异常。在E19和E21检查的胎盘表现出明显的水肿，伴有微出血，以及在整个蜕膜和迷路层的坏死。还观察到显著的炎性细胞浸润和血管增多。在P2检查的大脑显示出脑室扩大，以及与假手术组相比，白质和皮层下板神经元的丢失。此前，我们已报道TSHI+LPS可诱导炎症反应，并在年轻成年期导致持续性的白质和轴突异常，同时伴随显著的运动功能障碍²⁰。TSHI+LPS还显著降低了P15时大脑皮层中钾-氯共转运体2（KCC2）蛋白的表达水平——KCC2是一种氯离子共转运体，在γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性神经传递的发育过程中起核心作用（图3，*P <0.05）。这些数据表明，在神经环路成熟的关键出生后阶段，KCC2的发育性上调受到损害，该结果与我们先前关于TSHI单独处理对海马CA3区影响的报道一致¹³。

讨论

早产儿脑病在动物模型中难以模拟，原因在于其病因的复杂相互作用、神经发育的时间进程、人类大脑网络形成的复杂性、损伤机制的重叠，以及早产儿中枢神经系统损伤所表现出的多种表型。早产儿脑病与特定细胞类型的易损性相关（即 未成熟少突胶质细胞²¹，以及多种发育调控通路（即 亚板、膜转运蛋白和受体亚基^12,13,22然而，当动物模型尽可能地模拟人类疾病状态时，便可取得显著进展。本文中，我们建立了一种产前损伤模型，该模型整合了早产儿中观察到的中枢神经系统（CNS）损伤机制的异质性，从而可对灰质和白质的损伤及恢复进行后续评估。在人类中，上行性细菌感染会削弱羊膜，并诱发胎膜早破。此外，胎盘灌注缺陷会加剧胎盘界面的应激反应，并破坏胎盘稳态。因此，胎盘灌注不足会加重宫内感染所致的中枢神经系统损伤。不可否认，在啮齿类动物中模拟先于绒毛膜羊膜炎发生的上行性细菌感染这一常见临床情况具有挑战性，因其具有双子宫结构。每侧子宫角均有独立的宫颈，且可同时维持多胎妊娠。尽管存在这些挑战，临床前模型已逐步改进，以涵盖母体-胎盘-胎儿单元的多个组成部分并加以整合 在子宫内 不同程度的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水溶液	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
伊文思蓝染料	Sigma	E2129
外科手套	Biogel	40870
手术巾	Cardinal Health	287000-008	无菌
PDI 酒精消毒片	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco 可充电剃毛器	Kent Scientific Corp.	CL8787
聚维酮碘外科洗手液	Purdue Products L.P.	67618-151-17
眼用润滑剂	Refresh Lacri Lube	00023-0312
钝头镊子	Roboz	RS-8100
剪刀	Roboz	RS-6808
外科剪刀	Roboz	RS-5880
外科剪刀	F.S.T.	14002-16
注射器	BD	309628	1 ml
针头	BD	305122	25G 5/8
针头	BD	305128	30G 1
棉签	Fisherbrand	23-400-114	小型，6 英寸无菌
棉纱布海绵	Fisherbrand	22-362-178
持针器	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
血管夹	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G 压力
3-0 Perma Hand Silk 缝线	Ethicon	1684G	黑色编织，3-0（2 号），18"，不可吸收，  PS-1 24 mm 针，3/8 圆弧
胰岛素注射器	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
戊巴比妥
丁丙诺啡
布比卡因
异氟烷
碳酸锂	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus 显微镜载玻片	VWR	48311-703
苏木精	Leica	3801521	Surgipath Gill II 苏木精
伊红	Leica	3801601	Surgipath 伊红
二甲苯	Fisherbrand	X3S-4	组织学级
Permount 中性树胶	Fisherbrand	SP15-100
盖玻片	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium 盖玻片