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利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

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DOI：

10.3791/53196

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2015年11月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of New Mexico, 2Department of Neurosciences, University of New Mexico, 3Department of Neurosurgery, Boston Children's Hospital, 4Department of Neurology, Harvard Medical School

通讯作者： Shenandoah Robinson <Shenandoah.Robinson@childrens.harvard.edu>

本文内容

摘要

早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内 短暂性全身缺氧-缺血及羊膜内脂多糖（LPS）给药模拟绒毛膜羊膜炎，以及感染性刺激与胎盘灌注不足对中枢神经系统发育的相关影响。

摘要

早产儿脑病（EoP）是一个涵盖与早产相关的中枢神经系统（CNS）异常的术语. 为了更好地推进转化研究目标，并揭示与早产相关的脑损伤的新型治疗策略，早产（EoP）的临床前模型必须包含在人类中观察到的产前全身性损伤的相似机制，并涉及母体-胎盘-胎儿系统的多个组成部分。理想情况下，模型应在成年动物中产生类似范围的功能缺陷，并重现多种病理生理特征。为模拟人类系统性胎盘灌注障碍、胎盘低灌注以及与早产早期病原体诱导炎症相关的绒毛膜羊膜炎，我们建立了一种产前短暂性全身缺氧缺血（TSHI）联合羊膜腔内注射脂多糖（LPS）的动物模型。在妊娠Sprague Dawley大鼠中，于胚胎第18天（E18）通过子宫动脉阻断诱导TSHI，可导致胎盘低灌注程度与胎儿中枢神经系统（CNS）损伤严重程度呈梯度相关。当联合羊膜腔内注射LPS时，胎盘炎症加剧，CNS损伤加重，并伴随白质异常、步态障碍及影像学异常。产前TSHI及TSHI+LPS损伤模型满足EoP模型的多项标准，包括重现宫内损伤、导致神经元、少突胶质细胞和轴突丢失、亚板层丧失，以及在成年动物中出现与极早产儿相似的功能缺陷。此外，该模型可用于解析不同类型损伤所诱导的炎症反应机制。 产前短暂性全身缺氧缺血，羊膜腔内脂多糖注射，早产，胎盘低灌注，绒毛膜羊膜炎，中枢神经系统损伤，白质损伤，功能缺陷，动物模型

引言

据估计，美国有超过12%的婴儿在妊娠37周前出生1，早产所致的围产期脑损伤（PBI）是导致永久性残疾的重要原因。早产所致的PBI，也称为早产儿脑病（EoP），会影响整个中枢神经系统（CNS）。CNS损伤常始于in utero，并因绒毛膜羊膜炎等产前过程以及缺氧和败血症等产后并发症而加重。由全身性损害引起的PBI会改变神经发育，导致脑性瘫痪、癫痫、认知发育迟缓以及多种影响情绪调节、记忆和执行功能的神经精神障碍1,2。尽管已有大量研究进展，但对于早产引起的CNS损伤在细胞和分子层面的后果如何转化为早产儿多种神经系统后遗症，目前仍了解有限。这一知识空白阻碍了对CNS损伤严重程度的实时诊断以及新兴干预措施的合理剂量制定。此外，针对这一脆弱患者群体的适龄治疗策略仍不明确。

宫内炎症在极早产中非常常见，涉及复杂的胎儿-母体-胎盘炎症级联反应3。宫内感染常为亚临床表现。胎盘中特定的急性炎症病理表现，即组织学绒毛膜羊膜炎，是胎儿炎症反应的主要决定因素，并与早产相关的脑损伤同时发生3-5。事实上，胎儿炎症反应对早产儿的远期预后具有明确的临床意义。出生时小于胎龄（SGA）或曾发生感染的婴儿，尤其容易出现神经功能缺陷3,4。绒毛膜羊膜炎是早产后的常见病理诊断6,7，组织学检查显示，约70%极早产儿的胎盘存在炎症征象4。此外，绒毛膜羊膜炎与2岁时的认知功能障碍相关8。极早产儿胎盘中母体血管灌注不足的证据，也与儿童期脑瘫相关9。绒毛膜羊膜炎与胎盘灌注缺陷的协同作用，在该人群2岁时异常神经发育结局的极高风险中得到了充分证实10,11。

为了模拟与病原体诱导的炎症相关的、人类系统性胎盘灌注缺陷及绒毛膜羊膜炎，我们建立了一种在大鼠中产前短暂全身性缺氧缺血（TSHI）联合羊膜腔内注射脂多糖（LPS）的动物模型。我们的目标是将此前单独使用TSHI模型的大鼠12-16加以改进，引入宫内炎症因素，以促进早产相关中枢神经系统（CNS）损伤的临床前建模。单独TSHI模型已显示出少突胶质细胞系细胞持续性丢失、皮层神经元减少、细胞死亡增加以及促炎性细胞因子水平升高，且随着缺血时间的进行性延长，损伤呈梯度性变化，符合产前脑损伤的特征16。对该模型缺血成分的进一步改良还表明，大鼠在衰老过程中出现记忆编码障碍、短期与长期记忆缺陷以及轻度肌肉骨骼改变17-19。事实上，我们此前已证实，TSHI联合LPS能够重现早产性脑病（EoP）的病理生理学关键特征，包括少突胶质细胞和神经元丢失、轴突损伤、细胞炎症以及功能异常20。

方案

波士顿儿童医院和新墨西哥大学健康科学中心的机构动物照护与使用委员会已批准所有实验程序。

注意：在开始操作前，需将所有外科器械和外科敷料进行密封、灭菌并高压灭菌。此外，准备术后用药的无菌小瓶，包括0.125%布比卡因和0.1 mg/kg丁丙诺啡。同时无菌配制脂多糖（LPS）溶液：将0.04 mg/ml LPS（0111:B4）溶于含稀释伊文思蓝染料的无菌生理盐水中。

1. 麻醉

  1. 使用由3%异氟烷、70%氮气和30%氧气组成的混合气体，对妊娠18天（E18）的Sprague Dawley大鼠进行麻醉诱导。
  2. 将大鼠从诱导室中取出，仰卧置于设定为37 °C的无菌手术循环水毯上。通过鼻罩给予麻醉气体，并将异氟烷浓度降至2%。
  3. 轻轻在每只眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。在手术过程中持续监测动物的体温、呼吸频率和心率。母体生理状态应在整个操作过程中保持稳定。

2. 手术准备与刷手

  1. 使用小型动物剪毛器去除下腹部区域的所有毛发。以矩形模式剃毛，注意避免划伤乳头或产生剃刀疹，以免对日后活产仔鼠哺乳造成刺激。
  2. 用无菌棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇对腹部皮肤进行消毒。重复擦洗操作，使聚维酮碘和70%乙醇各自交替使用3次。待其自然干燥。
  3. 通过夹捏脚趾无反射确认麻醉深度。若无反射且无疼痛反应，则将异氟烷浓度降至1%。
  4. 使用无菌手术巾覆盖动物。注意以适当角度放置手术巾，使其最大限度吸收灌洗液，同时不阻碍子宫角的血液供应。

3. 腹部剖腹术

  1. 使用手术刀在已准备好的腹部皮肤上做一条3 cm的正中切口。用剪刀钝性分离皮肤层与腹筋膜。用镊子和手术剪提起腹筋膜层，切开无血管的腹白线以进入腹膜腔。
  2. 将手术纱布置于切口外部，并用无菌生理盐水润湿。用钝头镊子及对外腹部施加轻压，轻柔地将子宫角从腹膜腔中取出，并置于湿润的纱布上。
  3. 操作时应小心避免与肠管缠绕或接触。使用镊子仅接触各羊膜囊之间的肌性组织，小心排列胚胎。通过钝性分离暴露并游离四条子宫动脉。
    注意：分离子宫动脉时必须格外小心。周围组织及血管本身极为脆弱。母体血管损伤可能导致出血，严重时可导致胎儿及母体死亡。

4. 动脉瘤夹的放置

  1. 在每侧子宫动脉上放置一个30 G的动脉瘤夹。确保血流完全停止，包括近端和远端脉搏消失，以及子宫血管（包括各个胎盘）颜色变暗。用纱布覆盖暴露的子宫角及整个手术区域，并以无菌生理盐水进行冲洗。注意每约10分钟补充一次冲洗液，保持手术区域湿润。
  2. 60分钟后，移除纱布并冲洗手术区域。确保子宫角和血管充分湿润，以便顺利取下夹子。使用镊子轻柔地逐一取下每个动脉瘤夹。操作时注意避免对血管造成损伤，并在取下过程中保持组织完整性。
  3. 充分冲洗子宫角及手术区域，注意清除羊膜囊上可能残留的任何纱布纤维。

5. 向羊膜囊内注射脂多糖

  1. 在每个羊膜囊底部、胎盘板前方，向羊膜腔内注射 100 µl 含伊文思蓝染料稀释液的 LPS（4 µg/囊）。使用钝头镊子固定并旋转每个羊膜囊，使其处于最佳注射位置。稀释的伊文思蓝染料作为一种对比剂，有助于确认注射针头位置正确及注射是否成功。
    注意：羊膜腔内注射必须仅使用带有 8 mm 31 G 针头的超细 0.3 ml 胰岛素注射器。使用较粗的针头将导致慢性羊水流失、胎儿死亡以及妊娠组织被母体吸收。拔出注射器后若出现少量羊水渗漏，可通过直接压迫羊膜囊来减轻。部分大鼠胎儿可能耐受一定程度的羊水过少。然而，若使用较粗针头穿刺造成急性羊水流失，或意外穿刺导致慢性液体渗漏，则会引起胎儿丢失，严重时甚至导致邻近妊娠的丢失。
  2. 用无菌生理盐水冲洗子宫角 3 次。

6. 关闭腹腔切口

  1. 使用镊子小心将子宫角放回腹膜腔。确保羊膜囊与正中切口之间留有足够空间，用连续的3-0丝线缝合肌筋膜层边缘。缝合肌肉切口时，应注意羊膜囊的位置，避免将缝线穿入或穿过羊膜囊。
  2. 使用连续的3-0丝线缝合皮肤层，关闭皮肤切口。
    注意：剖腹手术切口应采用两层连续缝合，以适应妊娠进展过程中皮肤和肌肉的扩张。连续缝合可使伤口张力均匀分布。间断缝合不推荐，因其多个线结可能引起刺激，且大鼠在麻醉恢复后容易啃咬线结。不推荐使用外科缝合钉。外科结的线尾应剪得极短（<3 mm）。
  3. 使用26 G针头在伤口边缘周围皮下注射1 ml 0.125%布比卡因 。在颈背部皮下注射一次0.1 mg/kg的丁丙诺啡。
  4. 关闭异氟烷，根据需要擦干大鼠。将其放入清洁的饲养笼中，并监测其从麻醉中恢复的情况。确保大鼠不发生低体温。

7. 术后恢复与护理

  1. 在72小时内每8-12小时监测大鼠一次，之后每日监测直至幼鼠出生（约E22或E23）。根据IACUC规定，每8-12小时/72小时或按需给予额外剂量的丁丙诺啡。
  2. 监测大鼠是否出现疼痛、不适、阴道出血或手术部位出血。检查缝线和切口，注意确保大鼠未过早啃咬或拆除缝线。尽管极为罕见，但缝线受损的大鼠存在伤口裂开的风险。
    注意：偶尔大鼠可能因丁丙诺啡给药的副作用而摄入过量垫料或其他非食物物品，称为异食癖（pica）。尽管非常少见，仍须监测大鼠是否出现异食癖及可能继发的肠梗阻。

8. 组织处理与冷冻切片

  1. 用于配制苏木精 & 伊红（H&E) 出生后脑组织染色：在出生后第2天（P2）将幼鼠从其原笼中取出。使用手术剪将幼鼠断头，并小心地从颅骨中取出脑组织。
  2. 将脑组织放入含有7 ml 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）的15 ml锥形管中进行沉降固定。将脑组织置于4 °C，固定72小时。
  3. 72 小时后，将脑组织转移至含有 30% 蔗糖（w/v）的无菌 PBS 溶液中，置于 4 °C 保存。
    注意：脑组织一旦沉入蔗糖溶液，即可用于冰冻切片机切片。
  4. 快速冷冻脑组织，并用冷冻切片机的研杵固定，以获取冷冻冠状切片。切割20 µm厚的冷冻冠状切片，并将其贴附于载玻片上。确保切片按顺序连续收集。
  5. 载玻片室温下过夜干燥。将载玻片储存于 -20 °C。

9. 苏木精 & 伊红染色

  1. 取载玻片固定的冷冻切片，室温下复温。
    注意：所有溶液均需新鲜配制。
  2. 将载玻片置于50 °C的载玻片加热台上，孵育2小时。
  3. 将载玻片转移至染色架中。用双蒸去离子水（ddH₂O）浸洗载玻片10次。2O
  4. 将切片置于100%苏木精中孵育5分钟。苏木精孵育时间可根据紫色染色程度进行优化。
  5. 将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在洁净的自来水H中静置2O 1 分钟。
  6. 将拭子在酸性酒精（250 ml 70% 乙醇 + 1 ml 浓盐酸）中浸洗 15 次。
  7. 将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在干净的自来水中静置2O 1 分钟。
  8. 在1%碳酸锂中孵育2分钟。
  9. 将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在干净的自来水中静置2O 持续 1 分钟。
  10. 在95%乙醇中孵育1分钟。
  11. 在100%伊红中浸染7次。伊红浸染次数可根据染色程度进行调整。 粉红色染色。
  12. 将浸片在95%乙醇中浸入5次。
  13. 将浸片在新鲜更换的95%乙醇中浸入5次。
  14. 将切片在100%乙醇中孵育1分钟。
  15. 在新鲜的100%乙醇中孵育载玻片1分钟。
  16. 将载玻片置于100%二甲苯中孵育15分钟。
    注意：二甲苯步骤及盖片操作应在通风橱中进行。
  17. 将切片在新鲜的二甲苯中孵育15分钟，期间更换数次。
  18. 用Permount封片，并在通风橱中晾干。
  19. 使用光学显微镜观察图像切片。  

结果

在E18进行TSHI+LPS处理后，苏木精-伊红染色显示胎盘（图1）和大脑（图2）均出现显著的组织病理学异常。在E19和E21检查的胎盘表现出明显的水肿，并伴有微出血，以及在整个蜕膜和迷路层出现坏死。同时观察到显著的炎性细胞浸润和血管增多。在P2检查的大脑显示脑室扩大，以及与假手术组相比，白质和皮层下板神经元的丢失。此前我们曾报道，TSHI+LPS可诱导炎症反应，并在年轻成年期导致持续性的白质和轴突异常，同时伴随显著的运动功能障碍20。TSHI+LPS还显著降低了P15时大脑皮层中氯化钾共转运体2（KCC2）蛋白的表达水平——该共转运体在γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性神经传递发育过程中起核心作用（图3，*P <0.05）。这些数据表明，在神经环路成熟的关键出生后阶段，KCC2的发育性上调受到损害，该结果与我们先前关于TSHI单独处理对海马CA3区影响的报道一致13。

Histology, tissue sections in microscope image; comparative study; cellular structure analysis.
图1：TSHI+LPS诱导胎盘出现显著的组织学异常。 短暂转染后 在子宫内 缺氧-缺血与胚胎第18天（E18）羊膜内给予LPS对E19 TSHI+LPS胎鼠胎盘的影响B明显水肿，伴有出血（箭头）、坏死和炎性细胞浸润增加，与假手术组相比（A，比例尺 = 100 µm). 请点击此处以查看此图的放大版本。

Histology brain tissue comparison, stained section, showing labeled regions Sp, WM, LV, microscopic analysis.
图2：TSHI联合LPS可诱导小鼠脑组织出现显著的组织学异常。 短暂转染后 在子宫内 胚胎第18天（E18）缺氧缺血联合羊膜内LPS给药，仔鼠出现出生后脑室扩大、亚板神经元减少及白质丢失B）与假手术组相比（A) 在P2期急性处理。（比例尺 = 100 µm；Sp = 皮层下板；WM = 白质；LV = 侧脑室） 请点击此处以查看此图的放大版本。

KCC2 protein expression analysis; bar graph and Western blot results; β-Tubulin as loading control.
图3：TSHI联合LPS降低KCC2表达水平。 从显微解剖分离的皮层组织膜制备物中进行的蛋白质印迹实验显示 在子宫内 胚胎期第18天（E18）给予短暂全身性缺氧-缺血及羊膜内LPS处理，可显著降低出生后第15天KCC2的表达水平。KCC2是一种神经元特异性钾氯共转运体，在整合性脑回路发育及抑制性功能形成中起核心作用。（n = 6–10，均值 ± 标准误，Student t检验，*P < 0.05） <0.05).

讨论

早产儿脑病在动物模型中难以模拟，原因在于其病因的复杂相互作用、神经发育的时间进程、人类大脑网络形成的复杂性、损伤机制的重叠，以及早产儿中枢神经系统损伤所表现出的多种表型。早产儿脑病与特定细胞类型的易损性相关（即 未成熟少突胶质细胞21，以及多种发育调控通路（即 亚板、膜转运蛋白和受体亚基12,13,22然而，当动物模型尽可能地模拟人类疾病状态时，便可取得显著进展。本文中，我们建立了一种产前损伤模型，该模型整合了早产儿中观察到的中枢神经系统（CNS）损伤机制的异质性，从而可对灰质和白质的损伤及恢复进行后续评估。在人类中，上行性细菌感染会削弱羊膜，并诱发胎膜早破。此外，胎盘灌注缺陷会加剧胎盘界面的应激反应，并破坏胎盘稳态。因此，胎盘灌注不足会加重宫内感染所致的中枢神经系统损伤。不可否认，在啮齿类动物中模拟先于绒毛膜羊膜炎发生的上行性细菌感染这一常见临床情况具有挑战性，因其具有双子宫结构。每侧子宫角均有独立的宫颈，且可同时维持多胎妊娠。尽管存在这些挑战，临床前模型已逐步改进，以涵盖母体-胎盘-胎儿单元的多个组成部分并加以整合 在子宫内 不同程度的炎症。尽管没有一种单独的临床前模型能够理想地验证每一个特定假设，但本文所述模型包含了早产中常见的细胞和分子异常、行为与功能障碍、母体-胎盘-胎儿系统，以及宫内感染和胎盘炎症成分。20,23.

用于模拟EoP的物种选择会影响实验数据的解释，这取决于各物种自身固有的局限性。简而言之，出生这一时间点并不等同于所有动物中枢神经系统（CNS）发育的相似阶段24。本文所述模型可在妊娠小鼠和大鼠中实施，但在经验不足或处于应激状态的母鼠中，小鼠幼仔的存活率显著降低。与我们先前的研究一致，在TSHI+LPS处理的大鼠中，出生时（P0）的胎儿丢失率（约40%）高于假手术组、仅LPS组和仅TSHI组；但存活幼仔在P28之前的体重差异无统计学意义20。类似于不同物种之间的差异，妊娠期间损伤发生的时间对子代神经发育轨迹具有关键作用。神经细胞在增殖、迁移和分化等发育阶段的时空调控在不同哺乳动物之间存在差异24–26。这些细胞特异性的发育程序影响了其对损伤的易损性。例如，少突胶质细胞谱系和GABA能神经元发育的时间与早产时间重叠，使这些细胞特别容易受到围产期损伤的影响27–29。因此，本模型选择在E18大鼠（以及成功转化至C57BL/6背景的E17小鼠）上建立，因为该时间点对应于人类妊娠23–25周极早产儿出生前发生的宫内广泛性产前损伤20。我们先前已证实，O4免疫阳性未成熟少突胶质细胞在此发育阶段最受影响16。其丢失与存活率下降及成熟受阻相关14，其中谱系中O4+和O1+阶段的减少最为显著16，这与其他研究者的既往报道一致30。此外，我们还发现亚板层过早丢失、KCC2表达降低、惊厥阈值下降以及步态异常12,13,15，这些均与早产儿GABA能信号失调的表现一致31。

此处描述的模型在研究早产所致围产期脑损伤方面，相较于先前使用的啮齿类动物模型具有诸多优势23它包含了完整的母体-胎盘-胎儿系统，并导致脑部和胎盘损伤。我们此前已发表过假手术组、仅TSHI组、仅LPS组以及TSHI+LPS组之间的比较，涉及功能学结果和生物化学指标的差异。20，以及与分级TSHI的差异16. 尽管先前对新生大鼠单侧颈动脉结扎和全身缺氧的研究已揭示了多种病理生理过程的机制（即 未成熟少突胶质细胞对缺血的易感性），此类模型的直接转化和临床相关性仍较为有限。除上述应用外，本文所述模型还可作为研究早产相关其他器官系统损伤的有用工具，包括坏死性小肠结肠炎（NEC）、心脏、肺、肾脏以及下丘脑-垂体轴功能障碍。由于脂多糖（LPS）药理学的复杂性以及母体与胎儿药效学的差异，对孕鼠进行腹腔注射LPS较难产生与本研究中相同的胎儿炎症反应。此外，LPS难以可靠地通过胎盘屏障。20,32此前，我们尝试了类似于其他小鼠模型中所描述的宫颈局部应用LPS以及宫腔内注射方法33然而，我们发现同窝幼崽中的死亡率和中枢神经系统损伤的一致性显著增加。在此，通过剂量-反应实验优化了每囊4 µg的剂量。向羊膜腔内给予更高剂量的LPS会导致胎儿死亡率升高。与直接使用典型的宫内革兰氏阴性菌感染相比，LPS的优势在于其可通过Toll样受体4激活炎症信号通路，而不会引起活性细菌感染及病原体扩散的相关风险。然而，该模型可进一步改进以纳入从人类胎盘中分离出的常见病原体和微生物，包括B族链球菌 B族链球菌，这会导致大鼠出现胎盘和神经病理学异常以及类似自闭症的行为34同样，解脲支原体脂蛋白多带抗原可模拟解脲支原体属感染。由于解脲支原体是人类绒毛膜羊膜炎最常见的病因35这也可以作为未来研究的一个方向。随着更多灭活感染性病原体的可及，明确它们对神经发育以及神经修复干预措施疗效的差异化影响将具有重要意义。

该模型的局限性包括经羊膜腔注射导致的羊水流失。尽管无菌生理盐水的羊膜腔注射未观察到不良影响，但注射所用针头的规格是一项关键的技术因素。必须注意所用针头不得超过31 G。母鼠因剖腹手术相关的外科并发症极为罕见，包括伤口裂开、肠梗阻、腹膜炎以及完全妊娠丢失，母体死亡率低于5%。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Dan Firl、Chris Corbett 和 Jesse Denson 博士。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS R01 NS060765）向 SR 提供资助，新墨西哥大学的 P30 CoBRE 试点项目和儿童健康标志性项目向 LJ 提供资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 生理盐水溶液SigmaS8776
LPS 011B4SigmaL2630
伊文思蓝染料SigmaE2129
外科手套Biogel40870
手术巾Cardinal Health287000-008无菌
PDI 酒精消毒片Fisherbrand06-669-62
Mini Arco 可充电剃毛器Kent Scientific Corp.CL8787
聚维酮碘外科洗手液Purdue Products L.P.67618-151-17
眼用润滑剂Refresh Lacri Lube00023-0312
钝头镊子RobozRS-8100
剪刀RobozRS-6808
外科剪刀RobozRS-5880
外科剪刀F.S.T.14002-16
注射器BD3096281 ml
针头BD30512225G 5/8
针头BD30512830G 1
棉签Fisherbrand23-400-114小型，6 英寸无菌
棉纱布海绵Fisherbrand22-362-178
持针器Kent Scientific Corp.INS60010912.5 CM STR
血管夹Kent Scientific Corp.INS60012030G 压力
3-0 Perma Hand Silk 缝线Ethicon1684G黑色编织，3-0（2 号），18"，不可吸收，  PS-1 24 mm 针，3/8 圆弧
胰岛素注射器BD3284380.3 cc 3 mm 31G
戊巴比妥
丁丙诺啡
布比卡因
异氟烷
碳酸锂Acros Chemicals554-13-2
Superfrost Plus 显微镜载玻片VWR48311-703
苏木精Leica3801521Surgipath Gill II 苏木精
伊红Leica3801601Surgipath 伊红
二甲苯FisherbrandX3S-4组织学级
Permount 中性树胶FisherbrandSP15-100
盖玻片Fisherbrand12-548-5PFisher Finest Premium 盖玻片

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