锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
树突棘是中枢神经系统中兴奋性突触的突触后区室，表现为分布在树突上的微小突起。其形态在很大程度上依赖于神经元活动，并具有动态特性。树突棘的表面及突触后致密区表达谷氨酸能受体（AMPA受体和NMDA受体）。每个树突棘均能使神经元独立调控其自身状态和局部活动。树突棘的形态已在脑皮层的谷氨酸能锥体细胞中得到广泛研究，研究方法包括活体（in vivo）实验以及来源于啮齿类动物组织的神经元培养。神经病理状态可能与树突棘的诱导和成熟异常相关，这一点已在啮齿类动物培养神经元及一维定量分析中得到证实1。本研究描述了一种利用源自神经干细胞（晚期皮层前体细胞）的人类皮层神经元进行树突棘形态三维定量分析的实验方案。这些细胞最初来源于诱导性 多能干细胞。该方案可用于分析不同培养时期树突棘的形态，并可实现对来自健康对照个体与精神疾病患者来源的诱导性 多能干细胞所分化神经元之间树突棘形态的比较分析。
引言
皮层锥体神经元的树突棘是细小而纤细的突起，分布于啮齿类、灵长类及人类大脑中这些神经元亚型的基底树突和顶树突上。它们是大多数兴奋性突触的发生部位，在学习和认知过程中发挥关键功能。人类树突棘的精细结构已通过透射电子显微镜技术进行了研究2。然而，该方法耗时较长，工作量巨大。最近，已有研究报道利用特定软件结合大量人工树突棘分析，对人类大脑皮层中树突棘形态进行三维（3D）重建3。
绿色荧光蛋白（GFP）技术结合免疫荧光是利用荧光显微镜进行树突棘识别和形态测量的精确工具。该方法可轻松应用于培养的神经元。然而，目前尚未见有关诱导来源的人类神经元树突棘成熟及形态分析的报道 诱导多能干细胞（iPSC）
本研究的目的是描述一种可用于培养的人类神经元树突棘成像的实验方案 体外本方案中使用了GFP标记、共聚焦显微镜以及Imaris软件中Filament Tracer模块的三维分析。本文还简要描述了从神经干细胞（NSC）获得皮层II至IV层谷氨酸能神经元所需的培养步骤。 人类NSC的整个制备方案此前已在其他文献中发表 4.
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方案
1. 神经元培养
注意：成纤维细胞重编程为多能干细胞、向背侧端脑谱系的定向分化、晚期皮质前体细胞（LCP）的分离、扩增与建系，已在 Boissart et al4 中详细描述。LCP样细胞的神经元分化也依据 Boissart et al4 的方法进行，仅作轻微修改。此外，已有其他方法实现将成纤维细胞直接重编程为诱导性 多能干细胞，再进一步分化为神经元。本方案被选用的原因在于其能够选择性地生成锥体样谷氨酸能神经元。
- 用多聚鸟氨酸处理6孔板中的玻璃盖玻片（以DPBS按1/6比例稀释，储存浓度为0.01%），4°C过夜孵育，随后用DPBS洗涤三次。然后在生物安全柜中加入层粘连蛋白（储存浓度为1 mg/ml，以DPBS稀释500倍），孵育至少10小时。
- 以低密度（50,000 个细胞/cm2）将NSC接种并置于含玻璃盖玻片的6孔培养板中，每孔加入3 ml培养基，培养基成分为DMEM/F12（500 ml）、N2添加剂2瓶（每瓶5 ml）、B27添加剂2瓶（每瓶10 ml）、青霉素-链霉素溶液10 ml（青霉素=10,000 单位/ml，链霉素=10,000 单位/ml）、2-巯基乙醇1 ml（储存液：50 mM）以及层粘连蛋白（1/500），不添加生长因子。关键步骤：接种细胞时应缓慢旋转加样，操作务必轻柔，以减少细胞聚集。
- 移除旧培养基，加入新鲜的N2B27培养基，并添加新鲜的层粘连蛋白溶液至终浓度为2 µg/ml，以保持神经元在玻璃盖玻片上的贴附状态并防止成团。每3天更换一次培养基。在更换新鲜培养基前，保留部分原有培养基（200 µl），以避免细胞干燥。或者，也可快速操作并更换全部体积（3 ml）。
2. 慢病毒转导
注意：GFP 慢病毒载体由巴黎巴斯德研究所 Uwe Maskos 博士实验室惠赠，并根据已发表的方案5制备。GFP 表达由小鼠磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动。本研究中，病毒滴度为 400 ng/µl（PBS 1x 中的储存液）。
- 在神经元分化的任何成熟阶段，通过向每孔（6孔板）加入含有40 ng GFP慢病毒载体的储存液1 µl，对人iPSC来源的神经元进行病毒转导，并在新鲜培养基中孵育48小时。注意：本方案中，该孵育时长可实现树突棘结构的良好标记。
3. 免疫荧光
注意：为了改善整个脊髓形态的标记效果，在通透条件下使用抗GFP抗体进行了免疫荧光标记。
- 移除培养基，将转导后的细胞在盖玻片上用4%多聚甲醛在室温下固定10分钟，然后用1× PBS洗涤3次（每次10分钟）。
- 将盖玻片浸入含有0.05% Triton X-100和10%马血清的1×PBS中，在室温下孵育1小时，然后用1× PBS洗涤3次。
- 在每张盖玻片上加入100 µl含4%马血清和抗GFP一抗（1/1,000稀释，即稀释1,000倍）的1×PBS溶液，置于避光盒中于4°C过夜孵育，随后用1×PBS洗涤3次。
- 将Alexa Fluor 488标记的二抗（1/200稀释）加入含0.5% Tween 20的PBS中，室温孵育1小时，然后用1×PBS洗涤3次，最后将盖玻片用荧光显微镜封片剂封于载玻片上。
4. 树突棘成像
- 通过共聚焦激光扫描显微镜进行共聚焦成像。
- 选择具有锥体形态和完整树突分支的健康神经元，并从独立实验中每种条件下定量至少10个神经元。每根树突定量60 - 100 µm。
- 使用40倍油镜（NA = 1.3）和488 nm激光线激发GFP，样品处的典型峰值功率约为20 µW。将像素大小设为约80 nm，以充分采样树突棘。
注意：后续分析需要一幅噪声不影响树突和树突棘正确分割的图像。根据上述空间采样和功率设置，我们观察到3.15 µs的像素驻留时间足以收集足够的光子来构建此类图像。对于荧光较弱的样品，可通过平均2至4次扫描来提高图像质量。可能需要获取多个XY图像 tile 以覆盖感兴趣区域，之后必须在处理前将它们拼接在一起。 - 为采样整个神经元体积，获取Z栈图像，Z轴间距范围为150 nm至300 nm，获得20至30个Z切片。
注意：采用这些设置实现的横向空间分辨率为234 nm，轴向分辨率为591 nm。此处选择的采样是合适的，但由于轴向分辨率大于待成像树突棘的最小尺寸，分析更倾向于从树突横向延伸的树突棘。
5. 树突棘的三维定量分析
注意：以下部分专门描述使用 Imaris 软件进行分析的方法。也存在其他可选方案，包括 NeuronStudio15 或 Metamorph8，这些软件可提供类似的结果。
使用以下关键设置：
- 作为预处理步骤，通过软件提供的图像处理功能使用高斯滤波。通过以下方式执行高斯滤波： 图像处理 > 平滑处理 > 高斯滤波器将滤波器宽度设置为等于XY方向的像素尺寸。
- 使用软件的 Filament Tracer 模块对树突进行半自动追踪。
- 首先，使用距离工具估算树突的直径 切片 软件的标签页。
- 在 超越 标签，单击 丝状结构 工具。为了提高鲁棒性，本方案采用半自动追踪；点击 跳过自动创建模块界面现在显示 吸取 表。 此处选择 AutoPath 作为一种方法， 树突 作为一种类型， 并输入估计的树突直径。
- 使用 选择 指针模式下，光标会变为一个方框。按住 Shift 键并右键单击树突的起始点。注意：软件将执行初步计算。
- 沿树突移动指针。从起始点（以蓝色球体表示）开始，将显示一条黄色线段，代表最可能的树突路径。按住 Shift 键并单击树突的末端点。
- 执行自动树突棘分割。注意： traced 树突上的树突棘将由模块界面自动识别。
- 在模块界面中，单击 创建 表。在 重建 下拉列表，选择 重建树突直径 并检查 保留数据 盒。然后单击 重建.
- 设置 阈值 使得分割后的体积对应于实际的树突体积。作为 算法，选择 距离图中的最短距离 点击 下一步 按钮
- 使用距离工具再次确定最小的树突棘头部直径和最大长度 切片 软件的标签页，然后返回到 超越 按 Tab 键并输入参数。对于本实验方案， 200 - 300 左右的值 最小直径为 nm，最大长度为 4 µm 是合适的起始参数。 不要检查 允许分支棘突 盒子 点击 下一步 按钮
- 调节 种子点阈值 以便代表棘突的蓝色点定位到真实的棘头区域。 点击 下一步 按钮。注意：核心计算现已开始，可能需要较长时间。
- 通过前往对脊柱进行分类 工具 模块界面的选项卡。点击 分类树突棘在提示的用户界面中，确保有四个类别，根据其形态定义如下：短粗型：长度 <1 µm；蘑菇：刺长度 >3 和头部最大宽度 >平均宽度（颈部）x 2；细长型：平均宽度（头部）≥ 平均宽度（颈部）；类丝足状：长度 ≤ 4 µm（无头部）。
注意：该模块界面会生成四个新的 Filament 对象，包含分类结果。 - 导出统计数据：在这四个对象界面中的任意一个中，前往 统计学 表。
点击导出 所有统计结果保存至文件 按钮
注意：可导出用于树突的其他统计值（例如长度、面积、平均直径、分支深度、分支角度、体积 等等），以及树突棘（spines）例如， 直线度、附着面积、不同脊突部分的长度和体积、脊突直径、密度 等等.)
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结果
本研究描述了一种标准化的方案，用于定量分析由诱导多能干细胞（iPSC）培养获得的锥体神经元树突上的树突棘。该方案可实现对人源神经元树突棘成熟过程的分析，并可将其与标准啮齿类动物神经元培养体系以及体内动物模型中树突棘的成熟过程进行可能的比较。
图1A 展示了培养不同阶段的示意图，这些步骤可用于生成皮层锥体神经元。提供此类示意图有助于更好地理解具有不同类别树突棘的锥体神经元在整体时间尺度上的生成过程。然而，重编程步骤不在本研究范围内，已在其他文献中有所描述4。健康的神经元可在培养条件下维持长达65至70天。图1B 展示了树突棘成像及三维定量分析的工作流程。
图2A展示了用抗β III微管蛋白抗体标记的人类神经元的培养情况。该图还显示了细胞聚集的趋势。图2B显示了浅层皮质层中一个GFP标记的锥体神经元，该神经元由晚期皮质前体细胞（LCP）分化40天后形成。
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讨论
锥体神经元形态特征的量化依赖于该软件。使用 Filament Tracer 界面对神经元及其树突棘进行分割，使用 XT 模块对其进行分析。
为了分析本技术的准确性，我们首先将测得的形态学参数（长度、面积以及适用时的总树突棘体积）与已发表的使用大鼠成熟培养锥体神经元的研究6, 7以及人脑组织的研究3中的数据进行了比较。在所有情况下，密度均具有可比性。在大鼠神经元的研究中未描述体积数据（作者所用软件仅报告了二维分析结果），而Benavides-Piccione3在使用其自身协议对选定树突棘进行体积重建的研究中，报告的总树突棘体积略低于我们的数据。这些差异也可能由细胞的脑区来源以及用于标记的荧光染料不同所致。
在本实验方案中，有一些关键点需要特别强调，主要涉及共聚焦图像质量及其后续定量分析的阈值定义。通过将GFP慢病毒载体的转导与抗GFP免疫荧光相结合，可实现对整个树突棘结构的良好标记和清晰可视化。我们发现，采用常规转染方法将GFP载体转染至重编程细胞中，无法实现完整...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由巴斯德研究所、贝唐厄-许勒基金会、法国国家科学研究中心、巴黎狄德罗大学、法国国家科研署（ANR-13-SAMA-0006；SynDivAutism）、康妮-梅娃慈善基金会、科尼亚克-杰伊基金会、橙色基金会和富达曼塔尔基金会资助。L.G. 获得卫生部本科奖学金支持。我们感谢BitPlane公司，特别是Georgia Golfis，在本研究早期阶段提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D-PBS (1x)，不含钙、镁和酚红 | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| 多聚-L-鸟氨酸溶液生物试剂 | Sigma Aldrich | P4957 | |
| 小鼠层粘连蛋白 | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 补充剂 | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 补充剂（不含维生素 A，50x） | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/营养混合物 F-12 含 GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal 培养基 SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-巯基乙醇 | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP 兔多克隆抗体 | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| 马血清 | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体 | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| 多克隆抗 betaIII 微管蛋白抗体 | Millipore | AB9354 | |
| 13 mm 盖玻片 | VWR | 631-0150 | |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra，粘稠液体 | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| 人成纤维细胞 | Coriell 细胞库 | GM 4603 和 GM 1869 | 美国新泽西州卡姆登 Coriell 医学研究所 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss（德国） | LSM 700 | |
| Imaris 软件 | Bitplane AG, 苏黎世 | 6.4.0 版本 | 需要 Filament Tracer 和 Imaris XT 模块 |
| Huygens 软件 | Huygens software, SVI, 荷兰 | Pro 版本 | 可选（用于去卷积测试） |
参考文献
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