树突棘从锥体神经元的三维定量从人类诱导多能干细胞衍生

皮质锥体神经元的树突棘是它们沿着这些神经元亚型的啮齿动物，灵长类动物和人类的大脑基底和顶树突分布小而薄的突起。他们最兴奋性突触的位点，并显示在学习和认知过程的关键功能。人树突棘的详细结构已经从技术上研究了电子显微镜^2。然而，这种方法是费时和表示繁重的工作量。最近，使用组合的大型人工脊椎分析³特定软件的三维（3D）重建树突棘的形态的已报道在人类大脑皮质。

绿色荧光蛋白（GFP）的技术联接到免疫表示由荧光显微镜的精确工具脊柱识别和形状测定。这种方法可以容易地应用于培养的神经元。豪版本，没有数据已被报道脊柱成熟和形态上从诱导的多能干细胞（IPSC）衍生的人神经元分析。

本研究的目的是描述一种协议，它允许从体外培养的人神经元树突棘成像。绿色荧光蛋白标记，激光共聚焦显微镜和3D分析了Imaris软件的灯丝示踪模块进行了本协议中使用。培养的步骤所必需的获得层的皮层谷氨酸能神经元二至四从神经干细胞（NS​​C）也在这里简单说明。整个协议为人类NSC生产已经在别处⁴出版。

1.神经文化

注意:在多能干细胞成纤维细胞重编程，承诺向背侧端脑谱系，推导，放大，和银行的晚期皮质祖细胞（LCP）在Boissart 等人 ⁴进行了描述。还根据Boissart 等人 ⁴在稍微修改执行LCP样细胞的神经元分化。其他程序已经开发了用于成纤维细胞的成诱导多能干细胞，接着通过分化成神经元的直接重编程。该协议被保留下来，因为它允许选择性生产锥体谷氨酸能神经元的。

1. 治疗6孔培养板用玻璃盖玻片用聚鸟氨酸（在DPBS中稀释至1/6，原料浓度0.01％）O / N，随后洗涤三次在DPBS中。然后在至少10小时的流罩下添加层粘连蛋白（储备浓度为1mg / ml，稀释500倍的DPBS） 。
2. 板并调度NSC以低密度N2添加剂的（50,000细胞/ cm ^2）在6孔培养板用在3毫升由DMEM / F12的培养基盖玻片（500毫升），2瓶（5 ml的每种）， 2瓶B27补充剂（每次10毫升），10毫升笔，链霉素（青霉素= 10,000单位/毫升，链霉素= 10000单位/毫升），1毫升2-巯基乙醇（原液:50毫米）和层粘连蛋白（1 / 500），无生长因子。关键的一步:认真执行这一步骤，以减少细胞集群增加细胞的缓慢旋转的动作。
3. 取出培养基。添加含有新鲜的层粘连蛋白溶液2微克/毫升，以保持附着在玻璃盖玻片的神经元，并避免结块新鲜N2B27网上平台。改变介质每3天。为了防止电池从干燥加入新鲜培养基之前保持一些剩余的培养基（200微升）的。可替代地，进行快速改变总体积（3毫升）中。

注意:GFP的慢病毒载体承蒙以下乌韦Maskos实验室博士在巴斯德研究所（巴黎）提供及根据公布的协议⁵制备。 GFP表达由鼠标磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动。在这项研究中，病毒滴度为400纳克/μL（原液在PBS 1X）的。

1. 加入1微升含有40纳克每培养的GFP的慢病毒载体以及（6孔板）的原液转导在成熟通过病毒颗粒的任何步骤人类源自iPSC的神经元，并培育48小时在新鲜培养基中。注意:对于这个协议，孵化时间允许脊柱结构的一个很好的标志。

3.免疫

注意:为了提高整个棘形态的标签，使用抗GFP抗体在透化条件下进行免疫荧光标记。

4.树突棘成像

1. 通过激光共聚焦扫描显微镜进行共聚焦成像。
2. 选择健康的神经元与锥体形态的次全树突分支，并从独立的实验量化每种条件至少10的神经元。量化60 - 每枝晶100微米。
3. 获得使用40X油NA = 1.3的物镜和488nm的激光线的GFP激励图像，具有典型的峰值功率在大约20微瓦样本水平。大约80纳米组像素大小适当样树突棘。
   注:在随后的分析要求的图像，其噪声不影响树突棘和的正确分割。与上述空间采样和功率设置，我们观察到3.15微秒的像素停留时间是足以将收集足够的光子来构建这样的图像。为暗淡的样品，图像质量可以通过平均2至4个扫描得到改善。可能需要购置若干XY切片以覆盖感兴趣的区域，然后处理前一起必须缝合。
4. 品尝整个神经元的体积，获得一个Z堆栈，用为Z间距从150纳米到300纳米，得20至30ž切片。
   注意:实现了与这些设置的横向空间分辨率为234 nm和轴向分辨率为591纳米。这里所选择的采样是足够的，但作为轴向分辨率比要被成像的棘的最小尺寸大，则分析有利于该横向延伸从树突棘。
   

树突棘5.三维定量

注意:以下部分具体介绍了使用了Imaris软件进行分析的。备选实现存在，包括NeuronStudio ¹⁵或的Metamorph ^8，它可以提供类似的结果。

使用下列键设置:

1. 作为一个预处理级，通过由软件提供的图像处理设备利用高斯滤波。通过图像处理> Smoo执行高斯滤波事>高斯滤波器。设置过滤器宽度为等于在XY像素大小。
2. 执行树突的半自动跟踪，使用该软件的灯丝示踪模块。
   1. 首先，估计枝晶直径，通过使用该软件的切片标签的距离的工具。
   2. 在超越选项卡中，单击长丝工具。为了更好的稳健性，该协议依赖于半自动化跟踪;点击跳过自动创建 。该模块接口现在显示绘图选项卡。这里，选择AutoPath为方法， 枝蔓作为一种类型，并输入所估计的枝晶的直径。
   3. 使用指针的选择模式 ，把光标移动到一个盒。对树突起点按住Shift键并单击鼠标右键。注:该软件进行初始计算。
   4. 将沿枝晶的指针。从起点（代表编作为蓝色球体），黄线表示最可能的树突路径​​被示出。对树突端点按住Shift键并单击鼠标左键。
3. 执行自动化的刺分割。注意:在跟踪枝晶的棘将由模块接口自动找到。
   1. 在模块界面中，单击创建选项卡上。 在重建下拉列表中，挑选重建枝蔓径及检查保持数据框中 。 然后单击重建。
   2. 设置阈值 ，使得所分割的体积对应于实际树枝状结晶体积。作为一个算法 ， 然后从距离图最短距离。单击下一步按钮。
   3. 确定最小棘头直径和最大长度，再通过使用软件的片标签的距离的工具，然后再回来了超越选项卡并输入参数。 F或者该协议，约200个值 - 300纳米的最小直径4微米的最大长度是很好的出发点。不要选中允许分局棘框。 单击下一步按钮。
   4. 调整种子点阈值 ，使代表刺蓝色点定位到实际的脊椎头。 单击下一步按钮。注:现在的核心计算完成，可能会很长。
4. 通过将模块接口的工具选项卡分类刺。点击分类刺。在提示用户界面时，请确保有四大类，由它们的形态定义如下:末节:长度<1微米;蘑菇:长度（脊椎）> 3和最大宽度（头）>平均宽度（颈）×2;细细长长的:平均宽度（头）≥平均宽度（颈部）;丝状伪足样:长度≤4微米（无头）。
   注:莫独乐界面生成包含分类的结果四个新的灯丝的对象。
5. 出口统计数据:在所有这四个对象接口的，去统计选项卡。
   点击导出所有统计到文件按钮 。
   注:其他统计值可导出为树突（如，长度，面积，平均直径，分支深度，分枝角度，体积等 ），以及用于棘（ 例如，直线度，的附着，长度和不同的卷区域脊骨零件，脊柱直径，密度等 ）。

本研究描述了一种标准化协议，用于从iPSC的衍生锥体神经元的树突培养脊柱量化。该协议允许对人类神经元脊柱成熟及其与在标准啮齿动物神经元培养棘的成熟以及体内动物模型可以比较的分析。

图1A表示的不同步骤培养的，其允许生产皮层锥体神经元的方案。这样示意表示，以便更好地了解生产赋予不同类别刺锥体神经元的全球时间缩放提供。 Reprogrammation步骤，然而，这项研究的范围的，并已在别处4所述。健康的神经元，可以保持在培养高达65 - 70天内进行付运图1B示出成像和棘三维量化的工作流程。

图2C和图3A说明了树突棘的区段中的成熟的不同阶段三维重建。两个选择的参数（脊柱密度和棘头体积）的定量分析示于图3B。我们的研究结果表明，这两个参数，增幅比文化时期的预期。

神经差异的时间表的图1（一）概述 erentiation。此示意图说明了三个步骤的神经元分化的。该协议适于从Boissart 等人 4。在步骤1中，人的iPSC衍生早期皮质祖细胞（ 即 ，早期神经上皮细胞从背端脑），随后转化到晚期皮质祖细胞（LCP）。 LCP然后放大为在液氮细胞库。在步骤2中，神经分化在两个星期内完成。步骤3对应于维持在培养神经元的时间较长，为了遵循脊椎生长和渐进成熟。下的培养条件下，健康的神经元可以保持高达65 - 70天成像和棘三维量化的不同步骤（B）的工作流。 （IF:免疫荧光法）。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可透露的。