Method Article

树突棘从锥体神经元的三维定量从人类诱导多能干细胞衍生

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

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锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮质最兴奋性突触的部位。此方法描述在从诱导的多能干细胞衍生的人皮质锥体谷氨酸能神经元脊柱形态的三维定量分析。

Abstract

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树突棘是对应于兴奋性突触的中枢神经系统的突触后隔室的小突起。它们沿树突分布。它们的形态，在很大程度上取决于神经元活动，它们是动态的。树突棘在其表面表达并在突触后密度的水平谷氨酸受体（AMPA和NMDA受体）。每个脊椎使神经元能够独立控制其国家和地方的活动。脊柱形态已被广泛研究，在大脑皮质的谷氨酸锥体细胞，同时使用在体内的方法和从啮齿动物的组织得到的神经元培养物。神经病理症状可以关联到改变的脊柱感应和成熟，如图啮齿动物培养的神经元和一维定量分析1。本研究描述了一个协议，用于脊椎形态的三维定量分析使用人类cortic人神经元的神经干细胞（后期皮质祖细胞）获得。这些细胞最初从诱导的多能干细胞获得的。该协议允许脊柱形态的不同培养时间的分析，并与来自对照个体与那些从患者的精神疾病得到得到诱导多能干细胞之间的可能的比较。

Introduction

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皮质锥体神经元的树突棘是它们沿着这些神经元亚型的啮齿动物，灵长类动物和人类的大脑基底和顶树突分布小而薄的突起。他们最兴奋性突触的位点，并显示在学习和认知过程的关键功能。人树突棘的详细结构已经从技术上研究了电子显微镜2。然而，这种方法是费时和表示繁重的工作量。最近，使用组合的大型人工脊椎分析3特定软件的三维（3D）重建树突棘的形态的已报道在人类大脑皮质。

绿色荧光蛋白（GFP）的技术联接到免疫表示由荧光显微镜的精确工具脊柱识别和形状测定。这种方法可以容易地应用于培养的神经元。豪版本，没有数据已被报道脊柱成熟和形态上从诱导的多能干细胞（IPSC）衍生的人神经元分析。

本研究的目的是描述一种协议，它允许从体外培养的人神经元树突棘成像。绿色荧光蛋白标记，激光共聚焦显微镜和3D分析了Imaris软件的灯丝示踪模块进行了本协议中使用。培养的步骤所必需的获得层的皮层谷氨酸能神经元二至四从神经干细胞（NS​​C）也在这里简单说明。整个协议为人类NSC生产已经在别处4出版。

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Protocol

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1.神经文化

注意:在多能干细胞成纤维细胞重编程，承诺向背侧端脑谱系，推导，放大，和银行的晚期皮质祖细胞（LCP）在Boissart 等人 4进行了描述。还根据Boissart 等人 4在稍微修改执行LCP样细胞的神经元分化。其他程序已经开发了用于成纤维细胞的成诱导多能干细胞，接着通过分化成神经元的直接重编程。该协议被保留下来，因为它允许选择性生产锥体谷氨酸能神经元的。

  1. 治疗6孔培养板用玻璃盖玻片用聚鸟氨酸（在DPBS中稀释至1/6，原料浓度0.01％）O / N，随后洗涤三次在DPBS中。然后在至少10小时的流罩下添加层粘连蛋白（储备浓度为1mg / ml，稀释500倍的DPBS） 。
  2. 板并调度NSC以低密度N2添加剂的（50,000细胞/ cm 2）在6孔培养板用在3毫升由DMEM / F12的培养基盖玻片（500毫升），2瓶（5 ml的每种）， 2瓶B27补充剂（每次10毫升），10毫升笔，链霉素（青霉素= 10,000单位/毫升，链霉素= 10000单位/毫升），1毫升2-巯基乙醇（原液:50毫米）和层粘连蛋白（1 / 500），无生长因子。关键的一步:认真执行这一步骤，以减少细胞集群增加细胞的缓慢旋转的动作。
  3. 取出培养基。添加含有新鲜的层粘连蛋白溶液2微克/毫升，以保持附着在玻璃盖玻片的神经元，并避....

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Results

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本研究描述了一种标准化协议，用于从iPSC的衍生锥体神经元的树突培养脊柱量化。该协议允许对人类神经元脊柱成熟及其与在标准啮齿动物神经元培养棘的成熟以及体内动物模型可以比较的分析。

图1A表示的不同步骤培养的，其允许生产皮层锥体神经元的方案。这样示意表示，以便更好地了解生产赋予不同类别刺锥体神经元的全球时间缩放提供。 Reprogrammation步骤，然而，这项研究的范围的，并已在别处4所述。健康的神经元，可以保持在培养高达65 - 70天内进行付运图1B示出成像和棘三维量化的工作流程。

ove_content"> 图2A示出标记与抗-βIII微管蛋白的抗体的人类神经元的培养。该图还显示细胞簇的倾向。 图2B示出了浅皮质层在40天后分化GFP标记锥体神经元后期皮质祖细胞（LCP）。

图2C和图3.......

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Discussion

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的锥体神经元的形态学特征的量化依靠软件。灯丝示踪接口用于神经元和刺的分割，以及XT模块用于自己的分析。

分析我们技术的准确性，我们首先比较所测量的形态学参数（长度，面积和总体积脊柱适用时），与那些使用大鼠成熟锥体神经元在培养6,7和人脑组织3出版。密度是相当的所有情况。没有量 ​​的数据是在大鼠神经元描述了使用自己的协议为容积重建（二维分析报告与作者使用的软件），而全脊柱的体积相比，我们的数据略有下降，在贝纳维德斯-Piccione 3的研究在选定的刺。这种差异也可以通过细​​胞的区域原点和荧光染料用于解释其标签。

一些关键点应该强调在我们的协议，它主要是指阈值定义图像和随后的量词的共聚焦质量。用抗GFP免疫荧光GFP的慢病毒载体的转导的耦合保证了整个脊柱结构的良好标记和可视化。我们没能转染细胞重新编程与GFP载体，并通过传统的协议标签完整的树突分支。通常情况下，70 - 80％的我们的实验条件下，转导的。该百分率是比我们观察到利用转染方案用GFP质粒（转染.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作由巴斯德研究所、贝当古-舒勒基金会、国家科学研究中心、巴黎狄德罗大学、国家研究署 （ANR-13-SAMA-0006;SynDivAutism）、Conny-Maeva 慈善基金会、Cognacq Jay 基金会、Orange 基金会和 Fondamental 基金会。LG 得到了卫生部本科奖学金的支持。我们感谢 BitPlane，特别是 Georgia Golfis 在这项工作的早期阶段提供的帮助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS （1x），不含钙、镁和酚红Gibco/ Life Technologies14190169
聚-L-鸟氨酸溶液 生物试剂Sigma AldrichP4957
小鼠层粘连蛋白Dutscher Dominique354232
N2 添加剂Gibco/ Life Technologies17502048
不含维生素 A 的 B-27 添加剂（50 倍）Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT。混合 F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco/ Life Technologies21103049
2-巯基乙醇Gibco/ Life Technologies31350-010
霉素-步托霉素Gibco/ Life Technologies15140-122
GFP 兔血清多克隆抗体Gibco/ Life TechnologiesA-6455
马血清Gibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 Gibco/ Life TechnologiesA11034
多克隆抗 βIII 微管蛋白抗体MilliporeAB9354
盖玻片 13 mmVWR631-0150
含 DAPI 的延长金抗淬灭试剂Gibco/ Life TechnologiesP36931
Tween（R） 20 Bioextra，粘稠液体Sigma Aldrich ChimieP7949
TritonX-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
人成纤维细胞Coriell 细胞系 生物储存库GM 4603 和 GM 1869Coriell 医学研究所，美国新泽西州卡姆登
共聚焦激光扫描显微镜蔡司（德国）LSM 700
Imaris 软件Bitplane AG，苏黎世6.4.0 版filament Tracer 和 Imaris XT 模块是必需的
惠更斯软件惠更斯软件，SVI，荷兰专业版可选（用于反卷积测试）
青

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

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