利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

摘要

内质网钙稳态在多种病理状态下受到破坏。一种分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMP）报告系统可用于检测内质网钙库的异常变化。本方案描述了使用该报告系统的具体方法。 高塞氏菌 利用荧光素酶SERCaMP检测内质网钙离子稳态 体外 和 体内.

摘要

内质网（ER）含有细胞内最高浓度的钙离子，其浓度约为细胞质水平的5000倍。严格调控内质网中的钙离子水平对于蛋白质折叠、修饰和转运至关重要。内质网钙稳态的紊乱可导致未折叠蛋白反应（unfolded protein response）的激活，这是一种三通路的内质网应激反应机制，并可能参与多种疾病的发病过程。原则上，在疾病发生和发展过程中监测内质网钙离子变化具有重要意义，但在实际操作中仍具挑战性。目前用于监测内质网钙离子的方法，如钙依赖性荧光染料和荧光蛋白，已在细胞水平上揭示了内质网钙离子动态变化的机制，然而这些工具并不适用于活体（in vivo）研究。本实验室已证实，对Gaussia荧光素酶羧基末端进行修饰后，可使其在内质网钙离子耗竭时被分泌出来。本文描述了利用基于荧光素酶的分泌型内质网钙离子监测蛋白（SERCaMP）进行体外（in vitro）和活体（in vivo）研究的方法。本视频重点展示了肝脏注射、GLuc-SERCaMP的药理学调控、血液采集与处理，以及用于长期监测内质网钙离子的检测参数。

引言

内质网（ER）具有多种细胞功能，包括蛋白质折叠、蛋白质分泌、脂质稳态以及细胞内信号传导¹。维持内质网正常功能的核心是保持其腔内钙离子浓度约为细胞质中钙离子浓度的5,000倍^2-4。这一高耗能过程由肌浆/内质网钙离子ATP酶（SERCA）调控，该酶是一种将钙离子泵入内质网的转运蛋白。钙离子从内质网外流主要通过兰尼碱受体（RyR）和三磷酸肌醇受体（IP3R）介导。由于许多内质网功能依赖于钙离子，钙库的紊乱可导致内质网应激，并最终引发细胞死亡。

内质网钙离子稳态失调已在心肌病、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病中被观察到⁵。由于这些疾病具有渐进性特点，阐明发病机制与内质网钙库改变之间的因果关系一直具有挑战性。多种技术已推动了我们对内质网钙动态变化的理解，包括钙离子染料和基因编码的钙指示蛋白（GECIs）。低亲和力钙染料在结合Ca²⁺后荧光增强，可被加载到细胞中用于检测钙离子浓度较高的亚细胞区域⁶。GECIs（如D1ER和CatchER）可实现对钙波动的监测，并更精确地控制其在亚细胞结构中的定位^7-9。最近，另一类被称为细胞器靶向钙指示蛋白（calcium-measuring organelle-entrapped protein indicators, CEPIA）的GECIs已被报道¹⁰。第三种方法结合了遗传学与小分子化学技术....

方案

1. 体外 实验：检测稳定转染的SH-SY5Y细胞系中SERCaMP的释放

1. 将SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL（SERCaMP）细胞接种于经组织培养处理的培养板中，密度为150,000 每平方厘米细胞数² 表面积。例如，对于96孔板，每孔接种50,000个细胞（图1A在DMEM（高糖，GlutaMAX，丙酮酸钠）培养基中培养SH-SY5Y细胞，添加10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素。
   1. 传代细胞最多15次（图1B未测试更高代次的细胞。
   2. 将细胞放回37 °C、5.5% CO₂的加湿培养箱中₂ 并孵育过夜。
2. 在实验处理前，通过将5 µl培养上清液转移至不透光的96孔板中，为每个孔收集基线样本。收集前，轻轻敲击板的各个侧面并轻轻摇晃，以避免梯度效应。用自粘封板膜密封不透光板，并在4 °C下保存，直至进行酶学检测。
   注意：分泌型GLuc-SERCaMP在细胞培养基中非常稳定。我们此前报道，在37 °C孵育72小时后，GLuc活性仅损失约5–10%（在SH-SY5Y细胞上孵育）。¹².
3. 根据实验需求处理细胞，以检测内质网钙离子耗竭（例如 环境、药物、遗传操作）。避免长时间暴露于常温环境（即离开受控培....

结果

GLuc-SERCaMP 方法可通过采集细胞外液来评估内质网钙离子稳态。在实验设计中可包含多个对照以增强结果的解读。首先，使用一种组成型分泌的报告分子（例如 无C末端ASARTDL标签的GLuc（即“GLuc-No Tag”）可用于评估实验处理对分泌途径（全细胞分泌）及外源基因表达的影响。例如，若GLuc-SERCaMP和GLuc-No Tag的胞外水平均升高，则结果被视为不明确。相反，若GLuc-SERCaMP的分泌增加，而GLuc-No Tag无相应变化，则支持该事件依赖于内质网钙离子。图8）。可通过检测细胞内GLuc来进一步评估内质网钙耗竭所引发的GLuc-SERCaMP分泌情况，但该方法仅适用于单个时间点，因检测需进行细胞裂解。随着GLuc-SERCaMP持续分泌，细胞内GLuc-SERCaMP水平将随内质网钙耗竭而下降，而细胞外与细胞内比值（针对每个孔单独计算）则会上升（图2B细胞外：细胞内比例可用于校正转基因表达水平的变化。

药理学调节剂可用于调控内质网钙库，以验证在新范式中内质网钙对.......

讨论

本方案强调了 体外 和 体内 GLuc-SERCaMP 在监测内质网钙耗竭方面的实用性。尽管生成 SERCaMP 的蛋白质修饰似乎可推广至其他报告蛋白¹²，我们选择 Gaussia 与其他荧光素酶相比，该荧光素酶具有更强的生物发光信号（强200-1,000倍）¹⁸. 我们在原代大鼠皮层神经元、SH-SY5Y细胞和大鼠肝脏中，使用100倍剂量范围的GLuc-SERCaMP病毒处理后，均检测到毒胡萝卜素诱导的GLuc-SERCaMP释放图3和图4）。我们先前描述了表达GLuc-ASARTDL的稳定转染细胞系的构建，并证明在5 × 10⁵个细胞群体中仅需20个细胞即可检测到信号⁴ 未标记的细胞可报告由毒胡萝卜素诱导的反应¹²在此，我们显示该稳定细胞系在传代至最多15代（已分析的最高代数）时仍能持续报告Tg诱导的反应，表明随着时间推移，报告分子的持续表达并不影响其在内质网钙耗竭时被释放的能力。图1我们的数据表明，GLuc-SERCaMP .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 离心管	Fisher	02-682-550
10% NP-40 溶液	Pierce	28324	用于细胞内 GLuc 检测
1 ml 鲁尔锁注射器	Fisher	14-823-30
200 微升滤芯吸头	Rainin	RT-L200F
3-0 外科缝线	Fisher	NC9598192
30 G 针头	Fisher Scientific	14-821-13A
粘性微孔板密封膜	Thermo	AB-0558
酒精消毒片	Fisher	22-246-073
麻醉自动流量系统	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
动物恢复舱	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 添加剂	Life Technologies	17504-044
碘伏溶液	Fisher	NC9386574
漂白剂	Clorox	n/a
牛生长血清	Thermo	SH30541.03
腔肠素，天然型	Regis Technologies	1-361204-200
棉签	Puritan	806-WC
切割针 3/8 圆弧缝线	WPI	501803
数字超声清洗机	Fisher Scientific	FS60D
DMEM 高糖，含 GlutaMAX 和丙酮酸	Life Technologies	10569-010
DNA 分子量标准	Life Technologies	10496-016
海肾荧光素酶（重组蛋白）	Nanolight	321-100
海肾荧光素酶抗体（用于 WB、ICC 或 IHC）	New England Biolabs	E8023S	1:2,000（WB）
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
GLuc 检测板（96 孔，不透明）	Fisher	07-200-589
Hank's 平衡盐溶液	Life Technologies	14175-095
肝素	Allmedtech	63323-276-02
异氟烷	Butler Schein	29404
氯胺酮	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop 止血粉	Butler Schein	5867
L-谷氨酰胺	Sigma	G8540
甲醇	Fisher	a452-4
Microfuge 22R 离心机	Bekman Colter	368831
新孢林（Neosporin）	Fisher	19-898-143
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103049
尼康体视显微镜	Nikon	SMZ745T
Nucleospin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒	Machery-Nagel	740609
P200 移液器	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X 快速滴度试剂盒	Clontech	632200
PCR 膜密封片	Fisher	AB0558
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-122
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340
ReFresh 活性炭过滤罐	E-Z Anesthesia	EZ-258
手术刀片，#10	Fine Science Tools Inc	10010-00
SD 大鼠 150-200 g	Charles River	Rats	订购体重为 150-200 g 的大鼠 ，到货后 5 天进行手术
小型动物耳标	National Band and Tag Co	1005-1
无菌手术单	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 酶标仪	BioTek	n/a
TaqMan 通用 PCR 主混合液	Applied Biosystems	4304437
毒胡萝卜素（Thapsigargin）	Sigma	T9033	对人体健康有害
Virapower 慢病毒包装混合物	Life Technologies	K4975-00
Xfect 转染试剂	Clontech	631318
赛拉嗪（Xylazine）	Valley Vet	468RX