本方案提供了一种简单高效的方法，仅使用来源于人胎盘的条件培养基，在明胶包被的培养皿中传代培养人多能干细胞（hPSCs），无需额外添加外源性成分或hPSC特异性的合成基质。
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摘要
摘要
在无饲养层培养条件下，使用源自人类细胞的条件培养基进行人多能干细胞（hPSCs）的扩增已引起广泛关注。然而，一种理想的全人源化 离体 目前尚未开发出无需饲养层的hPSCs扩增方法；当前所有无饲养层培养体系均需在培养基中添加外源性基础成纤维细胞生长因子（bFGF）——一种维持hPSCs状态的关键因子，并使用Matrigel或层粘连蛋白等合成基质。近期，本课题组建立了一种简单高效的hPSCs扩增方案，仅使用人胎盘来源的条件培养基，在明胶包被的培养皿中进行培养，无需额外添加外源性因子或hPSC特异性的合成基质。该方案此前未见报道，有望使研究人员在更接近人体生理条件的培养环境中高效扩增hPSCs。此外，该模型避免了动物源性成分（如病毒或未知蛋白质）导致hPSC污染的风险。同时，该体系利用易于操作的明胶包被，便于hPSC的大规模生产，并显著降低整体成本 离体 hPSC 维持
引言
本方案旨在完全人源化条件下培养人多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（iPSCs） 离体 无饲养层条件，且无需额外添加外源性补充物和合成基质。迄今为止，该领域的发展已取得 离体 将hPSC培养模型应用于临床一直是干细胞研究中的主要关注点。具体而言，需要解决两个关键问题。首先，实现培养体系的人源化 离体 需要一种可避免动物细胞产物污染风险的hPSC培养体系。其次，需要一种无饲养层的培养模型，以促进hPSC的大规模、经济化、便捷生产。对于hPSC的治疗应用，有必要明确调控其自我更新与分化的相关因子。
徐 等最初报道了使用来自小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的条件培养基（CM）在Matrigel上培养人胚胎干细胞（hESCs）的可行性1，许多研究已探讨了最佳 离体 hPSCs的传代培养方法2-4然而，一种理想的人源化 离体 无饲养层的hPSC扩增系统尚未建立，因为现有方法需要在培养基中额外添加外源性基质，包括已知的维持hPSC的因子bFGF和胰岛素5-7此外，所有无饲养层培养中均使用Matrigel或层粘连蛋白等合成基质。
本方案的开发与应用依据源于我们先前的研究，这些研究显示，人胎盘绒毛膜细胞在无需添加bFGF的情况下，能够极好地支持hPSC的扩增8-11。该方案具有多项优势，包括操作简便、成本效益高，并且是一种接近理想的人源化培养体系，可在无需外源性合成基质的条件下实现hPSC的扩增。使用人胎盘来源的条件培养基（hPCCM）培养hPSC包括三个步骤：首先，从人胎盘中分离绒毛膜细胞并进行培养；其次，由培养的细胞制备hPCCM；第三，利用hPCCM培养hPSC，并验证其特性。
该方案将促进人多能干细胞（hPSCs）的临床应用及其增殖和贴附机制的研究。本文介绍了在明胶包被的培养皿中使用hPCCM培养基成功扩增hPSCs的实验方案。
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方案
伦理声明：人胎盘研究为前瞻性研究，已获得韩国大学人类研究机构审查委员会（Korea University Institutional Review Board，批准编号：AN09085-001）的批准。所有实验均在韩国大学医学中心的无菌洁净室设施中进行。使用人多能干细胞（hPSCs）的实验设计及操作程序已获得韩国大学医学中心机构审查委员会（Korea University Medical Center Institutional Review Board，批准编号：AN12277-003）的批准。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
- 用 0.1% 明胶包被所有培养皿。对磷酸盐缓冲液（PBS）和镊子进行高压灭菌。将手术剪刀、微量离心管和纱布在 121 °C、15 lb psi 条件下灭菌超过 15 分钟。
- 在开始操作前，提前准备好预热的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）以及预热的过滤培养基（DMEM），培养基中需含有 20% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素和 100 g/ml 链霉素。
2. 人胎盘细胞的分离
- 在获得书面知情同意后，从妊娠7–32周因正常或治疗性流产接受剖宫产分娩的健康孕妇中获取胎盘组织。
- 由产科专家将人胎盘绒毛板（HPCs）从胎盘中手术分离；在37 °C下用0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育20分钟，然后用5 ml PBS洗涤。
- 使用剪刀从人胎盘绒毛组织（HPCs）中分离绒毛，将绒毛剪碎后用1 ml PBS洗涤三次。剪碎后，用移液枪头将绒毛转移至微量离心管中，加入500 µl PBS反复吹打洗涤，随后以120 × g离心3分钟。再用500 µl预热的培养基洗涤组织两次。
- 在37 °C、5% CO₂条件下，将细胞接种于明胶包被的培养皿中，用培养基培养2，且湿度低于95%。所有培养板均用0.1%明胶在37 °C预包被1小时。成纤维细胞样集落将在相同培养基中培养约5–7天后形成并贴壁生长。
- 每2–3天更换一次培养基，直至第三代。培养过程中，去除悬浮在培养基中的细胞碎片；生长的胎盘成纤维细胞会贴附于培养皿表面。将来源于HPC的成纤维样细胞培养至第10代th 传代后经胰蛋白酶消化和丝裂霉素C（10 µg/ml）处理，用于hESC培养。
- 在将肝前体细胞（HPCs）冷冻保存为库存样品之前，应采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测，以确认HPCs未被常见胎盘感染病原体污染，包括支原体（mycoplasma）发酵支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、口腔支原体、唾液支原体、人型支原体、肺支原体、关节炎支原体、神经溶解支原体、猪肺炎支原体 和 M. capricolum）以及细菌种类， 解脲支原体脲解支原体，使用支原体检测试剂盒进行检测。
- 按照制造商说明书进行RT-PCR，使用试剂盒中提供的所有引物和混合液。采集培养36天后的细胞上清液用于支原体检测。取3 µl上述样品加入PCR反应体系中，并进行后续的1st PCR程序进行35个循环，每个循环包括94 °C 30秒、55 °C 2分钟和72 °C 1分钟。
- 小心加入 0.5 µl 的 1st 将PCR产物加入PCR反应体系中，并进行第二次PCR扩增nd 采用与之前相同的条件进行30个循环的PCR反应。用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物；每种样品取10 µl上样st 和 2nd 将PCR产物上样至凝胶。
- 若发现HPCs被病原体污染，可采用抗生素组合（BM-Cyclin）进行清除，具体操作按照制造商说明书进行。加入含有10 µg/ml BM-Cyclin 1的新培养基培养3天，随后用5 µg/ml BM-Cyclin 2处理细胞再持续4天。重复此循环两次后，再次检测支原体污染情况。
3. 收集人胎盘来源细胞条件培养基（hPCCM）
- 排除污染后，用丝裂霉素-C（10 µg/ml）处理贴壁细胞（85–90% 汇合度；(1.5 × 107 个细胞/瓶）2 小时 30 分钟，然后用 10 ml PBS 洗涤细胞三次。用预热的不含丝裂霉素-C的培养基孵育细胞 24 小时。
- 处理后一天，将细胞在 10 ml 培养基（DMEM-F12 添加 20% Knock-Out 血清替代物 [KOSR]、0.1 mM β-巯基乙醇、1% 非必需氨基酸 [NEAA] 和 1% 青霉素-链霉素）中孵育。孵育 24 小时后，收集条件培养基（CM）至 15 ml 锥形管中，并使用 0.22 µm 注射器滤器过滤 CM。
- 加入另外 10 ml 新鲜培养基继续孵育。每天收集一次培养物的全部上清液，持续 1 周，并将收集的培养基在 –80 °C 冻存。避免反复冻融。
4. 人类胚胎干细胞（hESCs）的培养与诱导多能干细胞（iPSCs）的生成
- 从 WiCell 研究所（美国威斯康星州麦迪逊市）获取人类胚胎干细胞系 H1 和 H9 细胞（分别在 NIH hESC 注册库中登记为 WA01 和 WA09），以及诱导多能干细胞 iPSC-1：iPS(包皮)-1 和 iPSC-2 (IISH1i-BM)。细胞应按照生产商的说明进行解冻和培养。
- 对照组细胞在经基底膜基质包被的培养皿中，使用广泛采用的无饲养层、无血清的确定培养基，在 37 °C 及 5% CO2 条件下培养。初始接种时，将 80–100 个 hPSC 细胞团接种于 35 mm 培养皿中。培养至细胞融合度达 70–80% 时，每 5–6 天常规传代一次，可采用机械法或酶解法（Dispase）。用培养基洗涤细胞两次，并以 1:4 的比例传代接种。每天更换新鲜培养基。
- 实验组细胞在预先用 0.1% 明胶包被的培养皿中，使用 hPCCM 培养基进行培养，每 5 天进行一次常规传代，传代方式可为机械法或酶解法。接种比例为 1:6 至 1:10。hPSC 细胞在转移后 2 天内即可贴附于明胶表面。每天更换新鲜培养基。
5. 人类多能干细胞的表征
注意：使用多种方法对人多能干细胞（hPSCs）进行表征，例如碱性磷酸酶染色、免疫细胞化学、实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法。
- 免疫荧光染色
- 进行免疫荧光染色时，培养 hPSCs，并用含 4% (w/v) 多聚甲醛的固定液在 8 孔板中固定细胞 10 分钟；然后用 0.1% (v/v) Triton-X100 处理细胞 15 分钟以进行通透，再在含 0.1% (v/v) Tween-20 的 PBS 中加入 3% (v/v) 正常马血清封闭细胞 1 小时。每步之间用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
- 将细胞与一抗（OCT-4、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60，稀释比例为 1:1,000）在 4 °C 下孵育过夜（O/N），随后与二抗孵育。
- 封片前，在避光条件下用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育细胞 5 分钟。严格洗涤细胞三次，每次 5 分钟，并在避光条件下完全干燥。用荧光封片剂封片后，在荧光显微镜下观察细胞。
- qRT-PCR
- 根据试剂盒制造商说明书，使用 RNeasy mini 试剂盒提取细胞总 RNA，并用 Nano Drop 分光光度计定量提取的 RNA。
- 将 2 µg 总 RNA 加入含 oligo(dT) 引物和 Superscript II 逆转录酶的 20 µl 反应体系中，按照制造商说明合成 cDNA。
- 使用 Bio-Rad iCycler iQ 系统及 iQ SYBR Green qPCR Master Mix，扩增合成的 cDNA，引物序列见补充表 S1。将目的基因的循环阈值（Ct 值）以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参进行归一化处理。
- 碱性磷酸酶（AP）染色
- 根据试剂盒制造商说明书，使用 ES 细胞鉴定试剂盒检测 AP 活性。
- 第 5 天，吸除培养基，用 PBS 中含 4% 多聚甲醛的溶液固定 hPSCs 12 分钟。注意不可过度固定；固定时间超过 2 分钟会导致碱性磷酸酶失活。吸除固定液后，用 1× 漂洗缓冲液漂洗。各步骤之间切勿让孔板干燥。
- 加入足量染色液覆盖每个孔（35 mm 培养皿每孔 1 ml）。在室温避光条件下孵育 15 分钟 。
- 孵育结束后，用 1× 漂洗缓冲液洗涤培养皿。用 1× PBS 覆盖细胞以防止干燥，使用 Olympus 显微镜观察并成像染色后的细胞。
- 蛋白质印迹（Western Blot）
- 按先前文献9所述方法进行蛋白质印迹分析。简言之，测定细胞裂解液中的蛋白浓度，将等量蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离，随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
- 用封闭液封闭膜后，在 4 °C 下与不同一抗孵育过夜（O/N）；随后与 HRP 标记的二抗在室温孵育 1 小时。每次孵育之间用膜洗涤液洗涤三次，每次 10 分钟。使用 ECL 试剂检测信号。
- 短串联重复序列（STR）分析
- 从对照组和实验组相同代次的 hPSCs 中收集细胞。根据制造商说明书，使用 DNA Micro 试剂盒提取基因组 DNA。
- 使用 AmpF/STR PCR 扩增试剂盒，按照制造商说明对 16 个不同的遗传位点扩增基因组 DNA，并使用遗传分析仪进行毛细管电泳分析。
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结果
该hPSC扩增方法的一个优势在于其使用了由人类细胞分泌的组分。该实验方案中最关键的步骤是人胎盘来源细胞的分离与培养，这需要从HPC板状绒毛的特定部位进行精确解剖。图1展示了人胎盘来源细胞分离的操作流程。该过程简便易行，可在1小时内轻松完成。如图2所述，组织贴附于明胶包被的培养皿后，成纤维细胞样细胞可旺盛生长。在传代过程中通过胰酶消化去除碎片和坏死组织，有助于筛选目标细胞并确保培养体系的均一性。在确认无污染后，这些细胞可用于制备支持hPSC增殖的条件培养基。最佳培养条件定义为：细胞生长至80–85%汇合度，随后人为终止其生长（数据未显示）。
在饲养层细胞或合成基质上培养的人多能干细胞（hPSCs）可转移至经明胶包被的培养皿中，并在hPCCM培养基中继续培养。图3显示，hPSC系在hPCCM中的维持水平与在Matrigel包被培养板上的表现相当（图3A和B）。此前尚未有使用0.1%明胶进行hPSC培养的报道。在我们的实...
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讨论
该模型成功建立了在无饲养层且完全人源化的培养条件下扩增人多能干细胞（hPSCs）的方法，同时维持其生物学特性，且无需添加外源性重组生长因子（如bFGF或胰岛素），从而实现了在人源化微环境中对hPSCs的操控。外源性补充bFGF是常见的做法，而使用Matrigel或层粘连蛋白等基质是实现hPSCs无饲养层培养的必要条件14。
本方案简单且易于实施。然而，某些步骤对其成功至关重要。其中最重要的一步是从胎盘中无菌分离滋养层细胞。由于胎盘的采集方法，支原体等病原体的污染风险较高。因此，在细胞分离过程中进行病原体检测和管理非常重要。此外，所有操作均须在无菌条件下进行。收集人胎盘细胞培养的条件培养基通常较为容易。但操作者需具备人多能干细胞（hPSC）培养的经验，因为这类细胞的操作具有一定难度。另一个需要注意的重要问题是，使用本方案时，hPSCs的贴壁所需时间较长（36–48 小时），相比常用培养方法（约 24 小时）更久。这一差异不会影响hPSCs的存活率或增殖能力。相反，按照本方案培养的hPSCs生长状态比使用传统方案培养的细胞更为稳健。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者谨此感谢韩国高丽大学医学院妇产科学科的洪淳哲（Soon-Cheol Hong，医学博士，哲学博士，副教授）提供胎盘组织。本研究部分得到了大韩民国韩国国家研究基金会（NRF）资助项目（编号：R1211902）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丝裂霉素-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| 支原体检测试剂盒 | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| 分散酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| 明胶 | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR 主混合液 | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| 胚胎干细胞鉴定试剂盒 | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA 合成试剂盒 | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro 试剂盒 | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR 扩增试剂盒 | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl 遗传分析仪 | Applied Biosystems Inc. |
参考文献
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