一种在胎盘条件培养基中利用明胶培养人多能干细胞的新颖培养模型

摘要

本方案提供了一种简单高效的方法，仅使用来源于人胎盘的条件培养基，在明胶包被的培养皿中传代培养人多能干细胞（hPSCs），无需额外添加外源性成分或hPSC特异性的合成基质。

摘要

在无饲养层培养条件下，使用源自人类细胞的条件培养基进行人多能干细胞（hPSCs）的扩增已引起广泛关注。然而，一种理想的全人源化 离体 目前尚未开发出无需饲养层的hPSCs扩增方法；当前所有无饲养层培养体系均需在培养基中添加外源性基础成纤维细胞生长因子（bFGF）——一种维持hPSCs状态的关键因子，并使用Matrigel或层粘连蛋白等合成基质。近期，本课题组建立了一种简单高效的hPSCs扩增方案，仅使用人胎盘来源的条件培养基，在明胶包被的培养皿中进行培养，无需额外添加外源性因子或hPSC特异性的合成基质。该方案此前未见报道，有望使研究人员在更接近人体生理条件的培养环境中高效扩增hPSCs。此外，该模型避免了动物源性成分（如病毒或未知蛋白质）导致hPSC污染的风险。同时，该体系利用易于操作的明胶包被，便于hPSC的大规模生产，并显著降低整体成本 离体 hPSC 维持

引言

本方案旨在完全人源化条件下培养人多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（iPSCs） 离体 无饲养层条件，且无需额外添加外源性补充物和合成基质。迄今为止，该领域的发展已取得 离体 将hPSC培养模型应用于临床一直是干细胞研究中的主要关注点。具体而言，需要解决两个关键问题。首先，实现培养体系的人源化 离体 需要一种可避免动物细胞产物污染风险的hPSC培养体系。其次，需要一种无饲养层的培养模型，以促进hPSC的大规模、经济化、便捷生产。对于hPSC的治疗应用，有必要明确调控其自我更新与分化的相关因子。

徐 等最初报道了使用来自小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的条件培养基（CM）在Matrigel上培养人胚胎干细胞（hESCs）的可行性¹，许多研究已探讨了最佳 离体 hPSCs的传代培养方法^2-4然而，一种理想的人源化 离体 无饲养层的hPSC扩增系统尚未建立，因为现有方法需要在培养基中额外添加外源性基质，包括已知的维持hPSC的因子bFGF和胰岛素^5-7此外，所有无饲养层培养中均使用Matrigel或层粘连蛋白等合成基质。

本方案的开发与应用依据源于我们先前的研究，这些研究显示，人胎盘绒毛膜细胞在无需添加bFGF的情况下，....

方案

伦理声明：人胎盘研究为前瞻性研究，已获得韩国大学人类研究机构审查委员会（Korea University Institutional Review Board，批准编号：AN09085-001）的批准。所有实验均在韩国大学医学中心的无菌洁净室设施中进行。使用人多能干细胞（hPSCs）的实验设计及操作程序已获得韩国大学医学中心机构审查委员会（Korea University Medical Center Institutional Review Board，批准编号：AN12277-003）的批准。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

1. 用 0.1% 明胶包被所有培养皿。对磷酸盐缓冲液（PBS）和镊子进行高压灭菌。将手术剪刀、微量离心管和纱布在 121 °C、15 lb psi 条件下灭菌超过 15 分钟。
2. 在开始操作前，提前准备好预热的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）以及预热的过滤培养基（DMEM），培养基中需含有 20% 胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素和 100 g/ml 链霉素。

2. 人胎盘细胞的分离

1. 在获得书面知情同意后，从妊娠7–32周因正常或治疗性流产接受剖宫产分娩的健康孕妇中获取胎盘组织。
2. 由产科专家将人胎盘绒毛板（HPCs）从胎盘中手术分离；在37 °C下用0.2....

结果

该hPSC扩增方法的一个优势在于其使用了由人类细胞分泌的组分。该实验方案中最关键的步骤是人胎盘来源细胞的分离与培养，这需要从HPC板状绒毛的特定部位进行精确解剖。图1展示了人胎盘来源细胞分离的操作流程。该过程简便易行，可在1小时内轻松完成。如图2所述，组织贴附于明胶包被的培养皿后，成纤维细胞样细胞可旺盛生长。在传代过程中通过胰酶消化去除碎片和坏死组织，有助于筛选目标细胞并确保培养体系的均一性。在确认无污染后，这些细胞可用于制备支持hPSC增殖的条件培养基。最佳培养条件定义为：细胞生长至80–85%汇合度，随后人为终止其生长（数据未显示）。

在饲养层细胞或合成基质上培养的人多能干细胞（hPSCs）可转移至经明胶包被的培养皿中，并在hPCCM培养基中继续培养。图3显示，hPSC系在hPCCM中的维持水平与在Matrigel包被培养板上的表现相当（图3A和B）。此前尚未有使用0.1%明胶进行hPSC培养的报道。在我们的实.......

讨论

该模型成功建立了在无饲养层且完全人源化的培养条件下扩增人多能干细胞（hPSCs）的方法，同时维持其生物学特性，且无需添加外源性重组生长因子（如bFGF或胰岛素），从而实现了在人源化微环境中对hPSCs的操控。外源性补充bFGF是常见的做法，而使用Matrigel或层粘连蛋白等基质是实现hPSCs无饲养层培养的必要条件¹⁴。

本方案简单且易于实施。然而，某些步骤对其成功至关重要。其中最重要的一步是从胎盘中无菌分离滋养层细胞。由于胎盘的采集方法，支原体等病原体的污染风险较高。因此，在细胞分离过程中进行病原体检测和管理非常重要。此外，所有操作均须在无菌条件下进行。收集人胎盘细胞培养的条件培养基通常较为容易。但操作者需具备人多能干细胞（hPSC）培养的经验，因为这类细胞的操作具有一定难度。另一个需要注意的重要问题是，使用本方案时，hPSCs的贴壁所需时间较长（36–48 小时），相比常用培养方法（约 24 小时）更久。这一差异不会影响hPSCs的存活率或增殖能力。相反，按照本方案培养的hPSCs生长状态比使用传统方案培养的细胞更为稳健。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丝裂霉素-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
支原体检测试剂盒	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
分散酶	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
明胶	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy 小量试剂盒	Qiagen	74104
Nano Drop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR 主混合液	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
胚胎干细胞鉴定试剂盒	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA 合成试剂盒	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro 试剂盒	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR 扩增试剂盒	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl 遗传分析仪	Applied Biosystems Inc.