利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

摘要

蛋白质聚集体（即蛋白毒性种子）在细胞间的转移可能介导了神经退行性疾病病理过程的进展。本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测方法，可实现对重组或生物样品中种子活性的特异且灵敏的检测。

摘要

越来越多的证据表明，毒性蛋白聚集体（即蛋白病变种子）的跨细胞传播是多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病及相关tau蛋白病）病理发生与进展的机制。Tau种子在疾病进展中可能发挥的关键作用，强烈提示需要一种灵敏的检测方法，以快速检测生物样本中的种子活性。

通过结合荧光共振能量转移（FRET）的特异性、流式细胞术的高灵敏度以及单克隆细胞系的稳定性，研究人员开发出一种超灵敏的接种检测方法，可用于检测来自重组样本或生物样本（包括人和小鼠脑匀浆）中的蛋白种子。该检测方法采用稳定表达聚集倾向性tau蛋白重复结构域（RD）的单克隆HEK 293T细胞，该结构域携带与疾病相关的P301S突变，并与CFP或YFP融合表达，当蛋白发生聚集时可产生FRET信号。致病性tau蛋白种子（而非其他蛋白）被生物传感器细胞摄取后，会诱导RD-CFP与RD-YFP发生聚集，而流式细胞术可高灵敏度、定量地监测这种聚集引发的FRET信号。该方法可检测飞摩尔浓度（以单体当量计）的重组tau蛋白种子，动态范围跨越三个数量级，并适用于tau蛋白病变转基因小鼠及人类tau蛋白病变患者的脑匀浆样本。经过轻微修改后，该方法还可用于检测其他致病性蛋白种子（如α-突触核蛋白）的接种活性，并兼容原代神经元培养体系。FRET流式细胞术因其操作简便、灵敏度高且应用广泛，适用于研究多种蛋白质聚集相关疾病。

引言

细胞内 tau 淀粉样蛋白的积聚是阿尔茨海默病等 tau 蛋白病的特征。在疾病早期，病变通常局限于大脑的特定区域；但随着疾病进展，病变会沿着特定的神经网络不可避免地扩散^1-5。越来越多的证据表明，毒性蛋白聚集体的跨细胞传播是这一病理过程的基础（详见综述^6-10）。在此模型中，致病性蛋白种子（e.g.，tau）从供体细胞释放并进入邻近细胞，通过模板化的构象改变使正常 tau 蛋白转变为错误折叠的形式^11-15。本文所述的检测方法旨在高灵敏度地检测此类种子活性，适用于重组蛋白和生物样本，并可定量检测极微量的致病性种子活性¹⁶。

稳定表达包含与疾病相关的 P301S 突变的 Tau 重复结构域（RD）并分别与 CFP 或 YFP 融合的 HEK 293T 细胞（下文简称为 tau-RD-CFP/YFP 细胞），可作为检测种子活性的稳定生物传感器。在无蛋白病变种子存在时，细胞中的 Tau 以可溶性单体形式存在，无明显的背景 FRET 信号。然而，当细胞通过自发摄取或脂质体介导的转导方式摄入 Tau 种子后，会导致 RD-CFP 与 RD-YFP 发生聚集，从而产生可通过流式细胞术在单细胞水平检测的 FRET 信号。

该检测的多个组分经过优化设计，以提高灵敏度并降低变异性。选用具有1:1 RD-CFP/YFP表达比例的单克隆细....

方案

注意：本方案重点介绍使用FRET流式细胞术检测小鼠生物样本中的种子活性。该方法同样适用于重组纤维和人类生物样本。小鼠安乐死及脑组织采集均按照经IACUC批准的程序进行。

1. 脑组织提取

1. 使用异氟烷（2%）深度麻醉小鼠后，用含0.03%肝素的冰冻PBS灌注小鼠，并按照Gage et al.¹⁸中描述的细节取出脑组织。
2. 将取出的组织置于冻存管中，通过液氮速冻。或者，也可在干冰上冷冻组织。一旦组织完全冻结，可转移至-80 °C长期保存（如需要）。
   注意：本方案适用于全脑匀浆或显微解剖的脑区。有关详细的显微解剖方案，请参见Hagihara et al.¹⁹。

2. 生物种子材料的制备

1. 通过将蛋白酶抑制剂（无EDTA）溶解于1×TBS中（每10 ml加入1片）来配制匀浆缓冲液。剧烈涡旋混匀，并置于冰上保存。必须使用无EDTA的蛋白酶抑制剂，以维持生物传感器细胞的活力。
2. 在一次性称量舟中称取冷冻脑组织，转移至5 ml锥形管中。加入预冷的匀浆缓冲液，使终浓度为10%（质量/体积）。暂时置于冰上保存。组织质量及后续所用匀浆缓冲液体积将根据脑组织大小和/或使用区域的不同而有所变化。此处，0.2 g重的成年小鼠半脑组织悬浮于2 ml缓冲液中，形成10% w/v的溶液。

结果

FRET 流式细胞术能够对重组或生物样品中的种子活性进行灵敏、定量且快速的检测。该检测方法操作简便：将表达 tau-RD-CFP/YFP 的单克隆来源稳定细胞系用种子材料转导后，孵育 24–48 小时，随后进行流式细胞术分析（图 1A）。在无种子存在时，生物传感器细胞中的 tau 蛋白保持可溶性单体状态（图 1B）；而在种子存在的情况下，生物传感器细胞则会将 tau 蛋白转化为聚集状态（图 1C），从而产生可在单细胞水平上通过流式细胞术检测到的 FRET 信号。定量评估结果显示，生物传感器细胞可响应飞摩尔浓度的种子材料，且种子活性可在三个数量级范围内被有效测定（图 1D）。

设定门控参数以确保能够检测到真实的FRET信号，即使在种子浓度较低的情况下也是如此。首先，使用标准门控方法分离出细胞群体（图2A）和单细胞（图2B）。由于405 nm激光可直接激活YFP，从而产生假FRET信号.......

讨论

此处描述的FRET流式细胞术系统是一种用于快速、定量评估tau蛋白种子活性的强大工具。该方法仅需基本的细胞培养经验以及对FRET和流式细胞术的熟练掌握。其他种子活性检测方法，例如硫黄素T（Thioflavin T）——其在结合β片层结构时荧光增强——操作繁琐，且需要纯化的重组蛋白底物。此外， 体外 用于tau蛋白的接种检测仅具有半定量性，且通常对亚纳摩尔浓度水平的接种物质不敏感^23,24然而，FRET 流式细胞术能够对重组或生物样本中的种子活性提供定量且极为敏感的检测。此外，对该方法进行适当改进后，还可用于研究多种蛋白质聚集类疾病。

尽管本文所述方案主要针对tau蛋白的种子效应，但只需进行简单修改，用户即可利用该方法监测其他类型蛋白病理性种子的成种活性。如Holmes和Furman所示 等，构建稳定表达携带疾病相关A53T突变的α-突触核蛋白的单克隆细胞系，并将其与CFP或YFP荧光蛋白融合标记，从而实现了对全长α-突触核蛋白重组纤维种子活性的高灵敏度检测¹⁶类似的实验已使用亨廷顿蛋白生物传感器细胞进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TBS	Sigma	T5912
蛋白酶抑制剂（无EDTA）	Roche	4693159001
冻存管	Sarstedt	72.694.006
分析天平	Mettler Toledo	XSE 105DU
称量舟	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml 锥形管	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor 超声波均质器	Omni International	18-000-115
超声波均质器微头	Omni International	OR-T-156
2-丙醇	Fisher Scientific	A451
降噪耳罩	Fisher Scientific	19-145-412
吸水纸（Kimwipes）	Fisher Scientific	S47299
1.5 ml 离心管	USA Scientific	1615-5510
微量离心机	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
胎牛血清	HyClone	SH30071.03
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml 锥形管	Phenix Research	SS-PH15
25 ml 试剂储液槽	VWR	41428-954
多通道移液器	Fisher Scientific	TI13-690-049
96孔平底板	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96孔圆底板	Corning	3788
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 离心机	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner 摆动桶转子	Thermo Scientific	75003796
血细胞计数板	VWR	15170-172
MACSQuant VYB 流式细胞仪	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 样品架	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo 分析软件	Flow Jo
20 μl 移液器吸头	Rainin	GPS-L10
200 μl 移液器吸头	Rainin	GPS-250
1 ml 移液器吸头	Rainin	GPS-1000
200 μl 移液器吸头	USA Scientific	1111-1800
5 ml 血清移液管	Phenix Research	SPG-606180
10 ml 血清移液管	Phenix Research	SPG-607180
25 ml 血清移液管	Phenix Research	SPG-760180