小鼠脑血管的纯化

摘要

我们描述了一种用于纯化小鼠脑血管组分的实验方案。分离出的脑血管包括由紧密连接连接的内皮细胞，以及被连续基底膜、周细胞、血管平滑肌细胞和血管周围星形胶质细胞膜包绕的结构。

摘要

在大脑中，大部分血管系统由一种选择性屏障构成，即血脑屏障（BBB），它调控着大脑与血液之间分子和免疫细胞的交换。此外，巨大的神经元代谢需求要求对血流进行实时调节。值得注意的是，这些调节功能的异常是大多数脑部疾病的病因学特征，包括胶质母细胞瘤、脑卒中、水肿、癫痫、变性疾病（例如帕金森病、阿尔茨海默病）、脑肿瘤，以及多发性硬化、脑膜炎和脓毒症引起的脑功能障碍等炎症性疾病。因此，阐明调节脑血管生理的信号事件是一项重大挑战。通过原代培养或从新鲜解离的脑组织中进行细胞分选，可深入了解构成脑血管系统的各类细胞的细胞与分子特性。然而，此类制备方法无法维持细胞极性、形态以及细胞间相互关系等特性。本文所述方案旨在纯化脑血管片段，同时保持其结构完整性。我们证明，分离得到的血管由通过紧密连接封闭的内皮细胞组成，外覆连续的基膜。周细胞、平滑肌细胞以及血管周围星形胶质细胞的终足膜仍附着于内皮层。最后，我们描述了如何在纯化的脑血管上进行免疫染色实验。

引言

中枢神经系统（CNS）的正常功能依赖于高度调控的细胞外环境，其代谢需求远高于其他器官¹。中枢神经系统对多种化学物质极为敏感，这些物质通常对周围器官无害，但对中枢神经系统具有神经毒性。为确保其正常运作，大部分中枢神经系统的血管形成了一道内皮屏障——血脑屏障（BBB），它调控分子、离子在血液与脑组织之间的流动，以及免疫细胞的通过，从而维持正常的稳态²，但同时也限制了治疗药物进入脑内，阻碍了神经系统疾病的治疗³。在细胞层面，血脑屏障主要由内皮细胞之间广泛的紧密连接、外排转运蛋白的极性表达以及极低的跨细胞转运率来维持⁴。血脑屏障的特性与功能主要由邻近细胞诱导形成⁴。其中，周细胞在血脑屏障的诱导和维持过程中发挥重要作用^5,6。作为具有收缩性的细胞，周细胞与大血管周围的平滑肌细胞类似，也能调节血流⁷。最后，星形胶质细胞作为大脑主要的胶质细胞，其长突起（称为终足）包绕着大部分脑血管⁸，调节血脑屏障的完整性与免疫静息状态⁹、代谢物向神经元的转运¹⁰，并促进神经元活动与血流之间的紧密耦合^11,12。

研究脑血管系统的分子与细胞特性对于深入理解其在脑生理及病理生理中的作用至关重要。为解决这一问题，研究人员已开发出分离脑血管系统的方法，可制备结构完整的脑血管片....

方案

1. 溶液与材料  

1. 配制分离容器溶液：B1，将1.5 ml 1 M HEPES加入150 ml HBSS中；B2，将3.6 g葡聚糖加入20 ml B1溶液中；B3，将1 g牛血清白蛋白（BSA）加入100 ml B1溶液中。
2. 通过切掉上部旋紧部分的底部来改装滤器 holder。
3. 配制免疫染色溶液：固定液，含4%多聚甲醛的pH 7.4 PBS溶液；通透/封闭液，用pH 7.4 PBS溶液将山羊血清稀释至5%，Triton X100稀释至0.25%。
   注意：固定步骤取决于所用一抗的类型。

2. 解剖

注意：除非容器用于细胞培养，否则无需无菌条件。

1. 准备一个150 ml烧杯，加入20 ml B1。置于冰上，并用封口膜覆盖以避免空气污染。
2. 在通风橱内，将浸有1 ml纯异氟烷的纸巾放入小鼠笼中，使其深度麻醉。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。采用颈椎脱位法处死小鼠。
   注意：这些步骤均按照国家和机构的相关规定执行。
3. 可选：用 20 ml 1x PBS 进行心脏灌注 以消除血液成分²⁴.
4. 用手术刀从颈部向鼻部切开皮肤并剥离。用1× PBS去除所有污染的毛发。
5. 打开颅骨时，首先将剪刀插入....

结果

此处，我们介绍一种用于机械分离脑血管的实验方案¹⁴. 图1 总结了该技术的主要步骤。脑血管结构复杂，包含多种细胞类型， 即， 由紧密连接封闭并被周细胞、平滑肌细胞和星形胶质细胞足突包围的内皮细胞⁹因此，在分离脑血管后，我们旨在通过免疫染色对纯化血管的结构进行表征，具体方法如本方案第二部分所述。Agrin 作为内皮基底膜的组分，在内皮细胞表面呈现连续且均匀的标记信号（图2A）。内皮紧密连接的组分之一闭合蛋白-1（ZO-1）经免疫染色显示无明显中断，提示内皮紧密连接结构得以保留（图2B）。由NG2标记的周细胞内皮覆盖几乎呈连续状，与先前描述一致。²⁵ (图2C）。最后，平滑肌肌动蛋白标记显示，在大型纯化血管的表面存在一层致密的平滑肌细胞图 2D。这些结果表明，总体 原位 脑血管结构在分离的血管片段中得以保留。

研究表明.......

讨论

血脑屏障调控生理物质在中枢神经系统（CNS）内的进出，并保护中枢神经系统免受血液中潜在有害物质的侵害。它参与多种中枢神经系统病理过程，包括神经退行性疾病²和脑肿瘤²⁸。血脑屏障极低的通透性也阻碍了靶向神经细胞的治疗药物通过，因此开发可逆性开放血脑屏障且不对大脑造成有害影响的方法，成为当前非常活跃的研究领域³。为开展血脑屏障的细胞、分子及药理学研究，特别是从啮齿类动物脑组织中分离血管的实验方案，研究人员已付出了诸多努力。早期方法仅通过不同孔径的筛网对机械解离的脑组织进行过滤，以收集微血管并去除污染的脑实质细胞^13,29,30,31。随后引入了密度梯度离心法，并结合尼龙筛网或玻璃珠柱对脑血管进行过滤^32,33,15。在这些操作中，与尼龙筛网过滤相比，玻璃珠过滤似乎可提高得率；而高速与低速离心相比，有助于提高微血管纯度，但高速离心也会引发剪切应力，从而影响基因表达^15,32。此外，部.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织研磨器，型号 C	托马斯科学	3431E25
centrifuge 5415 R	Eppendorf
centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000320
高性能模块化体视显微镜	Leica	MZ6
紧凑型系统提供高品质徕卡LED1000	Leica	LED1000
低吸附吸头（P1000）	Sorenson BioScience	14200T
Swinnex 47 mm 滤器支架 PP 8/包	Millipore	SX0004700
尼龙网滤膜圆片 亲水性 20 µm 47 mm 100/包	Millipore	NY2004700
尼龙网滤膜，亲水性，100 µm 47 mm 100/包	Millipore	NY1H04700
标准壁硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instrument	B150-86-7.5
显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	1014356290F
盖玻片，1号厚度	赛默飞世尔科技	P10143263NR1
0.2 ml 薄壁管及圆顶盖	赛默飞世尔科技	AB-0266
PARAFILM M（卷装尺寸 4 英寸） × 125 英尺	Sigma	P7793-1EA
HBSS，无钙，无镁，无酚红	生命科技	14175-129
HEPES (1 M)	生命科技	15630056
来自Leuconostoc属细菌的葡聚糖，Mr ~70,000	Sigma	31390
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
10x PBS	Euromedex	ET330
16% 甲醛（w/v），无甲醇	赛默飞世尔科技	28908
Triton X-100	Sigma	X100
双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐（Hoechst）	Sigma	14533
封片剂 Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
来自香蒲属植物（Griffonia simplicifolia）的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 488 标记；稀释比例 1/100	生命科技	I21411
Agrin（兔）；稀释比例1/400	由Markus A Ruegg博士惠赠
抗ZO-1（小鼠，克隆1A12）	生命科技	33-9100	稀释比例 1:500
抗平滑肌肌动蛋白（小鼠，克隆株 1A4）	Sigma	A2547	稀释比例 1:500
抗GFAP（小鼠，克隆GA5）	Sigma	G3893	稀释比例 1:500
抗AQP4（兔）	Sigma	A5971	稀释比例 1:500
抗 Cx43（小鼠，克隆）  2)	BD 生物科学	610061	稀释比例 1:500
抗Olig2（兔）	Millipore	AB9610	稀释比例 1:200
抗 NF-M（小鼠）	由瑞士洛桑大学Beat M. Riederer博士提供	稀释 1:10
抗 Iba1（兔）	和光	019-19741	稀释比例 1:400
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体	生命科技	A11029	稀释比例 1:2,000
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记	生命科技	A11034	稀释比例 1:2,000
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体	生命科技	A21424	稀释比例 1:2,000
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记	生命技术	A21429	稀释比例 1:2,000