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方法文章

小鼠脑血管的纯化

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DOI：

10.3791/53208

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2015年11月10日

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

本文内容

摘要

我们描述了一种用于纯化小鼠脑血管组分的实验方案。分离出的脑血管包括由紧密连接连接的内皮细胞，以及被连续基底膜、周细胞、血管平滑肌细胞和血管周围星形胶质细胞膜包绕的结构。

摘要

在大脑中，大部分血管系统由一种选择性屏障构成，即血脑屏障（BBB），它调控着大脑与血液之间分子和免疫细胞的交换。此外，巨大的神经元代谢需求要求对血流进行实时调节。值得注意的是，这些调节功能的异常是大多数脑部疾病的病因学特征，包括胶质母细胞瘤、脑卒中、水肿、癫痫、变性疾病（例如帕金森病、阿尔茨海默病）、脑肿瘤，以及多发性硬化、脑膜炎和脓毒症引起的脑功能障碍等炎症性疾病。因此，阐明调节脑血管生理的信号事件是一项重大挑战。通过原代培养或从新鲜解离的脑组织中进行细胞分选，可深入了解构成脑血管系统的各类细胞的细胞与分子特性。然而，此类制备方法无法维持细胞极性、形态以及细胞间相互关系等特性。本文所述方案旨在纯化脑血管片段，同时保持其结构完整性。我们证明，分离得到的血管由通过紧密连接封闭的内皮细胞组成，外覆连续的基膜。周细胞、平滑肌细胞以及血管周围星形胶质细胞的终足膜仍附着于内皮层。最后，我们描述了如何在纯化的脑血管上进行免疫染色实验。

引言

中枢神经系统（CNS）的正常功能依赖于高度调控的细胞外环境，其代谢需求远高于其他器官1。中枢神经系统对多种化学物质极为敏感，这些物质通常对周围器官无害，但对中枢神经系统具有神经毒性。为确保其正常运作，大部分中枢神经系统的血管形成了一道内皮屏障——血脑屏障（BBB），它调控分子、离子在血液与脑组织之间的流动，以及免疫细胞的通过，从而维持正常的稳态2，但同时也限制了治疗药物进入脑内，阻碍了神经系统疾病的治疗3。在细胞层面，血脑屏障主要由内皮细胞之间广泛的紧密连接、外排转运蛋白的极性表达以及极低的跨细胞转运率来维持4。血脑屏障的特性与功能主要由邻近细胞诱导形成4。其中，周细胞在血脑屏障的诱导和维持过程中发挥重要作用5,6。作为具有收缩性的细胞，周细胞与大血管周围的平滑肌细胞类似，也能调节血流7。最后，星形胶质细胞作为大脑主要的胶质细胞，其长突起（称为终足）包绕着大部分脑血管8，调节血脑屏障的完整性与免疫静息状态9、代谢物向神经元的转运10，并促进神经元活动与血流之间的紧密耦合11,12。

研究脑血管系统的分子与细胞特性对于深入理解其在脑生理及病理生理中的作用至关重要。为解决这一问题，研究人员已开发出分离脑血管系统的方法，可制备结构完整的脑血管片段。最初报道的脑血管纯化技术采用牛脑作为材料13 并改进后适用于其他物种，尤其是啮齿类动物14在最近的这项研究中，引入了不同孔径的滤器，以将脑血管分离为富含不同直径血管的组分。有趣的是，在此类制备物中，内皮细胞保持了其代谢特性15转运体功能16 和极化17在此，我们详细描述了该方案，并进一步证明分离的血管保留了其大部分功能 原位 结构。内皮细胞通过紧密连接相互连接，并被连续的基膜所包绕。周细胞和平滑肌细胞仍附着于内皮层，血管周围星形胶质细胞膜也保持附着。然而，星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞则被清除。最后，我们描述了一种对分离的脑血管进行免疫染色的操作步骤。

迄今为止，关于脑血管系统的大多数分子和细胞研究都是在通过细胞分选技术分离的纯化脑血管细胞上进行的，这些技术使用细胞特异性报告基因小鼠品系或基于免疫染色的方法18,19。尽管这些技术能够分离出近乎纯的脑血管细胞群体，但分离后的细胞完全失去了其在体（in situ）的形态结构和细胞间相互作用，从而显著影响其分子和细胞特性。本文所述的方案无需使用特异性抗体或转基因小鼠品系，即可实现完整脑血管片段的分离，提供了一种良好的替代方法，因为所分离脑血管的整体结构得以保留，从而减轻了对其分子特性的干扰。分离的血管随后可用于研究血脑屏障（BBB）上的基因活性、蛋白质合成与调控，正如近期研究所述20,21。最后，与激光捕获显微切割技术22,23 相比，本方案成本低廉、操作简便，且可快速在任何实验室中推广应用。

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方案

1. 溶液与材料  

  1. 配制分离容器溶液：B1，将1.5 ml 1 M HEPES加入150 ml HBSS中；B2，将3.6 g葡聚糖加入20 ml B1溶液中；B3，将1 g牛血清白蛋白（BSA）加入100 ml B1溶液中。
  2. 通过切掉上部旋紧部分的底部来改装滤器 holder。
  3. 配制免疫染色溶液：固定液，含4%多聚甲醛的pH 7.4 PBS溶液；通透/封闭液，用pH 7.4 PBS溶液将山羊血清稀释至5%，Triton X100稀释至0.25%。
    注意：固定步骤取决于所用一抗的类型。

2. 解剖

注意：除非容器用于细胞培养，否则无需无菌条件。

  1. 准备一个150 ml烧杯，加入20 ml B1。置于冰上，并用封口膜覆盖以避免空气污染。
  2. 在通风橱内，将浸有1 ml纯异氟烷的纸巾放入小鼠笼中，使其深度麻醉。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。采用颈椎脱位法处死小鼠。
    注意：这些步骤均按照国家和机构的相关规定执行。
  3. 可选：用 20 ml 1x PBS 进行心脏灌注 以消除血液成分24.
  4. 用手术刀从颈部向鼻部切开皮肤并剥离。用1× PBS去除所有污染的毛发。
  5. 打开颅骨时，首先将剪刀插入嗅球前方，然后张开剪刀，将颅骨剪成两部分。
  6. 使用脑部刮勺小心取出大脑。从侧脑室中分离脉络丛，因其会污染血管制备样本。38.
    注意：可选步骤：最终制备物将包含实质组织和脑膜血管。如不希望保留脑膜，可按照以下所述方法剥离脑膜 38.
  7. 将脑组织转移至盛有预冷B1溶液的烧杯中，置于冰上。每次可同时处理最多8个脑组织。

3. 脑组织匀浆

  1. 使用两把手术刀，在B1溶液中手动用力敲打脑组织，随后获得约2 mm大小的小块组织。
  2. 使用自动Dounce匀浆器对样品进行匀浆，以400 rpm的速度进行20次冲程。确保玻璃管保持在冰上，并且在上下移动时Dounce匀浆器的上部始终浸没在溶液中，以防止形成气泡。若需处理多个样品，每次匀浆之间须用去离子水清洗Dounce匀浆器。

4. 血管纯化

  1. 将匀浆液转移至一个50 ml的塑料离心管中，在4 °C条件下以2,000 g离心10分钟。在管底沉淀物上方会形成一层较大的白色界面层（主要为髓鞘，若未进行灌注则沉淀物呈红色）。
  2. 弃去上清液。血管沉淀物与白色界面层将仍粘附在一起。加入20 ml预冷的B2溶液，手动剧烈震荡离心管1分钟。
  3. 在4 °C条件下以4,400 g进行第二次离心，持续15分钟。此时髓鞘将在上清液表面形成一层致密的白色层。
  4. 用手握住离心管并缓慢旋转，使上清液沿管壁流动，从而小心地将髓鞘层从管壁上分离。将髓鞘随上清液一同弃去。含有血管的沉淀物仍附着在管底。
  5. 用包裹在5 ml塑料移液管上的吸水纸轻轻擦拭管内壁，去除所有残留液体，注意避免触碰血管沉淀物。将离心管倒置在吸水纸上，以排尽剩余液体。
  6. 用低吸附枪头在冰上反复吹打，将沉淀物重悬于1 ml预冷的B3溶液中，然后加入另外5 ml的B3溶液。确保血管尽可能分散，避免形成团块或聚集。

5. 过滤

  1. 在冰上准备一个烧杯，加入30 ml冰冻的B3溶液。用封口膜覆盖，以避免空气污染。
  2. 将一个20 µm孔径的滤膜置于改良的滤器支架上，并将其放置在一个烧杯 瓶的顶部，通过加入10 ml冰冻的B3溶液进行平衡。
  3. 将血管组织倒入滤膜上，并用40 ml冰冻的B3溶液冲洗血管。
  4. 用洁净的镊子取出滤膜，并立即将其浸入装有B3溶液的烧杯中。通过轻轻摇动滤膜使血管从滤膜上脱落。
  5. 将烧杯中的内容物转移至一个50 ml塑料离心管中，在4 °C下以2,000 g离心5分钟。
  6. 注意：作为替代方法，第4.6步获得的脑血管悬液可先过滤至100 µm孔径的滤膜上。在此情况下，较大的血管优先保留在滤膜上，而滤过液中含有微血管（主要是毛细血管），随后按上述方法将滤过液过滤至20 µm孔径的滤膜上。
  7. 将微血管沉淀物重悬于1 ml冰冻的B3溶液中，用移液器转移至一个1.5 ml离心管中，在4 °C下以2,000 g离心5分钟。

6. 固定、通透与封闭

  1. 使用1.0 ml低吸附枪头，将样本通过移液操作转移至含有PBS的0.2 ml PCR管中。注意避免触碰样本，因其可能黏附在枪头外壁。后续所有步骤均需在体视显微镜下进行。
  2. 每次更换培养基时，将PCR管置于冰上，待样本沉降至管底后，使用长而细的凝胶加样枪头吸除大部分液体。
  3. 吸除大部分PBS，加入200 µl固定液。轻轻振荡使样本悬浮，室温孵育20分钟。
  4. 吸除固定液，加入200 µl 1x PBS （第一次洗涤），室温孵育5分钟，并重复此步骤共3次。每次操作前均需确认样本已沉降至管底，并小心吸除1x PBS，避免触碰样本。
  5. 最后一次洗涤后，将1x PBS替换为通透/封闭液，室温孵育1小时，期间不时轻轻振荡以重新悬浮样本。

7. 免疫染色

  1. 将透化/封闭液更换为用透化/封闭液稀释的一抗混合液（参见材料表中所用抗体的参考文献及稀释比例），于4 °C孵育过夜。
  2. 在室温下用PBS洗涤3次后，加入用PBS稀释的二抗混合液，室温孵育2小时。
  3. 注意：我们强烈建议使用Hoechst（1:2,000）或DAPI（1:2,000）进行细胞核染色，以便在显微镜下区分血管结构与可能混入的毛发或灰尘颗粒。
  4. 用PBS洗涤3次后，将血管组织重悬于50 µl PBS中。

8. 封片与观察

  1. 准备一个带有硅化玻璃毛细管的吸头：使用手术刀切割P200移液枪吸头，并将毛细管调整到位。该毛细管的近似体积为40 μl。
  2. 使用硅化玻璃毛细管将样本转移至玻璃载玻片上，并用一片吸水纸小心吸除多余液体。
  3. 在样本上滴加一滴封片剂，将盖玻片以45º角接触液滴边缘，使液体沿边缘展开。松开盖玻片，让封片剂缓慢铺展。避光、室温下过夜干燥 。样本可在荧光共聚焦显微镜下观察。

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结果

此处，我们介绍一种用于机械分离脑血管的实验方案14. 图1 总结了该技术的主要步骤。脑血管结构复杂，包含多种细胞类型， 即， 由紧密连接封闭并被周细胞、平滑肌细胞和星形胶质细胞足突包围的内皮细胞9因此，在分离脑血管后，我们旨在通过免疫染色对纯化血管的结构进行表征，具体方法如本方案第二部分所述。Agrin 作为内皮基底膜的组分，在内皮细胞表面呈现连续且均匀的标记信号（图2A）。内皮紧密连接的组分之一闭合蛋白-1（ZO-1）经免疫染色显示无明显中断，提示内皮紧密连接结构得以保留（图2B）。由NG2标记的周细胞内皮覆盖几乎呈连续状，与先前描述一致。25 (图2C）。最后，平滑肌肌动蛋白标记显示，在大型纯化血管的表面存在一层致密的平滑肌细胞图 2D。这些结果表明，总体 原位 脑血管结构在分离的血管片段中得以保留。

研究表明...

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讨论

血脑屏障调控生理物质在中枢神经系统（CNS）内的进出，并保护中枢神经系统免受血液中潜在有害物质的侵害。它参与多种中枢神经系统病理过程，包括神经退行性疾病2和脑肿瘤28。血脑屏障极低的通透性也阻碍了靶向神经细胞的治疗药物通过，因此开发可逆性开放血脑屏障且不对大脑造成有害影响的方法，成为当前非常活跃的研究领域3。为开展血脑屏障的细胞、分子及药理学研究，特别是从啮齿类动物脑组织中分离血管的实验方案，研究人员已付出了诸多努力。早期方法仅通过不同孔径的筛网对机械解离的脑组织进行过滤，以收集微血管并去除污染的脑实质细胞13,29,30,31。随后引入了密度梯度离心法，并结合尼龙筛网或玻璃珠柱对脑血管进行过滤32,33,15。在这些操作中，与尼龙筛网过滤相比，玻璃珠过滤似乎可提高得率；而高速与低速离心相比，有助于提高微血管纯度，但高速离心也会引发剪切应力，从而影响基因表达15,32。此外，部...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 Labex MemoLife 和 ARSEP（多发性硬化研究援助基金会）资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织研磨器，型号 C托马斯科学3431E25
centrifuge 5415 REppendorf
centrifuge 5810 REppendorf5811000320
高性能模块化体视显微镜LeicaMZ6
紧凑型系统提供高品质徕卡LED1000LeicaLED1000
低吸附吸头（P1000）Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm 滤器支架 PP 8/包MilliporeSX0004700
尼龙网滤膜圆片 亲水性 20 µm 47 mm 100/包MilliporeNY2004700
尼龙网滤膜，亲水性，100 µm 47 mm 100/包MilliporeNY1H04700
标准壁硼硅酸盐玻璃管Sutter InstrumentB150-86-7.5
显微镜载玻片赛默飞世尔科技1014356290F
盖玻片，1号厚度赛默飞世尔科技P10143263NR1
0.2 ml 薄壁管及圆顶盖赛默飞世尔科技AB-0266
 PARAFILM M（卷装尺寸 4 英寸） × 125 英尺SigmaP7793-1EA
HBSS，无钙，无镁，无酚红生命科技14175-129
HEPES (1 M)生命科技15630056
来自Leuconostoc属细菌的葡聚糖，Mr ~70,000Sigma31390
牛血清白蛋白SigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% 甲醛（w/v），无甲醇 赛默飞世尔科技28908
Triton X-100SigmaX100
双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐（Hoechst）Sigma14533
封片剂 Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
来自香蒲属植物（Griffonia simplicifolia）的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 488 标记；稀释比例 1/100生命科技I21411
Agrin（兔）；稀释比例1/400由Markus A Ruegg博士惠赠
抗ZO-1（小鼠，克隆1A12）生命科技33-9100稀释比例 1:500
抗平滑肌肌动蛋白（小鼠，克隆株 1A4）SigmaA2547 稀释比例 1:500
抗GFAP（小鼠，克隆GA5）SigmaG3893 稀释比例 1:500
抗AQP4（兔）SigmaA5971 稀释比例 1:500
抗 Cx43（小鼠，克隆）  2)BD 生物科学610061 稀释比例 1:500
抗Olig2（兔）MilliporeAB9610 稀释比例 1:200
抗 NF-M（小鼠）由瑞士洛桑大学Beat M. Riederer博士提供 稀释 1:10
抗 Iba1（兔）和光019-19741 稀释比例 1:400
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体生命科技A11029 稀释比例 1:2,000
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记生命科技A11034 稀释比例 1:2,000
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体生命科技A21424 稀释比例 1:2,000
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记生命技术A21429 稀释比例 1:2,000

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