从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

摘要

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

摘要

功能异常的骨骼肌线粒体在衰老、肥胖和2型糖尿病中观察到的代谢改变中发挥重要作用。通过分离线粒体样本进行线粒体呼吸测定，可评估线粒体功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。目前的分离方法通常需要大量组织，才能获得呼吸测定所需的高质量线粒体。本文所述方法表明，仅需少量小鼠骨骼肌组织（约75–100 mg），即可分离出高质量的纯化线粒体（约450 µg），用于高通量呼吸功能检测。我们通过分光光度法测定柠檬酸合酶活性，确定该分离方法获得的线粒体完整性为92.5±2.0%。此外，对分离线粒体进行的Western blot分析显示，胞质蛋白GAPDH表达微弱，而线粒体蛋白COXIV表达显著。分离线粒体中GAPDH条带不明显，表明分离过程中非线粒体来源的污染极少。最重要的是，氧气消耗率的测定结果表明，这些线粒体具有良好的功能活性。₂ 使用微孔板技术测定耗氧率并确定偶联呼吸测定实验的呼吸控制比（RCR），可显示高度偶联状态（RCR； >6（所有实验均为6次）且具有功能性的线粒体。总之，在先前报道的方法基础上增加一个独立的剪切步骤，并显著降低电机驱动的匀浆速度，使得从较少量的小鼠骨骼肌中分离出高质量且纯度较高的线粒体成为可能，所得线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

引言

线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生ATP。然而，线粒体还具有许多其他重要的细胞功能，包括但不限于：活性氧的生成与解毒、细胞质和线粒体内钙离子的调节、细胞器的运输、离子稳态以及参与细胞凋亡^1,2。因此，线粒体功能障碍在多种疾病的病理过程中发挥作用也就不足为奇，例如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、肥胖和糖尿病^3,4。尤为重要的是，骨骼肌中的线粒体在上述许多病理过程中均发挥着作用^3-5。

使用分离的线粒体进行线粒体呼吸测定，可评估电子传递链和氧化磷酸化的功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。针对多种物种的不同组织和细胞类型，已有相应的线粒体分离方法^6,7。然而，这些方法通常需要大量组织或细胞，才能获得高质量且足量的线粒体，以满足经典测氧呼吸测定实验的要求。

基于微孔板的呼吸测定实验能够利用极少量分离的线粒体进行高通量检测，通常每个孔仅需几微克（µg）⁸。因此，我们对先前发表的方法⁷进行了改进，使其能够从小鼠骨骼肌的更小样本中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的呼吸测定实验。此外，本文还提供了评估线粒体分离制备质量以及线粒体膜完整性的方法。鉴于骨骼肌线粒体参与多种病理过程，氧气（O₂）消耗量的测定在机制驱动型研究中的应用正日益广泛^9,10

方案

动物实验是在弗吉尼亚理工学院暨州立大学机构动物护理与使用委员会批准的方案下进行的。

1. 准备（时间：约45分钟）

1. 在37 °C水浴中解冻0.25%胰蛋白酶、线粒体分离缓冲液（IBM）1和IBM2的冷冻储存液。
2. 用70%乙醇冲洗玻璃器皿和解剖器械，随后用高纯度水冲洗。
3. 将0.25%胰蛋白酶原液用IBM1按1:4比例稀释，配制0.05%胰蛋白酶溶液。
4. 在1.5 ml带螺帽的微量离心管中，按1:100比例将蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液加入细胞裂解缓冲液中。
5. 将5 ml（每只小鼠5 ml）0.05%胰蛋白酶分装至15 ml塑料管中。
6. 将电机驱动的组织匀浆器设定为80 RPM。

2. 骨骼肌线粒体的分离（时间：约90分钟）

1. 通过吸入 CO₂ 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
2. 取自股四头肌和腓肠肌的红肌组织（包括比目鱼肌，总量约为 75–100 mg），具体操作步骤如下：
   1. 将皮肤向小鼠身体方向剥离。
   2. 去除覆盖在股四头肌起点处的脂肪垫。使用尖头剪刀剪断连接髌骨的股四头肌肌腱。
      注意：股四头肌位于近端股骨前侧，可根据其解剖位置进行识别。
   3. 缓慢剪开骨与....

结果

柠檬酸合酶活性可作为膜完整性的检测指标，因为柠檬酸合酶位于线粒体内膜上，因此在膜完整的线粒体悬液中不应存在。图1展示了同一来源分离的线粒体样品在未超声处理与超声处理后柠檬酸合酶活性的比较。超声处理线粒体后，柠檬酸合酶活性显著升高，差异具有统计学意义（P <0.01）。重要的是，分离后的线粒体中，92.5 ± 2.0% 保持完整。

图2展示了分离的线粒体以及整体骨骼肌组织裂解液中GAPDH和COXIV的表达情况。GAPDH是一种位于胞质溶胶中的蛋白质，也可在转位后存在于细胞核中；而COXIV是定位于线粒体内膜的蛋白质。在整体组织裂解液中可明显观察到GAPDH和COXIV的表达。在分离的线粒体中，可检测到COXIV的表达，而GAPDH仅有微弱条带。这些结果表明线粒体分离效果良好，分离过程中非线粒体成分的污染较少。

图3 是采用本实验方案分离得到的线粒.......

讨论

本文所述方法详细介绍了从少量（约75–100 mg）小鼠骨骼肌组织中分离线粒体的操作流程。该分离方法可获得功能良好且纯度较高的线粒体（约450 µg），其功能活性已通过O₂ 消耗速率、RCR 值、最大柠檬酸合酶活性以及免疫印迹分析的蛋白表达。重要的是，通过该方法分离的线粒体可用于基于微孔板的多种呼吸测定实验₂ 允许高通量的消耗技术。

分离骨骼肌线粒体通常需要采用较为剧烈的方法，以从周围的结缔组织和结构蛋白中释放线粒体^7,16。因此，线粒体膜可能受到破坏，从而影响后续呼吸测定实验中线粒体耗氧（O₂）活性的准确性。在先前报道的方法⁷基础上，于组织切除后增加一步使用剃须刀片对组织进行精细剪切的操作，可显著降低机械匀浆时转子的转速（80 rpm 对比 1,600 rpm）。这种更温和的匀浆与重悬技术使得具有完整膜结构的线粒体比例显著提高（92.5±2.0%），该结果通过分离后柠檬酸合酶活性测定评估得出。我们的研究结果与 Asmann et al.¹⁷

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基本脂肪酸	Sigma Aldrich	A6003	N/A
无酸-BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris碱	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-甘露醇	Sigma Aldrich	63559	N/A
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Thermo Scientific	25200-056	N/A
氯化钠 白色晶体或结晶性粉末 ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	L3771	N/A
脱氧胆酸钠	Sigma Aldrich	D6750	N/A
支化十二氧乙烯基壬基苯基醚	Sigma Aldrich	238651	N/A
单刃剃须刀片	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon-100 µm 尼龙细胞滤网	Fisher Scientific	352360	N/A
蛋白酶抑制剂（Halt Protease） &和磷酸酶抑制剂混合液	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml 带螺口盖的微量离心管	赛默飞世尔科技	3474	N/A
氧化锆珠	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH 抗体 (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
抗 COXIV 抗体	细胞信号传导	4844s	任何线粒体内膜蛋白均可满足要求
辣根过氧化物酶标记的Donkey抗Rabbit IgG（H+L）	杰克逊免疫研究	711-035-152	N/A
辣根过氧化物酶标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG（H+L）	杰克逊免疫研究	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225	N/A
丙酮酸，98%	Sigma Aldrich	107360	4°C 保存 °C，用于呼吸测定前用KOH调节pH至7.4
琥珀酸	Sigma Aldrich	S9512	室温保存，使用前用KOH调节pH至7.4
L(-)苹果酸，BioXtra， ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	室温保存，使用前用 KOH 调节至 7.4 后用于呼吸测定实验
L-谷氨酸	Sigma Aldrich	G1251	室温保存，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验
棕榈酰-L-肉碱氯化物	Sigma Aldrich	P1645	-20℃保存 °C
寡霉素A， ≥ 95%（HPLC）	Sigma Aldrich	75351	-20℃保存 °C
羰基氰基-4-(三氟甲氧基)	Sigma Aldrich	C2920	2-8℃保存 °C
苯肼
≥98%（薄层色谱），粉末 [FCCP]
链霉菌属来源的抗霉素A	Sigma Aldrich	A8674	-20℃保存 °C
腺苷5′二磷酸腺苷单钾盐二水合物 [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	-20℃保存 °C，使用前用 KOH 调至 7.4
鱼藤酮	Sigma Aldrich	R8875	室温保存