从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体

线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生 ATP。然而，线粒体具有许多其他重要的细胞功能，包括但不限于：活性氧的产生和解毒、细胞质和线粒体钙的调节、细胞器运输、离子稳态和参与细胞凋亡^1,2。因此，功能失调的线粒体在许多疾病病理中发挥作用也就不足为奇了，例如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、肥胖症和糖尿病^3,4。重要的是，骨骼肌线粒体特别参与许多这些病理^3-5。

微孔板的呼吸计检测允许使用极少量的分离线粒体进行高通量测量，通常每孔只有几 μg⁸。因此，我们提出了对先前发表的方法⁷ 的修改，以允许从少量小鼠骨骼肌中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的呼吸测定。此外，还提供了确定线粒体分离制剂质量和线粒体膜完整性的方法。鉴于骨骼肌线粒体与许多病理状况有关，在机械驱动的研究中测量 O₂ 消耗量在生物医学研究中变得越来越普遍^9,10。

经批准的协议下进行的机构动物护理动物的研究和利用委员会在弗吉尼亚理工学院和州立大学。

1.设置（时间:〜45分钟）

1. 0.25％胰蛋白酶，分离缓冲液为线粒体（IBM）的1和IBM2在37℃水浴中解冻冷冻的商店。
2. 冲洗玻璃器皿和在70％乙醇接着通过高纯度水解剖仪器。
3. 由4部分IBM1稀释1份胰蛋白酶准备从0.25％胰蛋白酶股票0.05％胰蛋白酶溶液。
4. 混合蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物用细胞裂解缓冲液:在1.5ml微量离心管中与螺旋盖（1 100比）。
5. 等分试样5 ml的0.05％胰蛋白酶（5毫升/小鼠）入15ml塑料管。
6. 设置电机驱动组织匀浆80 RPM。

2.隔离骨骼肌线粒体（时间:〜90分钟）

1. 安乐死鼠标的CO ₂
2. 除去从股四头肌和腓肠肌，其中包括如在下面的步骤中描述的比目鱼（〜75-100 mg总）红肌:
   1. 剥离朝向鼠标皮肤。
   2. 去除脂肪垫在股四头肌原点。切附加到用细尖的剪刀髌骨股四头肌腱。
      注意:股四头肌由其上股骨近端的前部解剖位置识别。
   3. 慢慢地剪断骨和四头肌之间的腱膜，同时也避免了股动脉，解放从骨四头肌。切细尖的剪刀肌腱在原点上股骨解放股四头肌，并将在冷冻PBS股四头肌。
   4. 除去可见的脂肪组织过用剪刀股四头肌。翻转股四头肌过这样被覆盖在股骨肌肉的部分正面临ü页。打开股四头肌在一个扇形运动镊子。从每个叶用细尖的剪刀和地点，含5毫升冷冻IBM1的烧杯中取出两个可见的红肌部。
      注意:股四头肌肌肉表现为两个波瓣的红肌位于每个波瓣的横向边缘的条带。
   5. 切开皮肤覆盖跟腱用细尖的剪刀和剥离对鼠标的皮肤。切的露出跟腱和剥离肌肉朝向鼠标的主体。
   6. 切牛筋用细尖的剪刀解放腓肠肌和地点连接到其肌腱冷冻PBS腓肠肌股骨外侧和内侧髁。
   7. 翻转腓肠肌和剥离比目鱼肌并放入含有5毫升冷冻IBM1的烧杯中。风扇打开腓肠肌。卸下三个视觉红肌部（两个侧面和一个内侧表面的红色条）用细尖剪S和它们转移到含有5毫升冷冻IBM1的烧杯中。
3. 从小鼠（如步骤2.2中所述）的另一条腿删除其它〜75-100毫克肌红并放入1.5ml微量离心管中以蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和细胞裂解缓冲液（50mM Tris-盐酸，1毫摩尔EDTA，150毫摩尔NaCl，1％十二烷基硫酸钠，0.5％脱氧胆酸钠，1％聚氧乙烯（9）壬基苯基醚，支链。立即闪冻在液氮中在蛋白质印迹以后使用该第二样品（参见步骤6.1）。
4. 放置在冰上预冷，平板塑料表面在一个大的桶。倒一滴IBM1的在塑料表面使用镊子将所有的切片红肌（步骤2.2.4和2.2.7）的IBM1液滴。切碎的肌肉组织，使用3个单刃刀片通过改变剃须刀，每40秒2分钟。
5. 通过保持在塑料表面上次转移组织糜到一个新的烧杯用5ml新鲜IBM1Ë烧杯和刮肌成用刀片的烧杯中。取该溶液通过100微米的细胞滤网置于50ml锥形管漏它。
6. 吸干一个微妙的任务雨刷组织，然后将其转移到5毫升的0.05％胰蛋白酶溶液。使用镊子从任务雨刮器去除组织。
7. 冰上孵育的肌肉组织中的0.05％胰蛋白酶溶液30分钟。
8. 在200×g离心旋转15毫升锥形管含有胰蛋白酶/肌肉混合物3分钟，在4℃。
9. 倾胰蛋白酶上清到废物容器和悬浮颗粒用3毫升冰冷的IBM1。转移组织到一个45毫升玻璃均化管中。冲洗的15毫升锥形管与另一1.5 ml的IBM1收集任何残留的样品并且将其添加到玻璃匀浆管中。
10. 放置玻璃匀浆管放入烧杯或塑料容器填充中途用冰使玻璃匀浆最小移动烧杯内。
11. 该组织匀浆转移到一个新的15 mL锥形管冲洗玻璃匀浆管6.5毫升IBM1的。倒入IBM1到15毫升锥形管含组织匀浆。
12. 旋的15毫升锥形管中，在700克10分钟，在4℃。轻轻倒出上清液到玻璃高强度离心管并弃沉淀。
13. 旋转从上述步骤的上清液在8,000rpm离心10分钟，在4℃。
14. 除去IBM1上清，通过缓慢加入500μl的IBM2的重悬浮沉淀。切断一个枪头的末端轻轻均质沉淀在IBM2与混合和搅拌运动。添加另一个4.5毫升IBM2向混合物后沉淀完全暂停。
    注意:避免过度研磨而破大颗粒件为T他的可能损坏线粒体膜。
15. 旋转的IBM2 /组织匀浆在8000离心10分钟，在4℃。
    注意:此步骤可以重复在一个干净的高强度离心管分离线粒体的更准确的蛋白质定量在步骤4中，因为残留的BSA可能有助于总蛋白质含量。
16. 去除上清，轻轻地，而是完全通过增加IBM2两个25μl递增用枪头的点切断重悬浮颗粒。轻轻搅拌，每加入25微升IBM2后混合沉淀。把这个线粒体股票冰上。

3.同质化的全组织裂解液（时间:〜45分钟;可完成在第7步）

1. 取出肌肉从被放置在液氮从步骤2.3和在室温下孵育直到完全解冻。
2. 剁碎的组织为〜30秒在冰上用细尖的剪刀。
3. 加入Zirco两个100微升勺鎓氧化物珠到1.5 ml离心管与步骤3.2包含组织糜螺丝帽。均化在使用两个到3 5分钟循环的4-6（介质设置）一个速度设定珠磨机组织匀浆组织。
4. 旋转从步骤3.3，混合物在12000×g离心10分钟，在4℃。删除使用自旋和转印之后1,000微升枪头上清液至1.5 ml微量离心管中。弃沉淀并将上清液在冰上。

4.蛋白质测定法（时间:约30分钟）

1. 确定根据制造商的规格使用BCA蛋白测定试剂盒的整个组织溶解液（步骤3.4）和线粒体股票（步骤2.17）的蛋白质浓度。

5.线粒体膜的完整性;柠檬酸合成酶（CS）活动（时间:约15分钟）

1. 让两个独立的1:20稀释线粒体股票的高纯度水。加的Triton 100-X以一个样品的0.1％和超声处理它设定在一个低水平（765瓦，2幅）。留在冰等稀释。返回样品冰超声处理后。
2. 与执行柠檬酸合酶测定法既非超声处理并使用分光光度测定法如先前所述^11,12-超声处理线粒体稀释。
3. 通过使用下面的方程确定完整的线粒体膜的百分比:
   （非超声CS活动÷超声CS活动）* 100

100- N（％，从上面获得）

6.线粒体提取质量; Western印迹（时间:根据实验室协议）

1. 如先前描述的¹²对整个组织溶解液和分离线粒体进行Western印迹。
   注意:使用对GAPDH初级抗体（1:1000稀释在5％BSA / TBS-T）和COXIV（1:1000稀释在5％脱脂乳/ TBS-T），然后加入抗山羊和兔二抗，分别为（1:10,000）。

7.透气性试验运行（时间:〜90分钟）

1. 执行使用基于微孔板_O 2消耗量测量技术如前所述所需的透气性测定法（见同伴文章和罗杰斯等人^8）。
2. 除以3国国家元首40（RCR）或除国家3U由国家40确定呼吸控制率（RCR）。从点至点痕迹确定RCR当使用两中间（平均值）点，或最高（状态3）和费用最低（状态40）。

柠檬酸合酶活性充当细胞膜的完整性，因为柠檬酸合酶位于线粒体内膜，并且因此不应该存在于线粒体中具有完整的膜悬浮液的测量。 图1表示非超声处理线粒体样品中的柠檬酸合酶活性带有超声处理相比样品相同的隔离。声波处理线粒体结果在统计学上显著增加柠檬酸合酶活性（P <0.01）。重要的是，以下的隔离线粒体的92.5±2.0％是完整的。

图2描述了 GAPDH和COXIV表达在分离线粒体和整个骨骼肌组织溶解液。 GAPDH是位于细胞溶质中的蛋白质，但也可以在转位后的细胞核中，而COXIV是位于线粒体内膜的蛋白质。 GAPDH和COXIV的表达是在整个TISS明显UE裂解液。在分离线粒体，COXIV的表达观察到，而GAPDH只有微弱的频带是显而易见的。这些结果表明良好线粒体隔离，由非线粒体成分的分离过程期间小的污染。

图3是从线粒体使用此协议中分离并用微孔板基于O 2的消耗技术执行进行O 2的消耗速率（OCR）对时间的一个耦合测定（10mM的丙酮酸/ 5mM的苹果酸盐）的代表性跟踪。每个小组代表O 2的消费所描述的机遇与威廉姆斯13种不同的线粒体状态。第一面板代表基底的 O 2消耗，或国家2.第二面板，注射的ADP后，表示最大连接呼吸，或国家3.第三面板，注射的寡霉素A（复合物V的抑制剂），represe后NTS呼吸由于质子漏，或国家40。第四盘，注射FCCP后，表示极大的解偶联呼吸作用，或国家3U。最后，第五面板，注射抗霉素A的后，表示氧化呼吸的抑制。呼吸控制率（RCR），线粒体功能1的量度，被除以状态3由国家的4o。 表4报告的平均RCR值，可以从这个协议的线粒体收率进行替代衬底耦合测定。重要的是，O 2的消耗跟踪和高RCR值表示高度运作，加上线粒体。本文所报道的RCR值是高于或类似比先前报道使用在小鼠骨骼肌7,14,15类似分离方案，从而加剧在此过程中分离出的线粒体的高品质。

图1:柠檬酸合成酶的活性 。柠檬酸合酶的酶活性作为非超声处理超声处理和线粒体用制剂分光光度法测定。值表示为平均值±SEM表示。 ** P <0.01。数据表示n = 3的配对生物学重复，并表示相对于毫克的蛋白质。

图2:细胞质和分离线粒体和整个组织裂解线粒体蛋白表达两者分离线粒体和整个组织裂解物进行免疫印迹以COXIV和GAPDH的抗体。线粒体蛋白质，COXIV，是明显的两个样品中，但是GAPDH只是依稀显而易见的，在分离线粒体。中日缺乏突出的GAPDH带Ë分离线粒体表明一点污染从隔离过程中的非线粒体来源。

图3:耦合测定与线粒体从小鼠骨骼肌中分离代表跟踪的10mM丙酮酸/ 5mM的苹果酸盐耦合线粒体呼吸描记法如通过氧消 ​​耗多井测量来确定。值表示为平均值±标准差。每孔装线粒体蛋白是2.5微克。 OCR = O 2消耗率; ADP =二磷酸腺苷;寡=寡A; FCCP =羰基氰- 4 - （三氟甲氧基）苯腙;抗A =抗霉素A.

表1:股票方案准备。

表2:隔离缓冲线粒体1（IBM1）的制备。

表3:隔离缓冲线粒体2（IBM2）的制备。

表4:对通过第一测量氧气消耗率与微孔板基于透气性检测，随后通过将最大加上呼吸决定再加线粒体呼吸测定呼吸控制比率呼吸控制比率 （ADP刺激的国3）呼吸，由于质子漏（寡的响应国家40）。值表示为箱一个±SE。每孔装线粒体蛋白2.5微克丙酮酸/苹果酸和琥珀酸/鱼藤酮测定，和3.5微克每口井的线粒体蛋白的棕榈酰左旋肉碱/苹果酸和谷氨酸/苹果酸测定的。

乔治·罗杰斯 （George Rogers） 是 Seahorse Bioscience 的一名员工，该公司生产修改了该协议的仪器。