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从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

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DOI：

10.3791/53217

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2015年11月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

本文内容

摘要

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

摘要

功能异常的骨骼肌线粒体在衰老、肥胖和2型糖尿病中观察到的代谢改变中发挥重要作用。通过分离线粒体样本进行线粒体呼吸测定，可评估线粒体功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。目前的分离方法通常需要大量组织，才能获得呼吸测定所需的高质量线粒体。本文所述方法表明，仅需少量小鼠骨骼肌组织（约75–100 mg），即可分离出高质量的纯化线粒体（约450 µg），用于高通量呼吸功能检测。我们通过分光光度法测定柠檬酸合酶活性，确定该分离方法获得的线粒体完整性为92.5±2.0%。此外，对分离线粒体进行的Western blot分析显示，胞质蛋白GAPDH表达微弱，而线粒体蛋白COXIV表达显著。分离线粒体中GAPDH条带不明显，表明分离过程中非线粒体来源的污染极少。最重要的是，氧气消耗率的测定结果表明，这些线粒体具有良好的功能活性。2 使用微孔板技术测定耗氧率并确定偶联呼吸测定实验的呼吸控制比（RCR），可显示高度偶联状态（RCR； >6（所有实验均为6次）且具有功能性的线粒体。总之，在先前报道的方法基础上增加一个独立的剪切步骤，并显著降低电机驱动的匀浆速度，使得从较少量的小鼠骨骼肌中分离出高质量且纯度较高的线粒体成为可能，所得线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

引言

线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生ATP。然而，线粒体还具有许多其他重要的细胞功能，包括但不限于：活性氧的生成与解毒、细胞质和线粒体内钙离子的调节、细胞器的运输、离子稳态以及参与细胞凋亡1,2。因此，线粒体功能障碍在多种疾病的病理过程中发挥作用也就不足为奇，例如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、肥胖和糖尿病3,4。尤为重要的是，骨骼肌中的线粒体在上述许多病理过程中均发挥着作用3-5。

使用分离的线粒体进行线粒体呼吸测定，可评估电子传递链和氧化磷酸化的功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。针对多种物种的不同组织和细胞类型，已有相应的线粒体分离方法6,7。然而，这些方法通常需要大量组织或细胞，才能获得高质量且足量的线粒体，以满足经典测氧呼吸测定实验的要求。

基于微孔板的呼吸测定实验能够利用极少量分离的线粒体进行高通量检测，通常每个孔仅需几微克（µg）8。因此，我们对先前发表的方法7进行了改进，使其能够从小鼠骨骼肌的更小样本中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的呼吸测定实验。此外，本文还提供了评估线粒体分离制备质量以及线粒体膜完整性的方法。鉴于骨骼肌线粒体参与多种病理过程，氧气（O2）消耗量的测定在机制驱动型研究中的应用正日益广泛9,10。

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方案

动物实验是在弗吉尼亚理工学院暨州立大学机构动物护理与使用委员会批准的方案下进行的。

1. 准备（时间：约45分钟）

  1. 在37 °C水浴中解冻0.25%胰蛋白酶、线粒体分离缓冲液（IBM）1和IBM2的冷冻储存液。
  2. 用70%乙醇冲洗玻璃器皿和解剖器械，随后用高纯度水冲洗。
  3. 将0.25%胰蛋白酶原液用IBM1按1:4比例稀释，配制0.05%胰蛋白酶溶液。
  4. 在1.5 ml带螺帽的微量离心管中，按1:100比例将蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液加入细胞裂解缓冲液中。
  5. 将5 ml（每只小鼠5 ml）0.05%胰蛋白酶分装至15 ml塑料管中。
  6. 将电机驱动的组织匀浆器设定为80 RPM。

2. 骨骼肌线粒体的分离（时间：约90分钟）

  1. 通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
  2. 取自股四头肌和腓肠肌的红肌组织（包括比目鱼肌，总量约为 75–100 mg），具体操作步骤如下：
    1. 将皮肤向小鼠身体方向剥离。
    2. 去除覆盖在股四头肌起点处的脂肪垫。使用尖头剪刀剪断连接髌骨的股四头肌肌腱。
      注意：股四头肌位于近端股骨前侧，可根据其解剖位置进行识别。
    3. 缓慢剪开骨与股四头肌之间的腱膜，注意避开股动脉，使股四头肌从骨上分离。在股骨起点处用尖头剪刀剪断肌腱，完全游离股四头肌，并将其放入预冷的 PBS 中。
    4. 用剪刀去除股四头肌表面可见的脂肪组织。将股四头肌翻转，使原本覆盖在股骨上的部分朝上。用镊子以扇形方式打开股四头肌组织。用尖头剪刀从每个叶中分离出两块可见的红肌部分，并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。
      注意：股四头肌呈两个叶状结构，每个叶的外侧边缘附近均有一条红肌带。
    5. 用尖头剪刀剪开覆盖在跟腱上的皮肤，并将皮肤向小鼠身体方向剥离。剪断暴露的跟腱，并将肌肉向小鼠躯干方向剥离。
    6. 用尖头剪刀在股骨的外侧和内侧髁处剪断肌腱，游离腓肠肌，并将带有肌腱的腓肠肌置于预冷的 PBS 中。
    7. 将腓肠肌翻转，剥离下方的比目鱼肌并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。将腓肠肌以扇形打开，用尖头剪刀分离出三块可见的红肌部分（两条外侧和一条内侧浅层红肌条带），并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。
  3. 从小鼠另一条腿中再取约 75–100 mg 的红肌组织（操作方法同步骤 2.2），放入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物以及细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，150 mM NaCl，1% 十二烷基硫酸钠，0.5% 脱氧胆酸钠，1% 聚氧乙烯（9）壬基苯基醚，支链型）的 1.5 ml 微量离心管中。立即用液氮对该第二份样品进行速冻，以备后续用于 Western 印迹分析（见步骤 6.1）。
  4. 将预冷的平坦塑料表面置于装有冰的大桶中。在塑料表面滴加一滴 IBM1，用镊子将所有已切分的红肌组织（步骤 2.2.4 和 2.2.7）转移至该液滴中。使用三把单刃剃须刀片，每 40 秒更换一次刀片，持续剪切组织 2 分钟以充分剪碎肌肉。
  5. 将剪碎的组织转移至另一含有 5 ml 新鲜 IBM1 的烧杯中：将塑料表面置于烧杯上方，用刀片刮下组织使其落入烧杯。将此溶液通过置于 50 ml 锥形管上的 100 µm 细胞滤筛进行过滤。
  6. 用精细擦拭纸吸去组织表面液体，然后将其转移至 5 ml 的 0.05% 胰蛋白酶溶液中。使用镊子将组织从擦拭纸上取下。
  7. 将肌肉组织在冰上孵育 30 分钟，使用 0.05% 胰蛋白酶溶液。
  8. 将含有胰蛋白酶/肌肉混合物的 15 ml 锥形管在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 3 分钟。
  9. 将胰蛋白酶上清液倒入废液容器中，用 3 ml 冰冷的 IBM1 重悬沉淀。将组织转移至 45 ml 玻璃匀浆管中。用另外 1.5 ml IBM1 冲洗 15 ml 锥形管，收集残留样品并加入玻璃匀浆管中。
  10. 将玻璃匀浆管放入盛有半杯冰的烧杯或塑料容器中，确保玻璃匀浆管在其中移动幅度最小。
  11. 使用连接在电机驱动匀浆器上的聚四氟乙烯（PTFE）研杵，以 80 rpm 的速度进行 10 次匀浆操作，每次下压到底部后停留约 2 秒。
  12. 将组织匀浆液转移至新的 15 ml 锥形管中，并用 6.5 ml IBM1 冲洗玻璃匀浆管。将冲洗液倒入含有组织匀浆液的 15 ml 锥形管中。
  13. 将 15 ml 锥形管在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟。小心倾倒上清液至玻璃高强度离心管中，弃去沉淀。
  14. 将上一步所得上清液在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
  15. 弃去 IBM1 上清液，通过缓慢加入 500 µl IBM2 重悬沉淀。剪去移液枪头末端，用轻柔吹打和搅拌的方式将沉淀在 IBM2 中均匀重悬。待沉淀完全悬浮后，再加入 4.5 ml IBM2。
    注意：在分散较大沉淀块时应避免过度吹打，以免损伤线粒体膜。
  16. 将 IBM2/组织匀浆液在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。
    注意：为提高第 4 步中分离线粒体蛋白定量的准确性，可在洁净的高强度离心管中重复此步骤，因为残留的 BSA 可能影响总蛋白含量测定。
  17. 弃去上清液，使用剪去尖端的移液枪头，分两次每次加入 25 µl IBM2，轻柔但彻底地重悬沉淀。每次加入 25 µl IBM2 后均需轻轻搅拌混合。将此线粒体储备液置于冰上保存。

3. 全组织裂解液的匀浆处理（时间：约45分钟；可在步骤7期间进行）

  1. 从步骤2.3中置于液氮中的组织取出，室温孵育至完全解冻。
  2. 将组织置于冰上，用尖头剪刀剪碎约30秒。
  3. 向步骤3.2中已装有剪碎组织的1.5 ml带螺口盖的微量离心管中加入两勺100 µl氧化锆珠。使用珠磨组织匀浆器，以4–6（中等设置）的速度进行两到三个5分钟的匀浆循环。
  4. 将步骤3.3中的混合物在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。离心后，用1,000 µl移液器吸头吸取上清液，并转移至一个新的1.5 ml微量离心管中。弃去沉淀，将上清液置于冰上保存。

4. 蛋白质测定（时间：约30分钟）

  1. 根据BCA蛋白检测试剂盒的制造商说明书，测定全组织裂解液（步骤3.4）和线粒体储备液（步骤2.17）的蛋白浓度。

5. 线粒体膜完整性；柠檬酸合酶（CS）活性检测（时间：约15分钟）

  1. 用高纯度水分别对线粒体储备液进行1:20的两种稀释。向其中一份样品中加入0.1%的Triton 100-X，并在低功率条件下（765瓦，振幅2）进行超声处理。另一份稀释液则置于冰上保存。超声处理后，将样品放回冰上。
  2. 使用分光光度法检测，对未超声和已超声的线粒体稀释液均进行柠檬酸合酶活性测定，具体方法如先前所述11,12。
  3. 通过以下公式计算线粒体膜完整性的百分比：
    （未超声CS活性 ÷ 超声后CS活性）× 100


         100- N（上述达到的百分比）

6. 线粒体分离质量；蛋白质印迹（时间：根据实验室方案）

  1. 按照先前所述方法12对全组织裂解液和分离的线粒体进行蛋白质印迹分析。
    注意：使用GAPDH一抗（以5% BSA/TBS-T溶液按1:1,000稀释）和COXIV一抗（以5%脱脂牛奶/TBS-T溶液按1:1,000稀释），随后分别使用山羊抗兔和兔抗二抗（1:10,000稀释）。

7. 呼吸测定实验运行（时间：约90分钟）

  1. 使用基于微孔板的氧气测定法进行所需的呼吸测定实验2 消耗量测量技术，如先前所述（参见相关文章和Rogers） 等8).
  2. 通过将 State 3 除以 State 4o（RCR），或 将 State 3u 除以 State 4o 来确定呼吸控制比（RCR）。可采用点对点轨迹中的中间（平均）值，或选用最高速率（State 3）与最低速率（State 4o）进行计算 在确定 RCR 时。

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结果

柠檬酸合酶活性可作为膜完整性的检测指标，因为柠檬酸合酶位于线粒体内膜上，因此在膜完整的线粒体悬液中不应存在。图1展示了同一来源分离的线粒体样品在未超声处理与超声处理后柠檬酸合酶活性的比较。超声处理线粒体后，柠檬酸合酶活性显著升高，差异具有统计学意义（P <0.01）。重要的是，分离后的线粒体中，92.5 ± 2.0% 保持完整。

图2展示了分离的线粒体以及整体骨骼肌组织裂解液中GAPDH和COXIV的表达情况。GAPDH是一种位于胞质溶胶中的蛋白质，也可在转位后存在于细胞核中；而COXIV是定位于线粒体内膜的蛋白质。在整体组织裂解液中可明显观察到GAPDH和COXIV的表达。在分离的线粒体中，可检测到COXIV的表达，而GAPDH仅有微弱条带。这些结果表明线粒体分离效果良好，分离过程中非线粒体成分的污染较少。

图3 是采用本实验方案分离得到的线粒...

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讨论

本文所述方法详细介绍了从少量（约75–100 mg）小鼠骨骼肌组织中分离线粒体的操作流程。该分离方法可获得功能良好且纯度较高的线粒体（约450 µg），其功能活性已通过O2 消耗速率、RCR 值、最大柠檬酸合酶活性以及免疫印迹分析的蛋白表达。重要的是，通过该方法分离的线粒体可用于基于微孔板的多种呼吸测定实验2 允许高通量的消耗技术。

分离骨骼肌线粒体通常需要采用较为剧烈的方法，以从周围的结缔组织和结构蛋白中释放线粒体7,16。因此，线粒体膜可能受到破坏，从而影响后续呼吸测定实验中线粒体耗氧（O2）活性的准确性。在先前报道的方法7基础上，于组织切除后增加一步使用剃须刀片对组织进行精细剪切的操作，可显著降低机械匀浆时转子的转速（80 rpm 对比 1,600 rpm）。这种更温和的匀浆与重悬技术使得具有完整膜结构的线粒体比例显著提高（92.5±2.0%），该结果通过分离后柠檬酸合酶活性测定评估得出。我们的研究结果与 Asmann et al.17

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披露

George Rogers 是 Seahorse Bioscience 的员工，该公司生产了本实验方案所修改仪器。

致谢

弗林生命科学研究所以及弗吉尼亚理工学院的代谢表型分析核心实验室为本研究提供了支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基本脂肪酸Sigma AldrichA6003N/A
无酸-BSA
Tris/HClPromegaH5123N/A
KCLSigma AldrichP9541N/A
Tris碱PromegaH5135N/A
EDTASigma AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
蔗糖Sigma AldrichS7903N/A
D-甘露醇Sigma Aldrich63559N/A
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红Thermo Scientific25200-056N/A
氯化钠
白色晶体或结晶性粉末
≥99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
十二烷基硫酸钠Sigma AldrichL3771 N/A
脱氧胆酸钠Sigma AldrichD6750 N/A
支化十二氧乙烯基壬基苯基醚Sigma Aldrich238651N/A
单刃剃须刀片Fisher Scientific12-640N/A
Falcon-100 µm 尼龙细胞滤网Fisher Scientific352360N/A
蛋白酶抑制剂（Halt Protease） &和磷酸酶抑制剂混合液Thermo Scientific1861284N/A
1.5 ml 带螺口盖的微量离心管赛默飞世尔科技3474N/A
氧化锆珠Fisher ScientificC9012112N/A
GAPDH 抗体 (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
抗 COXIV 抗体细胞信号传导4844s任何线粒体内膜蛋白均可满足要求
辣根过氧化物酶标记的Donkey抗Rabbit IgG（H+L）杰克逊免疫研究711-035-152N/A
辣根过氧化物酶标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG（H+L）杰克逊免疫研究115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒 赛默飞世尔科技23225N/A
丙酮酸，98%Sigma Aldrich1073604°C 保存 °C，用于呼吸测定前用KOH调节pH至7.4
琥珀酸Sigma AldrichS9512室温保存，使用前用KOH调节pH至7.4
L(-)苹果酸，BioXtra， ≥95%Sigma AldrichM6413室温保存，使用前用 KOH 调节至 7.4 后用于呼吸测定实验
L-谷氨酸Sigma AldrichG1251室温保存，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验
棕榈酰-L-肉碱氯化物Sigma AldrichP1645-20℃保存 °C
寡霉素A， ≥ 95%（HPLC）Sigma Aldrich75351-20℃保存 °C
羰基氰基-4-(三氟甲氧基)Sigma AldrichC29202-8℃保存 °C
苯肼
≥98%（薄层色谱），粉末 [FCCP]
链霉菌属来源的抗霉素ASigma AldrichA8674-20℃保存 °C
腺苷5′二磷酸腺苷单钾盐二水合物 [ADP]Sigma AldrichA5285-20℃保存 °C，使用前用 KOH 调至 7.4
鱼藤酮Sigma AldrichR8875室温保存

参考文献

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  2. Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
  3. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
  4. Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
  5. Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
  6. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
  8. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746(2011).
  9. Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
  10. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
  11. Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
  12. Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
  13. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
  14. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
  15. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
  16. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
  17. Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
  18. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

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